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1、本科毕业论文（设计）( 2013届 ) 题 目： 细胞色素b蛋白的二级结构的比较分析 学 院： 生命与环境科学学院 专 业： 09级生物技术 学生姓名： 学号： 20909051057 指导教师： 职称（学位）： 合作导师： 职称（学位）： 完成时间： 2013 年 5 月 10 日 成 绩： 综合成绩： 等级： 黄山学院教务处制学位论文原创性声明兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。声明人（签名）：年 月 日目 录摘要英文摘要1引言12材料与方法12.1
2、材料来源12.2实验仪器与试剂22.2.1实验仪器22.2.2实验试剂22.3实验方法22.4实验仪器与试剂22.4.1氨基酸序列分析22.4.2二级结构及跨膜蛋白预测23结果与分析23.1蛋白质序列基本信息23.2多序列同源性排列（blast程序）23.3二级结构预测23.4蛋白质序列基本信息23.4.1-螺旋23.4.2跨膜结构预测24讨论34.1结构预测34.2cyt b的跨膜结构与功能4参考文献10致谢10家鸡细胞色素b蛋白二级结构的比较分析 摘要：本实验利用15个中国家鸡品种的心脏和肝脏组织样品为原料，采用一种改进的碱变性法提取mtDNA基因组（王文等，1993），纯化后进行目的DN
3、A片段的PCR扩增，纯化好的PCR产物经测序反应后直接进行测序。使用软件DNASTAR将其翻译成氨基酸序列，在GenBank中blast并下载其它物种Cyt b氨基酸序列，合并通过肉眼和程序CLUSTAL W进行多重排序，推导的氨基酸序列。使用软件ANTHERPO（1.1.3）和在线服务器PROTPARAM计算序列的氨基酸组成、分子量、理论等电点、消光系数等理化参数。再使用PHD（Profile Network System Heidelberg）预测其二级结构使用软件ROBIMSON、ANTHERPO（1.1.3）、在线服务器SOSUI预测和分析Cyt b蛋白质的跨膜结构。关键词：Cyt b
4、；mtDNA基因组；Cyt b蛋白质；跨膜结构预测Chicken cytochrome b comparative analysis ofprotein secondary structure Abstract: In this experiment using the 15 national varieties of chicken heart and liver tissue samples as raw material, using an improved alkaline denaturation extracted mtDNA genome (Wang, 1993), purifi
5、cation purposes after PCR amplification of DNA fragments, after sequencing reaction, the purification of PCR products with good direct sequencing. DNASTAR software be translated into amino acid sequence, in GenBank, blast and downloading the Cyt b sequence of amino acids in other species, merge sort
6、 by naked eye and program CLUSTAL w multiple derived amino acid sequence. using ANTHERPO software (1.1.3) and online server PROTPARAM computes a sequence of amino acid composition, molecular weight, theoretical PI, extinction coefficient, and other physical and chemical parameters. PHD (Profile Netw
7、ork System Heidelberg) predicted secondary structure using the software ROBIMSON, ANTHERPO (1.1.3), online server Cyt b SOSUI prediction and analysis of transmembrane protein structureKey Words: Cyt b;mtDNA genome; Cyt b protein; transmembrane structure prediction 1 引言细胞色素b是线粒体呼吸链上电子转移的细胞色素之一，是线粒体DN
8、A的13个蛋白质编码基因中被了解得最为清楚的一个，包含8个横跨膜的螺旋，通过膜内或膜间区域相连结(图11)。哺乳动物线粒体细胞色素b是构成线粒体氧化磷酸化系统复合体的蛋白质之一，也是其中唯一由线粒体基因组编码的蛋白质。细胞色素b分子量为42.7KD，长度约为1140bp，编码一条含有约397个氨基酸的多肽链，该基因的mRNA以一个含有4对核苷酸、5-prime的非编码区开头，紧接着是启动子AUG，末端是终止子UAA的U碱基，侧面与tRNAGlu和tRNAThr相接。这些tRNA在转录过程中被解除掉。图 细胞色素b的结构Fig. 2. Structure of the cytochrome b
9、protein.细胞色素b（cytb）是构成线粒体氧化磷酸化系统复合体的蛋白质之一，也是其中唯一由线粒体基因组编码的蛋白质，约68的组成氨基酸为非极性，是一个横贯膜两侧的极端疏水性的蛋白，紧紧地与线粒体内膜相结合，很难将其单独分离。cytb在不同的氧化还原过程中有着不同的特性和功能，主要功能有：1）在呼吸链中传递电子；2）与蛋白、蛋白组成的核心蛋白对复合体中心成员的正确装配和集聚起重要调控作用，目前对于细胞色素b在电子传递链中的复杂功能仍不尽清楚。Cytb蛋白分为三个功能区（functional domains）：膜外区、跨膜区和膜外区。跨膜区核苷酸突变显著低于膜内和膜外区，跨膜区对功能起关键
10、作用的氨基酸占很大比例，哺乳动物在Cytb跨膜区包括105个氨基酸残基，这些残基在多细胞动物中大约29是完全或接近保守的，在大部分多细胞动物中功能基本相同；而位于线粒体膜内表面的膜内区有很少残基只包含大约65个氨基酸残基，其中极性较强而保守性较弱的氨基酸残基占很大比例，这些极性氨基酸残基仍有一定程度的变异，有人推测这些氨基酸执行Q1氧化还原中心的质子输入功能。不过，大多数残基功能仍不清楚，该区的变异位点与其它两个区相比较，属于中等突变率；膜久区由大约209个氨基酸组成，整个区域呈明显疏水性，而且，该区的氨基酸替换多数以疏水性氨基酸为主，如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等；膜外区19的氨基酸残基在大多
11、数细胞中接近保守，维持着该区的结构稳定。2 材料与方法2.1 材料来源本研究采集了15个中国家鸡品种的心脏和肝脏组织样品后，立即用冷藏箱（4）运回实验室在70低温冰箱中保存备用。2.2 实验仪器与试剂2.2.1 实验仪器PCR扩增仪：T Gradient，德国Biometra; 2700型PCR扩增仪（ABI）自动成像仪：BTS-20.M，英国UVItec离心机：台式高速离心机（上海）2.2.2实验试剂Taq DNA聚合酶包括10buffer、4种dNTP混合物(每种浓度为2.5mmol/L)、MgCl2、PCR Fragment Recovery Kit（大连宝生物工程有限公司）2.3 实验
12、方法采用一种改进的碱变性法提取mtDNA基因组（王文等，1993），纯化后进行目的DNA片段的PCR扩增， 使用上海生工生物工程公司生产的UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒进行DNA的回收纯化。 纯化好的PCR产物经测序反应后直接进行测序（上海生工）。2.4 数据处理本研究测定了中国家鸡的Cyt b基因全序列，使用软件DNASTAR将其翻译成氨基酸序列，在GenBank中blast并下载其它物种Cyt b氨基酸序列，合并通过肉眼和程序CLUSTAL W进行多重排序，推导的氨基酸序列。2.4.1 氨基酸序列分析使用软件CLC Protein Workbench 3生成序列的解离曲线；使用软件AN
13、THERPO（1.1.3）和在线服务器PROTPARAM计算序列的氨基酸组成、分子量、理论等电点、消光系数等理化参数。2.4.2二级结构及跨膜蛋白结构预测 PHD（Profile Network System Heidelberg）预测 运用神经网络运算预测二级结构。对三种类型如螺旋（helix)、片层（strand）和环（loop)进行方法，比基于单条序列的预测方法提高了近10个百分点。 PASSM软件分析二级结构元件 PASSM软件中PREDICTION AIDS程度用来测定蛋白质疏水区，酸碱性氨基酸分布；HARDCOPY程序预测二级结构的构成元件分布，包括- 螺旋，- 折叠及转角等；PD
14、VWIN程序列生成- 螺旋的3D效果，由RINDER窗口显示。使用软件ROBIMSON、ANTHERPO（1.1.3）、在线服务器SOSUI预测和分析Cyt b蛋白质的跨膜结构。3 结果与分析3.1蛋白质序列基本信息家鸡Cyt b氨基酸序列如下: MAPNIRKSHPLLKMINNSLIDLPAPSNISAWWNFGSLLAVCLMTQILTGLLLAMHYTADTSLAFSSVAHTCRNVQYGWLIRNLHANGASFFFICIFLHIGRGLYYGSYLYKETWNTGVILLLTLMATAFVGYVLPWGQMSFWGATVITNLFSAIPYIGHTLVEWAWGGFSVDNPTL
15、TRFFALHFLLPFAIAGITIIHLTFLHESGSNNPLGISSDSDKIPFHPYYSFKDILGLTLMLTPFLTLALFSPNLLGDPENFTPANPLVTPPHIKPEWYFLFAYAILRSIPNKLGGVLALAASVLILFLIPFLHKSKQRTMTFRPLSQTLFWLLVANLLILTWIGSQPVEHPFIIIGQMASLSYFTILLILFPTIGTLENKMLNY家鸡cyt b氨基酸有381个残基，分子量为42522.2，理论等电点（Theoretical PI）为8.89，消光系数：1.9101.915。酸性（负电荷Asp + Glu）氨基酸残基数为
16、14，碱性氨基酸（正电荷Arg + Lys）残基数为18；原子组成公式：C2024H3066N475O478S13，不稳定系数：36.30（蛋白质的不稳定系数40时，该蛋白质不稳定），脂肪系数为116.32，疏水性平均值（GRAVY）0.589，说明cyt b可能是跨膜蛋白。各类氨基酸含量如表1所示： 表3-1 CYT B蛋白的氨基酸组成Taber 1 Residue composition of gulls cyt b protein%A: 7.1 %C: 0.8 %D: 1.8 %E: 1.8 %F: 7.6%G: 6.3 %H: 3.4 %I: 8.7 %K: 2.6 %L: 16.6%
17、M: 2.6 %N: 5.3 %P: 6.6 %Q: 1.8 %R: 2.1%S: 7.1 %T: 7.4 %V: 3.7 %W: 2.9 %Y: 3.43.2多序列同源性排列（blast程序） 将家鸡与其他物种的cyt b（Paracoccus、Rbcapsul、Rhdbactersphae和Saccharocere）做多序列比对,结果如图 1 所示。通过和其他一些已知该蛋白三维结构的物种做比对分析可以更多了解家鸡cyt b 的进化关系、序列与功能的关系。从图中可看出该蛋白的保守区大多在残基150到230之间。Error! Reference source not found.Error!
18、Reference source not found.Error! Reference source not found.图 1多序列比对图 (Fig.1 shows the MSA result)用星号（）表示相同的AA，在多序列比对中显示出了CYTB几处共有的保守区（图中绿色方框所示）。asterisk（）indicate the same amino acid in the position. A black square shows a conserve sequence region.3.3 二级结构预测PHD程序预测结果本实验分别用了PHD程序在预测cyt b的二级结构, 基本上每
19、个位置都能预测到。预测结果：- 螺旋(Alpha helix ,H)状态和无规则卷曲(Random coil，C)的残基所占比例和分布区段预测大致相同，而- 折叠(Extended strand,E)预测出现较大差异，其中- 螺旋占72.9%，折叠占2.63%；转角则占24.5%。包括17个残基, 主要包括N端7677、N端286290、N端339340等几个区段的残基。所预测详细信息见图2。蛋白质结构类型的定义： 1）all-alpha：%H45 and %E 5； 2）all-beta：%H45 3）alpha-beta：%H30 and %E20： 4)mixed: all others
20、 根据上述定义，PHD预测螺旋比例大于45%，-折叠比例小于5%，可定义为-蛋白质；而其它两种方法的预测结果则显示cyt b为mixed蛋白质。 (a) (b)图2 PHD法预测蛋白质的二级结构（a为各残基所预测状态的可靠值；b为二级结构可视图）可靠值大于5的预测准确率达82%上Fig.2 Secondary structure of protein predicted by PHD（a is the reliability scores for each predicted state, b is the visual picture of the prediction.3.4 构件分析结果
21、（PASSM软件） PHD程序预测家鸡cytb蛋白质二级结构主要元件为- 螺旋，去除疏水值低与平均值的氨基，大致有13个，其中包括跨膜螺旋，分散至整个蛋白质；转角有10个，包含残基数较少，片断较少，占总构件的24%，螺旋和转角间有零星的- 折叠连接，构成整个蛋白质。3.4.1 - 螺旋 计算残基的疏水值预测- 螺旋及其分布，预测跨度范围为0-7，结果见图3。图3 cyt b蛋白的疏水区预测（moment为程序设定平均值；黄色：疏水残基(疏水值1，绿色：不变残基，蓝色：酸性残基，红色：带负电残基）Fig.3 the hydropathy of gulls cyt b（moment: the me
22、an hydrophobic;）；Yellow hydrophobic (values for hydropathy greater than 1),Green polar, uncharged,Blue positive charge,Red negative charge 从结果可知，家鸡cyt b有十三条- 螺旋，其中九条的疏水值在平均值之上，说明该蛋白质可能有九个跨膜蛋螺旋或膜间螺旋。各条- 螺旋碱基组成见表2，螺旋结构见图4，图5。表3-2 Cyt b 的螺旋组成Table 3-2 The compositionof cyt bhelicalNo.N末端碱基C末端类型133WNFGS
23、LLAVCLMTQILTGLLLAMHYTAD（跨膜）55初级281GASFFFICIFLHIG（跨膜）103初级3114GVILLLTMATAFVGYVLPW（跨膜）136初级4140QMSFWGATVITNLFSAIPYIGHYLVEWAW（跨膜）162初级5230TRFFALHFLLPFALAGITHHLTF（跨膜）135次级6280LGLTLMFTPFLTLALFS（跨膜）102初级7319WYFLFAYAIL341次级8352GVLALAASVLILFLIPFLH（跨膜）374次级9231QTLFWLLVANLLILTVI（跨膜）68次级1065IHGQMASLSYFTILLLILF
24、PTI（跨膜）120次级1121LEN3次级1236MLNY12次级图4 预测的-螺旋轮可视图 图示：黑色字母：疏水残基，蓝色：极性残基，带电残基：蓝色（），粗体红色（）；a图为轮式图示，b图为柱式图示。Fig.4 helical wheel diagram of predicted segments Note: Hydrophobic reside:Black, Polar residue: Blue, charged residue: bold blue(+)、bold red(-) ，picture a is of helix Wheels,picture b is of helical
25、 Cylinder3.4.2 跨膜结构预测 目前大多数跨膜结构预测大都是通过对蛋白一级结构亲/ 疏水特性的计算来判断跨膜结构区域。对家鸡cyt b氨基酸序列进行疏水性分析，发现跨膜区位于N末端第23与第370位氨基酸之间，由9个跨膜螺旋轮组成，包括5个初级螺旋，4个次螺旋（表3-2），其疏水性分布和二级结构示意图见图3，图4，用PSAAM软件中的Ribosome程序构建了跨膜螺旋区的3D原子模型图(图5)。（1） （3） （4） （9）（2） （5） （6） （7） （8） 图 5 跨膜螺旋轮的3D原子模型图 Fig.5 3-D atomic models of the structure o
26、f Transmembrane wheels4 讨论 4.1 结构预测二级结构是氨基酸序列和三维构象之间的桥梁,对二级结构的预测有时能得到许多结构信息。蛋白质结构预测的目的是利用已知的一级序列来构建出蛋白质的立体结构模型，二级结构的预测准确率一般在50%60%，而现在一般认为二级结构的预测准确率达到80%的话，就可以基本准确地预测一个蛋白质分子三维空间结构。在二级结构预测方法中，PHD方法的平均准确率超过了72%，最佳残基预测准确率达90%以上，这为三维结构的预测打下了坚实的基础。4.2 cyt b的跨膜结构与功能Cyt b蛋白是动物线粒体呼吸链cyt bc1复合物组分之一，它是高等一种电子传
27、递蛋白，蛋白质分子由一条多肽链和一个血红素辅基构成，辅基中的铁原子处于卟啉环的中心，蛋白质正是通过铁价态的可逆改变而实现电子在呼吸链中的传递。本研究首先用了生物信息学方法对新基因编码的蛋白的物理化学性质进行了分析，结构表明cyt b有一定疏水性的跨膜蛋白。预测结果显示，cyt b蛋白高级结构是螺旋为主的。这和目前大部分研究结果一致。由于2螺旋及2折叠结构规则, 结构中的化学键键能较高, 主要起稳定作用,转角区域和无规则卷曲结构比较松散, 易于形变, 结构突出, 多位于蛋白质分子表面。Dr. R. Gennis(1990)研究了牛心线粒体的cyt b晶体结构，认为cyt b蛋白由十三个螺旋，2个
28、-折叠，螺旋其中的九个组成cyt b的跨膜结构;2003年修正了这个模型，把九个跨膜螺旋减为八个，并把推断的两性螺旋定位在N未端；Zhaolei Zhang等研究了鸡的cyt bc1复合物，共确定了十二个跨膜螺旋，把其中的八个分配给了cyt b蛋白，现在大部分研究都支持这一模型。蛋白质的氨基酸序列决定其功能也决定其高级结构。Xia D等研究了牛心线粒体cyt bc1复合物，认为血红素被填充在由位于其周围的四个螺旋捆束成的空间内，这种结构可以更好的防止血红素被溶解，也更有利于血红素附近的基团和四个精氨酸形成更强烈的非共价键互作。蛋白质分子构象主要靠非共价键维持, 蛋白质结构的稳定在很大程度上有赖
29、于分子内的疏水作用。线粒体内外膜的结构也是脂质双分子层,本质上是疏水的结构,亲水结构在这样的分子环境中不能稳定存在,因此跨膜蛋白需要一个或多个疏水区域来保证这种结构稳定性。本研究预测cyt b蛋白有八个跨膜螺旋轮，疏水残基指向外侧,亲水残基指向内侧,形成螺旋结构。碱性残基和疏水残基的极端排列是两亲螺旋的主要特征；所有组成螺旋的氨基酸残基变异均发生在膜外区域,都是非极性氨基酸, 其R基团具有疏水性；与此相反，cyt b 膜间氨基酸彼此间的替换均趋于保守，疏水区分布明显，结构较稳定。分析表明，膜间为蛋白的保守区域,对维持其主要功能起着关键作用。 参考文献邱祥聘，陈锷，陈育新等.(1988)中国家禽
30、品种志.上海科技出版社.316王 文，施立明. (1993)一种改进的动物线粒体DNA提取方法.动物学研究，（2）：Adkins,R.M. & R.L.Hongeycutt. (1994) Evolution of the primate cytochrome c oxidase subunit II gene. J.Mol.Evol. 38:215231Akash,H. (1995) Inferring weak selection from patterns of polymorphism and divergence at “silent”sites in Drosophils DNA.
31、 Genetics. 139:10671076Anderson,S., A.T.Banker. & Banrrell,B.G. (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 290(5806):457465Attardi,G., A.Chomyn., J.Montoya. & D.Ojala. (1982) Identification and mapping of human mitochondrial genes. Cytogenet. Cell Genet. 32: 8598Avis
32、e,J.C. (1994) Molecular markers,natural history and evolution. Chapman & Hall,New YorkAvise,J.C. & R.C.Vruenhoed. (1997) Mode of inheritance and variation of mitochondreal DNA in hybredogenetic fishes of genus Pocciliopsis. Mol.Bio.Evol. 4:514525Avise,J.C. et al. (1998) Mitochondreal DNA differentia
33、tion in North Atlantic eels:population genetic consequences of an unusual life history pattern. PNAS USA. 83:43504353Xia D, CA Yu, Kim H, et al.Crystal structure of the cytochrome bc1 complex from bovine heart mitochondria J. Science,1997, 277: 60-6.致谢本实在选题和研究过程中得到陈艳荣老师的极大悉心指导。陈老师多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助
34、我拓宽思路，精心点拨、热忱鼓励。陈老师以其严谨、务实、负责的治学和研究态度，平易近人的工作作风和高度的责任心、敬业精神深刻地感染并影响着我以后的学习和工作,其严谨求实的精神，让我以终生受益无穷。在此，我要向陈老师致敬! 感谢生技一班的同学，感谢你们在我的大学生涯中，给我的支持和鼓励。同时，感谢生命与环境科学学院为我提供了良好的学习和实验研究环境、感谢领导、老师们四年来对我孜孜不倦的关怀和教导，让我得以在这四年中学到很多有用的知识。在此，也感谢黄山学院四年来对我的辛苦培育，让我在大学这四年来学到很多有用东西，储备了宝贵经验，这对我来说是受益终身的宝贵财富。 最后，对于评审老师及专家们在百忙之中抽出时间对我的论文进行评审表示诚挚的谢意.再次谢谢你们!
