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1、用HPLC测定川芎中阿魏酸含量摘 要：目的 为了确定合适的川芎中阿魏酸的提取方法和阿魏酸的HPLC检测条件。方法 将粉碎的川芎药材用不同的溶剂和方法进行提取，并通过正交试验确定提取川芎中阿魏酸的最佳工艺条件;建立阿魏酸HPLC检测条件，确定流动相；进行方法学考察。结果 正交试验结果表明, 提取川芎中阿魏酸的最佳工艺的因素水平组合是：用乙醇：水=1：3的溶剂、回流1.5h、超声15min；阿魏酸的HPLC检测条件为：波长320nm，流速为1.000ml/min，温度为室温，流动相为甲醇：1%冰醋酸=33：67；阿魏酸在0.010.05mg/ml的浓度范围内线性关系良好；该方法的重复性好、回收率高
2、，样品的在8h内较稳定。结论 该研究为川芎的应用奠定了基础，研究阿魏酸的提取和含量测定对于提高人们的健康水平有着重要意义。关键词：阿魏酸;提取;测定Determination of Ferulic Acid in Chuangxiong by HPLCAbstract：objective The research aimed to sure the favourable method to extract ferulic acid in chuanxiong and fix the condition to detect Ferulic acid by HPLC.method Extract
3、ferulic acid in the crushed chuanxiong by different kind of solvent and different method,and the optimum technique conditions for extracting ferulic acid in chuanxiong was confirmed by orthogonal test.result The result of orthogonal test show that the optimum technique conditions for extracting feru
4、lic acid in chuanxiong is 25% ethanol, Reflux extraction1.5h,ultrasonic extraction 15min.Determination of conditions by HPLC is,the detective wavelength is 320 nm,the folw rate is 1.000ml/min,the column temperature maintained at room temperature,and the mobile phase is a mixture of methanol-1% aceti
5、c acid(33:67).The linearity range of ferulic acid is 0.01 to 0.05mg/ml,and the method have good reproducibility and high recovery rate,the sample is stable in 8h.conclusion The research laid the foundation for the application of ferulic acid.Extracting and determinning ferulic acid is of great signi
6、ficance for improving the health of the people.Key word:ferulic acid;extract;determine目录摘要关键词AbstractKey word绪论1实验部分1一、 实验仪器与材料21.1 实验材料21.2 实验设备器2二、 实验方法2 2.1 高效液相色谱测定阿魏酸的条件确定22.1.1 阿魏酸对照品的制备22.1.2 流动相的确定2 2.2 川芎中阿魏酸的提取22.2.1 川芎中阿魏酸提取溶剂的研究22.2.2 川芎中阿魏酸提取方法的研究22.2.3 川芎中阿魏酸提取的正交试验3 2.3 方法学考察32.3.1 线性
7、试验32.3.2 回收率试验32.3.3 重复性试验32.3.4 样品稳定性试验42.3.5 样品测定4三、实验结果4 3.1 流动相的确定4 3.2 阿魏酸提取溶剂的确定4、 3.2.1 不同溶剂提取阿魏酸的含量4 3.2.2 提取出的阿魏酸的图谱鉴定53.3 川芎中阿魏酸提取方法的确定63.4 提取正交试验结果及数据处理63.5 方法学考察63.5.1 线性试验的结果63.5.2 回收率试验的结果73.5.3 重复性试验的结果73.5.4 样品稳定性试验的结果73.5.5 样品测定的结果8四、结论与讨论8 4.1 结论8 4.2 讨论8致谢8文献检索8绪论川芎具有活血行气，祛风止痛的功能，
8、用于月经不调、经闭痛经。症瘕腹痛、胸胁刺痛、跌扑肿痛、头痛、风湿痹痛。含挥发油、阿魏酸（ferulic acid），以及4-羟基-3-丁基酽内酯（4hydroxy- 3- butylphthalide）、川芎酽内酯（senkyunolide）、藁本内酯（ligustilide)、 川芎嗪（tetramethylpyrazine）、川芎酚（chuanxiongol）、瑟丹酸（sedanic acid）等。其中阿魏酸是很重要的药用成分1。阿魏酸有顺式和反式两种，顺式为黄色油状物，反式为正方形结晶或纤维结晶，熔点为174，溶于热水，乙醇和乙酸乙酯，稍溶于乙醚，难溶于苯和石油醚2。阿魏酸具有抗血小板聚
9、集，抑制血小板5-羟色胺释放，抑制血小板血栓素A2（TXA2）的生成，增强前列腺素活性，镇痛，缓解血管痉挛等作用，是生产用于治疗心脑血管疾病及白细胞减少等症药品的基本原料。如心血康、利脉胶囊、太太口服液等等，它同时在人体中可起到健美和保护皮肤的作用。 阿魏酸的别名有：4-羟基-3-甲氧基肉桂酸,咖啡酸-3-甲醚,3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸。其化学结构式如下： 图1 阿魏酸化学结构式阿魏酸是公认的天然抗氧化剂，也是近年来国际认知的防癌物质，引起世人注目。阿魏酸有很好的抗氧化活性，对过氧化氢、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基都有强烈的清除作用，且能调节生理功能，抑制产生自由基的
10、酶，增加清除自由基酶的活性。与其他酚类物质相比，阿魏酸有两个优点:一是其抗氧化活性强；二是相对稳定，其PH稳定性显著强于绿原酸、咖啡酸和磨石子酸。阿魏酸除广泛用于医药行业外，在食品行业的应用也日益扩大。阿魏酸可作为合成香兰素的前体物质，通过微生物酶将阿魏酸转化成香兰素；由于阿魏酸具有抗氧化活性和抑菌作用，阿魏酸可作为作为食品的防腐保鲜剂，且安全无毒，日本已允许用作食品添加剂；阿魏酸作为交联剂逐渐地应用于制备食品胶和可食性包装膜；此外，它作为抗氧化剂和机能促进物质可应用于运动食品中。由于阿魏酸安全无毒，且已有一些国家批准其作为食品添加剂，相信它在食品工业中的应用会有广阔的前景。阿魏酸存在于多种中
11、草药中 ,如 :阿魏、川芎、当归、升麻等。它本身具有明显的生理活性 ,有抑制胶原和ADP诱导的血小板降集作用 ,对脑血管和血细胞减少有较好的疗效。其含量测定方法的研究报道很多 ,主要有薄层洗脱比色法、毛细管电泳法、光密度计法、薄层显色扫描法、直接扫描法及高效液相色谱法。但阿魏酸不稳定 ,遇光和热迅速分解,阿魏酸对照品迅速分解含量降低 ,不能保持其相对的稳定性 ,在实际测定过程中 ,难以获得准确的测定结果。在测定过程中必须注意溶剂的选择，从文献中得知用HPLC法测定阿魏酸含量简便快速、适用于含阿魏酸的药材及复方制剂的含量测定3。实验部分一、实验仪器与材料1.1 实验材料阿魏酸标准品（含量98%（
12、HPLC），成都曼思特生物科技有限公司）；川芎药材（市售川芎药材，彭州产，批号为08；都江堰产，批号为06、07、08）；无水乙醇（C2H5OH , 分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂）；95%乙醇（C2H5OH , 分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂）；甲醇 (CH3OH，色谱纯GR,成都市科龙化工试剂厂)；冰醋酸（分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂）；水（市售纯净水）1.2 实验设备戴安SUMMIT型高效液相色谱仪，戴安Chromeleon色谱工作站；电子天平（BS110S型 北京赛多利斯天平有限公司）；电热鼓风干燥箱（DB-201XSC型 四川成都电烘箱厂）；离心机；超声波仪二、实验方法2.1
13、 高效液相色谱测定阿魏酸的条件确定2.1.1 阿魏酸对照品的制备用电子天平精密称量10.0mg阿魏酸标准品于10ml容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容为10ml,放于超声波仪中超声20min，待冷却后补液，使其仍为10ml，这样就得到了1.0mg/ml的阿魏酸对照品储备液。然后从中精密量取1.00ml于50ml容量瓶中，加入19.0ml无水乙醇、30.0ml水稀释，超声20min,使其气泡排尽，超声后待冷却，仍然补液至50ml，得到0.02mg/ml的阿魏酸对照品溶液，放冰箱中待使用。2.1.2 流动相的确定用高效液相色谱测定阿魏酸，经查资料得知，阿魏酸的主要吸收波长为320nm，经实验验证确实为
14、320nm，则主要得确定色谱的流动相。由此设定了3组实验，流动相分别为：甲醇：1%冰醋酸=33：67;甲醇：1%冰醋酸=35：65;甲醇：1%冰醋酸=40：60。2.2 川芎中阿魏酸的提取2.2.1 川芎中阿魏酸提取溶剂的研究取适量川芎药材，将其放于烘箱里30分钟将其烘干，待冷却后用粉碎机将其粉碎、过筛，制得实验所需的川芎药材粉。然后分别称取取1g川芎药材粉于烧瓶中，加入不同的溶剂200ml，溶剂有以下几种：95%乙醇：水=1：1;纯水；95%乙醇；95%乙醇：甲酸=95：5。称量总重量并记录，加热沸腾回流1.5h，待时间到，将烧瓶放于天平上，由于乙醇具有挥发性，需对各烧瓶内用甲醇进行补液，然
15、后分别取各续滤液10ml于容量瓶中，待测量。 用HPLC测定之前需对阿魏酸样品放入离心机中离心5min，取上清液于高效液相色谱仪中测量。对照品溶液和样品溶液均进样10l，记录各自的峰面积，根据峰面积与阿魏酸的含量成正比，计算出各种溶剂提取出的阿魏酸的量，并由此计算出提取的阿魏酸在川芎药材中的百分含量。再通过比较提取出的阿魏酸与阿魏酸对照品的图谱，分析提取的阿魏酸的纯度，最终确定提取阿魏酸的溶剂。2.2.2 川芎中阿魏酸提取方法的研究经过查资料得知，对川芎中阿魏酸的提取方法中，回流和超声波的方式提取率比较高，因此，本实验主要是研究这两种方法。设定了如下实验：方法一：称取1g川芎药材粉，加入乙醇：
16、水=1：1的溶剂200ml，放入超声波仪中超声0.5h，补液后过滤，取续滤液10ml于容量瓶中。方法二：称取1g川芎药材粉，加入乙醇：水=1：1的溶剂200ml，回流1.5h，补液后过滤，取续滤液10ml于容量瓶中。方法三：称取1g川芎药材粉，加入乙醇：水=1：1的溶剂150ml，回流1.5h，过滤后将残渣中再加入乙醇：水=1：1的溶剂100ml，回流1.5h，过滤后合并两次滤液并蒸去部分溶剂，然后定容到200ml，取10 ml于容量瓶中。方法四：称取1g川芎药材粉，加入乙醇：水=1：1的溶剂200ml，先回流1.5h，然后再放于超声波仪中超声0.5h, 补液后过滤，取续滤液10ml于容量瓶中
17、。方法五：称取1g川芎药材粉，加入乙醇：水=1：1的溶剂200ml，先放于超声波仪中超声0.5h，然后再回流1.5h，补液后过滤，取续滤液10ml于容量瓶中。将各样品溶液编号并放于离心机中离心5min，然后取上清液用HPLC进行测量，并按照以上方法求得不同方法提取阿魏酸的含量。2.2.3 川芎中阿魏酸提取的正交试验正交试验主要考察对阿魏酸提取率影响较大的3项因素：乙醇浓度（A）、回流时间(B)、超声波时间（C），每个因素各取3个水平，并以提取物中阿魏酸含量为考察指标，按L9(34) 正交试验因素水平表安排正交试验，并进行相关的数据处理。见表1、表2。表2-1 因素水平表水平因素A-溶剂配比B-
18、回流时间/hC-超声时间/min 1乙醇：水=1：11152乙醇：水=1：21.5303乙醇：水=1：3260表2-2 L9(34)正交试验因素水平表实验号A-溶剂配比B-回流时间/hC-超声时间/min1111212231334212522362317313832193322.3 方法学考察2.3.1 线性试验分别取浓度为1.0mg/ml的阿魏酸对照品储备液0.1ml、0.2ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5ml于10ml容量瓶中，加无水乙醇稀释成浓度分别为：0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml的系列溶液，均进样10l，用H
19、PLC测量，记录数据，并计算阿魏酸的回归方程，r值。2.3.2 回收率试验分别取已知含量的同批川芎药材粉0.4g、0.5g、0.6g，分别加入1.2mg、1.5mg、1.8mg阿魏酸对照品，即精密量取阿魏酸对照品储备液1.2ml、1.5ml、1.8ml。用甲醇：水=1：3的溶剂200ml，回流提取1.5h，再超声15min。照前面的方法，补液后过滤，然后取续滤液10ml于容量瓶中，待测量。用HPLC测量后记录阿魏酸的峰面积，并由公式（4-1）、（4-2）、（4-3）计算出平均回收率X和相对标准偏差RSD%。2.3.3 重复性试验精密度为在相同条件下多次测定结果相互吻合的程度，定量测定的精密度以
20、多次测定值的相对标准偏差RSD%表示。同一样品平行测定不少于5次，取置信度95%，进行数据处理，计算平均值X,标准偏差SD和相对标准偏差RSD%。平均值计算公式： （4-1）式中 X 样品分析结果的平均值Xi 各次分析结果的代数和n 分析次数，n=1,2,3,n标准偏差SD计算公式： （4-2）式中 SD标准偏差 Xi单次分析数值X样品分析结果的平均值n分析次数，n=1,2,3,n相对标准偏差RSD%计算公式: （4-3）式中 RSD% 相对标准偏差SD标准偏差X样品分析结果的平均值分别取6份约1g的川芎药材粉，用甲醇：水=1：3的溶剂200ml，回流提取1.5h，再超声15min。照前面的方
21、法，补液后过滤，然后取续滤液10ml于容量瓶中，待测量。各进样0.01ml，用HPLC测量后记录阿魏酸的峰面积，并由公式（4-1）计算平出均值X和公式（4-2）、（4-3）计算出相对标准偏差RSD%。2.3.4 样品稳定性试验取同一份室温下放置的供试品溶液，分别在0h、1h、2h、4h、8h进样10l，记录阿魏酸的峰面积，并由公式（4-1）、（4-2）、（4-3）计算出RSD%。2.3.5 样品测定取都江堰3个不同批次的川芎药材（06、07、08），将其照样粉碎、过筛，分别取其川芎粉1g用甲醇：水=1：3的溶剂200ml，回流提取1.5h，再超声15min。照前面的方法，补液后过滤，然后取续滤
22、液10ml于容量瓶中，待测量。在相同的色谱条件下用HPLC测量，记录阿魏酸的峰面积，计算阿魏酸的含量。三、实验结果 3.1 流动相的确定经实验测定，甲醇：1%冰醋酸=33：67的图谱更佳，因此，用高效液相色谱测定阿魏酸的条件确定为：波长320nm，流速为1.000ml/min，温度为室温，流动相为甲醇：1%冰醋酸=33：67。3.2 阿魏酸提取溶剂的确定3.2.1 不同溶剂提取阿魏酸的含量表3-1 不同溶剂提取阿魏酸95%乙醇：水=1：1纯水95%乙醇95%乙醇：甲酸=95：5对照品的峰面积24.7237对照品浓度(mg/ml)0.02川芎粉的称取量/g1.01501.02301.02581.
23、0254样品的峰面积15.968510.07452.08752.1869阿魏酸含量/%0.2150.1590.0280.030由以上数据可知，95%乙醇：水=1：1这种溶剂提取阿魏酸的提取率最高。3.2.2提取出的阿魏酸的图谱鉴定图3-1 阿魏酸对照品色谱图图3-2 阿魏酸样品色谱图图3-3 阿魏酸样品三点的光谱图经过提取的阿魏酸图谱与阿魏酸对照品的图谱相比较，阿魏酸样品的图谱与对照品的图谱一样，并且阿魏酸样品图谱各点的光谱图都一致，由此可见，用该溶剂提取出的物质的确是阿魏酸，并且阿魏酸较纯。3.3 川芎中阿魏酸提取方法的确定表3-2 不同方法提取阿魏酸 方法一方法二方法三方法四方法五对照品峰
24、面积26.5255对照品浓度(mg/ml)0.02川芎粉的称取量/g1，0297105861.04471.04451.0667样品的峰面积21.220119.403819.833823.387222.7130阿魏酸含量/%0.3110.2800.2830.3380.321由以上表格数据可以看出，方法四的提取率最高，即加入乙醇：水=1：1的溶剂200ml，先回流1.5h，然后再放于超声波仪中超声0.5h。3.4 提取正交试验结果及数据处理表3-3 阿魏酸正交试验设计表实验号A-溶剂配比B-回流时间/hC-超声时间/min阿魏酸含量/%11110.26421220.29031330.2874212
25、0.25652230.28262310.30173130.29383210.30393320.281T10.8410.8130.868T=2.557T20.8390.8750.827X=0.284T30.8770.8690.862t10.28030.27100.2893t20.27970.29170.2757t30.29230.28970.2873R0.01260.02070.0136上表中，T为因素水平和，t为平均因素水平值，R为极差值， x为平均得率，T为得率总和.由表3-3中的数据分析处理结果得知本实验提取阿魏酸的最佳工艺的因素水平组合为A3B2C1。而根据各列因素的极差值的大小，可得出
26、在A（溶剂配比）、B（回流时间）、C（超声时间）三个因素中，对阿魏酸提取影响的大小次序是BCA。 在实践中，往往让最主要的因素取最好水平，而次要因素可根据多快好省的原则选择适当水平。而本试验中“计算”出来的最佳工艺条件是使用乙醇：水=1：3的溶剂、回流1.5h、超声15min,其中回流时间是最主要的因素，而溶剂和超声时间已经满足了多快好省的原则，因此，最佳工艺的因素水平组合的确是A3B2C1,即使用乙醇：水=1：3的溶剂、回流1.5h、超声15min。3.5 方法学考察3.5.1 线性试验的结果所得结果如下表3-4：表3-4 不同浓度测得的峰面积阿魏酸浓度（mg/ml）0.010.020.03
27、0.040.05测得峰面积7.765617.681226.197235.656544.8034图3-1 阿魏酸标准曲线以阿魏酸浓度X（mg/ml）作为横坐标，测得的峰面积A作为纵坐标，绘制标准曲线，计算阿魏酸的回归方程为:A=9.2051X-1.1945,r=0.9998,结果表明阿魏酸在0.010.05mg/ml浓度范围内线性关系良好。3.5.2 回收率试验的结果表3-5 回收率试验试验号药材阿魏酸含量/mg阿魏酸加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%11.27801.22.5004101.999.01.8721.27801.22.462398.731.27801.22.
28、438796.741.59751.53.1045100.551.59751.53.053997.161.59751.53.062597.771.91701.83.698799.081.91701.83.680498.091.91701.83.7429101.4由计算所得，RSD值为1.87表明本方法有良好的回收率。3.5.3 重复性试验的结果表3-6 重复性试验试验号称取量/g样品峰面积对照品浓度（mg/ml）对照品峰面积阿魏酸含量/%平均含量X/%RSD/%11.068715.1152 0.0217.98900.31450.31950.713721.024014.73630.320031.0
29、28114.80420.320241.043814.98750.319351.013514.70100.322561.034714.92070.3206根据计算结果阿魏酸RSD值为0.7137%，表明本法的重复性很好。3.5.4 样品稳定性试验的结果表3-7 样品稳定性试验测定时间0h后1h后2h后4h后8h后测得峰面积14.873514.954914.943614.857714.8639平均峰面积 14.8987RSD/% 0.3131经计算，得出阿魏酸样品溶液在此段时间内测得峰面积的RSD值为0.3131%，表明阿魏酸样品溶液在8h内稳定。3.5.5 样品测定的结果表3-8 样品测定试验试
30、验号称取量/mg测得峰面积对照品浓度(mg/ml)对照品峰面积阿魏酸含量/%11.024621.18370.0217.98900.459721.037821.83730.467931.029820.10930.4342 由实验结果得到，都江堰06、07、08批次的川芎的阿魏酸含量分别为0.4597%、0.4679%、0.4342%。四、结论与讨论4.1 结论用HPLC测定阿魏酸的检测条件为：检测波长为320nm，流速为1.000ml/min，温度为室温，流动相为甲醇：1%冰醋酸=33：67的溶液。通过正交实验，HPLC法测定阿魏酸的得率，得到最佳提取工艺条件为：使用乙醇：水=1：3的溶剂、回流
31、提取1.5h再超声波提取15min。该研究方法简单，所用主要药品乙醇为常规试剂，成本较低，且对环境无污染，儿茶素产品的得率也较高，因此该工艺有较高的参考价值和应用前景。经过方法学的考察，得知阿魏酸在0.010.05mg/ml浓度范围内线性关系良好，本提取方法重复性、稳定性好，回收率高。4.2 讨论实验过程中我们发现阿魏酸标准品很不稳定，样品中的阿魏酸更不稳定，所以阿魏酸标准品应该放在棕色瓶中，并用保鲜膜封好最好是现配现用。同时，对于阿魏酸转化机理还需要进一步研究。由于阿魏酸为有机酸，易解离。在流动相中加入少量冰醋酸可使阿魏酸主峰与前后的杂质峰分离得到改善，峰形更好。该方法快速、灵敏度高，可作为
32、该制剂质量控制的有效方法。致谢本文是在老师精心指导和大力支持下完成的。姚倩老师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神对我实验以及论文写作的指导提供了巨大的帮助。同时，在此次毕业设计过程中我也学到了许多了关于阿魏酸方面的知识，实验技能有了很大的提高。再此我还要感谢许多同学对我的无私帮助，使我得以顺利完成论文。 最后，再次对关心、帮助过我的老师和同学们表示衷心地感谢。参考文献1 北京制药工业研究所.川芎有效成分的研究.药学学报,1979,14(11):6702 许仁溥,徐大申.阿魏酸应用开发J.粮食与油脂,2000(6):7.3 杨广德,梁明金,贺朗冲.川芎中阿魏酸的提取方法研究J.中成药 ,2002,24(6):418-420.
