黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备.doc

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1、园 艺 学 报 2014，41（6）：12071217 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131126；修回日期：20140428 基金项目：国家自然科学基金项目（31101584）；国家重点基础研究发展计划（973）项目（2009CB19001）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 共同第一作者 * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：jiangwj） 黄瓜

2、动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备 王 燕*，杨学勇*，刘晓林，张晓孟，余宏军，蒋卫杰* （中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要：以黄瓜果实总RNA为模板，通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1和CsKF2的cDNA序列，进行测序，构建T-easy载体。SMART在线预测CsKF1和CsKF2均含有动蛋白（Kinesin）约340个氨基酸残基的马达区保守序列（moter domain）。体外表达蛋白的马达区和非马达区，将带有His标签的CsKF1-N、CsKF2-C、CsKF1-M、CsKF2-M融合蛋白通过E. coli BL21（DE3）表达，摸索不同诱导条

3、件下目的蛋白的表达和纯化。其中His-CsKF1-N、His-CsKF2-C、His-CsKF1-M原核表达蛋白的分子量分别为25、30和40 kD，均以0.1 mmol L-1 IPTG，22 6 h诱导表达效果最好。His-CsKF2-M原核表达蛋白的分子量约38 kD，以18 8 h诱导表达效果最好。融合蛋白His-CsKF1-N和His-CsKF2-C经过亲和纯化后作为抗原，通过5轮免疫注射兔子后，取心脏血作为抗血清，通过AminoLink Plus kit试剂盒亲和纯化得到多克隆抗体anti-CsKF1-N和anti-CsKF2-C。经过Western blot分析表明多克隆抗体具有

4、特异性，可与抗原特异结合。 关键词：黄瓜；果实；动蛋白；肽段；原核表达 中图分类号：S 642.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1207-11 Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Kinesin Peptide Segment from Cucumber WANG Yan*，YANG Xue-yong*，LIU Xiao-lin，ZHANG Xiao-meng，YU Hong-jun，and JIANG Wei-jie* （Institute of Vegetable an

5、d Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China） Abstract：Using the total RNA of cucumber（Cucumis sativus L.）fruits as the template，we cloned two novel Kinesin genes CsKF1 and CsKF2 by RT-PCR. The results from deduced protein sequence analysis indicated that both CsKF1 and Cs

6、KF2 contain moter domain of kinesin family. For protein expression in vitro，the coding regions for KF1-N，KF2-C，KF1-motor and KF2-motor were amplified by PCR and inserted into either the pET28a vector or the pET30a vector and then transformed into E. coli strain BL21（DE3）. SDS-PAGE analysis results s

7、howed that the recombinant plasmid His-CsKF1-N and His-CsKF1-N，His-CsKF2-C，His-CsKF1-M could be expressed a 25 kD，30 kD，40 kD molecule mass 1208 园 艺 学 报 41卷 of fusion protein with 0.1 mmol L-1 isopropyl thiogalactoside for 6 h at 22 . But His-CsKF2-M could be expressed a 38 kD molecule mass of fusio

8、n protein with 0.1 mmol L-1 isopropyl thiogalactoside for 8 h at 18 . The His-tagged fusion proteins were purified using a Ni2+-chelating Sepharose Fast Flow（Amersham Biosciences）column. Polyclonal anti-CsKF1-N，anti-CsKF2-C antibodies were raised in rabbits using the purified His-CsKF1-N and His-CsK

9、F2-C protein as the antigens. Antiserum was then affinity purified using the AminoLink Plus kit with immobilized antigens according to the manufacturers instructions. Western blot analysis show that the polyclonal antibodies could specifically identify the corresponding antigen peptides His-CsKF1-N，

10、His-CsKF2-C. Key words：cucumber；fruit；Kinesin；peptide segment；prokaryotic expression 大多数植物的果实发育分为3个时期：子房发育、细胞分裂、细胞膨大（Gillaspy et al.，1993）。黄瓜（Cucumis sativus L.）果实在前2周生长中经过快速细胞分裂和细胞膨大，质量增加了200多倍（Marcelis & Hofmaneijer，1993；Boonkorkaew et al.，2008；Fu et al.，2008，2010）。黄瓜采收一般在果实发育前期（Ando et al.，2012），

11、因此，早期的细胞快速分裂和膨大对于果实产量至关重要。目前，很多研究都关注于果实成熟期和采后生理，而对果实早期发育机理，尤其果实早期的细胞分裂和膨大机理尚不清楚。 动蛋白是首先在动物神经细胞中发现的一类依赖于微管的马达蛋白（Vale et al.，1985），在细胞有丝分裂、减数分裂、维持细胞形态和细胞器的运输方面都发挥着重要作用（Lee & Liu，2004；Lu et al.，2005；Vanstraelen et al.，2006；Hirokawa et al.，2009；Li et al.，2011；Zhou et al.，2011）。在植物中，已有报道的动蛋白ATK1、ATK5、AtK

12、RP125c、AtPAKRP1 和 AtKINESIN-13A都以依赖于微管的方式参与了细胞分裂和膨大（Lee & Liu，2000；Chen et al.，2002；Ambrose & Cyr，2007； Bannigan et al.，2007）。黄瓜果实发育早期细胞分裂和细胞膨大有其独到的特点，例如其分裂和膨大的速度极快，然而，在黄瓜果实发育早期是否有动蛋白的参与？又是有哪些特异动蛋白参与调控，目前尚未可知。 目前关于动蛋白在果实发育早期细胞快速彭大和快速分裂中的作用尚未见报道，黄瓜是果实早期发育研究的典型物种，所以选择黄瓜作为研究对象。关于黄瓜中动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备

13、的研究目前也未见报道。本试验中找到了两个在黄瓜果实发育早期特异表达的动蛋白，通过对这两个基因进行克隆，经过多次原核表达、纯化以及诱导条件的摸索和优化，得到了高效表达且纯度较高的蛋白特异肽段，最终得到特异识别目的蛋白的抗体，为其在黄瓜果实细胞分裂和细胞膨大过程中的表达、定位和功能研究奠定了重要基础，也为研究黄瓜果实早期发育的分子机理提供了理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所无土栽培温室内进行，黄瓜（Cucumis sativus L.）9930由中国农业科学院蔬菜花卉研究所顾兴芳和黄三文老师提供。2011年1月10日播种于穴盘，1月下旬定植。取健康植

14、株选第5节位以上果实组织液氮速冻，80 保存。 大肠杆菌菌株DE3（BL21）及质粒pET28a(+)和pET30a(+)为本实验室保存。 质粒小量提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自QIAGEN公司。LA Taq聚合酶、T4 DNA连6期 王 燕等：黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备 1209 接酶、dNTPs、DNA Marker、限制性内切酶等均购自TaKaRa公司。pGEM T-easy购自Promega公司。反转录试剂盒购自Fermentas公司。引物合成和测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。 1.2 CsKF1和CsKF2特异肽段的原核表达载体构建 以黄瓜果实总RNA

15、为模板，通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1和CsKF2的cDNA序列，进行测序，构建T-easy载体（Yang et al.，2013）。对这两个动蛋白二级结构进行预测，决定CsKF1原核表达的特异肽段为5端的1 504 bp（KF1-N），马达区为504 1 497 bp（KF1-M）；而CsKF2原核表达的特异肽段为5端的1 591 bp（KF2-C），马达区为315 1 356 bp（KF2-M），分别设计特异引物如下。KF1-N-F：GAATTCATGAATGGAATGGGGAGA；KF1-N-B：GTCGACTCAAGAGT TTGCCCTCTCT；KF1-M-F：GGATC

16、CATGGTTGCCAAGATCAAAG；KF1-M-B：CTCGAGTCAGAC ATTATTTCCTTTTGAAAG；KF2-C-F：GAATCCATGATAAGAGCAAATGCCAAC；KF2-C-B：GTCG ACTCAAAGATCGTCTACGTGGTT；KF2-M-F：GGTACCATGGATCCACCCATCAAG；KF2-M-B：CTCGAGTCATTCATTTATGATTGGCTGA。 以连接有CsKF1全长CDS的T-vector为模板，PCR扩增相应CsKF1 5端序列和马达区序列，并在序列两端分别引入Sal和EcoR酶切位点。PCR回收产物、原核表达载体pET28a(

17、+)经Sal和EcoR双酶切消化后，通过T4 DNA Ligase将KF1-N和KF1-M连接到pET28a(+)上。挑取单菌落进行PCR和双酶切鉴定，并测序确认序列正确。构建好的载体定名为pET28a-CsKF1-N和pET28a-CsKF1-M。 以连接有CsKF2全长CDS的T-vector为模板，PCR扩增相应CsKF2 5端序列和马达区序列，并在序列两端分别引入Kpn和Xho酶切位点。PCR回收产物、原核表达载体pET30a(+)经Kpn和Xho双酶切消化后，通过T4 DNA Ligase将KF2-C和KF2-M连接到pET30a(+)上。挑取单菌落进行PCR和双酶切鉴定，并测序确认

18、序列正确。构建好的载体定名为pET30a-CsKF2-C和pET30a-CsKF2-M。 1.3 序列分析 通过SMART（http：/smart.embl-heidelberg.de/）在线进行基序（motif）和结构域（domain）预测。采用DNAman和Mega5.0软件进行序列比对和进化树构建。 1.4 融合蛋白的诱导表达和SDS-PAGE电泳分析 1.4.1 重组细胞培养 挑取含有重组质粒pET28a-CsKF1-N，pET28a-CsKF1-M，pET30a-CsKF2-C，pET30a-CsKF2-M的大肠杆菌BL21（DE3）单菌落接种到含有50 g mL-1卡那霉素的LB液

19、体培养基中，37 振荡培养过夜。次日将过夜培养物以1100的比例转接到25 mL含50 g mL-1卡那霉素的LB液体培养基中，37 振荡培养约2.5 h至OD600 0.6 0.8时取少量菌液离心后用1 SDS制样（诱导前样），其余菌液加入IPTG至终浓度0.1 mmol L-1。 1.4.2 诱导条件的筛选 以200 r min-1转速继续培养细胞，诱导条件分别设为18 6 h、18 8 h、22 6 h、22 8 h。重复3次。最终获得的目的蛋白产物经过SDS-PAGE检测后，确定最佳诱导条件。 1.4.3 融合蛋白在原核细胞中的诱导表达与纯化 将上述不同诱导条件下得到的菌液，于4 ，5

20、 000 r min-1离心 10 min，弃上清液，收集菌体后用M端裂解缓冲液（0.1 mol L-1 PIPES，pH 6.9；1 mmol L-1 MgCl2，2 mmol L-1 EGTA，10%1210 园 艺 学 报 41卷 甘油）和N/C端裂解缓冲液（25 mmol L-1 Tris-HCl，pH 7.5；150 mmol L-1 NaCl，10%甘油），用移液器轻轻吸打使菌体充分悬起，相同条件下离心，收集菌体沉淀80 冻存或继续进行破碎纯化。加入裂解缓冲液用移液枪将菌体充分悬起并加入PMSF至1 mmol L-1，冰浴下进行超声波破碎细胞，每次破碎20 s，期间停止1 min，

21、10次左右（破碎时间与菌体体积和超声破碎仪功率有关）。超声破碎后取15 L菌液加入5 L 4 SDS样品缓冲液制样（记作：诱导后样），以下制样方法相同。细胞破碎完成后，4 ，12 000 g离心30 min，取上清液（含目标蛋白的细菌可溶性总蛋白提取液）制样（记作：上清样），沉淀用裂解缓冲液重悬后制样（记作：沉淀样），其余上清液上镍柱进行纯化。尽量使样品缓慢通过柱床，将穿柱液重复上样1次，收集穿柱液15 L加入5 L 4 SDS制样（记作：穿柱样）。随后用6 8倍体积的裂解缓冲液洗去大多数的杂蛋白，再用6 8倍体积的含有100 mmol L-1咪唑的清洗缓冲液洗涤柱床1次，取洗涤后流出液体15

22、 L加入5 L 4 SDS制样（记作：洗涤样）。最后用含有300 mmol L-1咪唑的洗脱缓冲液洗脱3次，收集第1、2、3次洗脱液体制样（分别记作：洗脱样1、2、3）。 1.4.4 SDS-PAGE电泳 取20 L已经加入了SDS缓冲液的蛋白样品，沸水中加热3 5 min，12 000 g离心2 min，取上清液点样。12.5% SDS-PAGE电泳检测，比较结果确定适宜诱导条件。 1.5 His-CsKF1-N和His-CsKF2-C大量诱导表达与纯化 适宜诱导条件确定后，用500 mL LB（含50 g mL-1卡那霉素）进行菌液大量诱导His-CsKF1-N，菌体离心后用裂解缓冲液充分

23、悬浮并加入PMSF至1 mmol L-1，TAE至1 mmol L-1，溶菌酶至2 mmol L-1，然后置于冰上超声破碎细胞。细胞破碎完成后4 ，12 000 g离心30 min，取上清液上镍柱进行纯化。镍柱用5 10倍柱体积裂解缓冲液充分平衡后上样，随后用6 8倍体积的裂解缓冲液洗去大多数的杂蛋白，再用6 8倍体积的含有100 mmol L-1咪唑的清洗缓冲液洗涤1次，最后用5 10 mL含有300 mmol L-1咪唑的裂解缓冲液，按每个离心管收集500 L进行分部收集，标记为样品1、样品2、样品7，各取15 L，加入5 L 4 SDS制样检测。His-CsKF2-C是以包涵体形式存在，

24、与His-CsKF1-N纯化方法不同，在细胞破碎离心后，在沉淀中加入裂解缓冲液并加入triton（2%）、PMSF进行充分重悬，离心后留上清液。获得的目的蛋白产物经过SDS-PAGE检测，用Bio-Rad蛋白浓度测定试剂（Bio-Rad protein dye reagent）进行测定后用于活性分析。 1.6 多克隆抗体制备及纯化 将纯化的抗原蛋白送中国科学院遗传研究所实验动物中心制备多克隆抗体，对兔子共免疫5次后取血清测效价，最后取心脏血得到抗血清。多克隆抗体的纯化使用PIERCE公司的Amino Link Plus Immobilization Kit进行，具体纯化步骤参见说明书。 1.7

25、 Western blot分析 进行SDS-PAGE，使用半干式转移电泳槽装置将纯化后的原核表达产物His-CsKF1-N和His-CsKF2-C从SDS-PAGE凝胶电转移到硝酸纤维素膜（NC）上。转移后的NC膜用丽春红染色，做好标记后，在含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（50 mmol L-1 Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol L-1 NaCl，0.05% Tween 20中室温封闭1 h后，TBST洗涤10 min，加入用封闭液制备的纯化抗体anti-CsKF1-N和anti-CsKF2-C（稀释度12 000），4 孵育过夜，用TBST洗膜3次，每次10 min。用碱磷酶

26、标记的羊抗兔抗体为二抗（稀释度15 000）室温孵育1 h，用TBST洗膜3 10 min后，加入10 mL AP反应缓冲液，先加入15 L NBT充分混匀，再加入10 L BCIP，混匀约5 min左右可见条带。根据6期 王 燕等：黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备 1211 条带的位置是否符合预期CsKF1-N和CsKF2-C的大小从而判断抗体的特异性。 2 结果与分析 2.1 黄瓜果实动蛋白基因CsKF1和CsKF2 cDNA全长的获得 以黄瓜果实总RNA反转录cDNA为模板进行PCR扩增。扩增得到CsKF1和CsKF2的基因编码序列（CDS）分别为2 058 bp和3 420

27、 bp。扩增产物经纯化后克隆到pGEM T-easy载体上（Yang et al.，2013）。测序结果经过DNAman进行分析比对，表明所克隆的CsKF1和CsKF2基因编码序列与黄瓜基因组数据库中所登录的Csa7G446860（2 058 bp）和Csa3G062600（3 420 bp）编码序列完全相同。 2.2 序列分析 CsKF1的CDS序列为2 058 bp，推导出氨基酸残基为686 aa，对该蛋白结构域进行分析（图1），动蛋白CsKF1的保守马达区（kinesin motor domain）位于总蛋白168 499 aa区域（灰色区域），ATP结合位点位于马达区内（178 179

28、 aa，261 268 aa）。CsKF2的CDS序列为3 420 bp，推导出氨基酸残基为1 140 aa，CsKF2动蛋白保守马达区位于总蛋白106 442 aa区域（灰色区域），ATP结合位点位于马达区内（115 116 aa，183 190 aa）。 图1 CsKF1和CsKF2的氨基酸序列 Fig. 1 The deduced amino acid sequence of CsKF1 and CsKF2 将拟南芥33个动蛋白氨基酸序列与CsKF1和CsKF2进行同源性分析，从进化树（图2）可以看出，CsKF1与拟南芥动蛋白13家族动蛋白的氨基酸序列同源性达到73%，CsKF2与拟南芥

29、动蛋白12家族动蛋白的氨基酸序列同源性达到92%。 2.3 黄瓜果实动蛋白基因原核表达载体的构建 应用PCR方法扩增获得KF1-N（504 bp），KF1-M（1 002 bp）基因片段（图3，A、B），经过内切酶、连接酶将其插入pET-28a(+)载体中，将pET28a-CsKF1-N，pET28a-CsKF1-M，经EcoR/Sac双酶切鉴定（图3，C）。同样将扩增获得的KF2-C（594 bp），KF2-M（1 044 bp）基因片段（图3，A、B）经过内切酶、连接酶将其插入pET-30a(+)载体中，获得的pET30a-CsKF2-C，pET30a-CsKF2-M进行Kpn/Xho双酶

30、切鉴定（图3，C）。测序证实重组质粒的外源基因插入正确。 2.4 黄瓜动蛋白马达区在原核细胞中的诱导表达与纯化 将重组质粒pET28a-CsKF1-M质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞内。分别在18 6 h、18 8 h、22 6 h、22 8 h几种不同的条件下诱导，与诱导前对照相比，与预测分子量相当的约40 kD的His-CsKF1-M蛋白被大量诱导表达（图4，A），4个条件相比较而言，22 6 h诱导的蛋白浓度明显比其他3个条件下的高，杂带也最少，因此将该条件设为大量诱导的适宜条件。 1212 园 艺 学 报 41卷 图 2 CsKF1和CsKF2与拟南芥动蛋白家族氨基酸序列

31、同源性进化分析 Fig. 2 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences homolog of CsKF1 and CsKF2 with Arabidopsis Kinesin family 图3 特异肽段的PCR（A、B）和双酶切检测（C） Fig. 3 PCR（A，B）and restriction enzyme digestion analysis（C）of pET28a-CsKF1-N/M and pET30a-CsKF2-C/M M：DL2000 DNA marker；1：pET28a-CsKF1-N；

32、2：pET30a-CsKF2-C； 3：pET28a-CsKF1-M；4：pET30a-CsKF2-M. 同样的4种条件下，与诱导前对照相比，与预测分子量相当的约38 kD的His-CsKF2-M蛋白被大量诱导表达（图4，B）。从表达量上看，18 8 h的诱导蛋白的表达量比22 8 h稍少一些，但是从纯度上看18 8 h比22 8 h要好，在浓度满足要求的情况下选择18 8 h进行大量诱导。 6期 王 燕等：黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备 1213 从结果中还可以看出，几个不同条件下His-CsKF2-M的蛋白表达量明显高于His-CsKF1-M，但是相应杂带也比较多。为了提高纯

33、度，可以适当增加洗脱次数，但是随着洗脱次数的增加，蛋白的表达量会有损失，因此在试验中应根据对蛋白浓度和纯度的综合考虑选择合适的洗脱次数。 图4 不同诱导条件下动蛋白马达区His-CsKF1-M（A）和His-CsKF2-M（B）原核表达的SDS-PAGE检测 M：Blue plus protein marker；1：诱导前样；2：诱导后样；3：上清样；4：沉淀样；5：穿柱样； 6：洗涤样；7 9：洗脱1、2、3次得到的纯化蛋白。 Fig. 4 SDS-PAGE detection of prokaryotic expression product of His-CsKF1-M（A）and Hi

34、s-CsKF2-M（B）by different condition M：Marker；1：Total proteins from non-induced E. coli；2：Total proteins from IPTG-induced E. coli； 3：Soluble proteins from IPTG-induced E. coli；4：Insoluble proteins from induced E. coli； 5：Flowing through protein from induced E. coli；6：Washing protein from induced E. c

35、oli； 79：Eluting soluble protein purified for three times through Ni-NTA affinity column. 2.5 黄瓜动蛋白非马达区特异肽段在原核细胞中的诱导表达与纯化 将重组质粒pET28a-CsKF1-N质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞内。在18 6 h、18 8 h、22 6 h、22 8 h条件下诱导，与诱导前对照相比，与预测分子量相当的约25 kD的His-CsKF1-N蛋白被大量诱导表达（图5，A），4个条件相比较而言，22 下2个时间段诱导的蛋白表达量比18 2个时间段诱导的都高，说明22 更适

36、合该蛋白表达，相比8 h，6 h诱导的杂带更少，因此将22 6 h设定为His-CsKF1-N大量诱导的适宜条件。 与诱导前对照相比，与预测分子量相当的约30 kD的His-CsKF2-C蛋白被大量诱导表达（图5，1214 园 艺 学 报 41卷 B），但是在上清液中（泳道3）没有发现明显目的蛋白的表达，该蛋白大部分是以包涵体（泳道4）的形式存在的。22 6 h和22 8 h诱导蛋白的量相比其他两个条件都明显多，纯度相当，从节省时间上考虑选择22 6 h进行大量诱导即可。 图5 不同诱导条件下动蛋白非马达区His-CsKF1-N（A）和His-CsKF2-C（B）原核表达的SDS-PAGE检测

37、 M：Blue plus protein marker；1：诱导前样；2：诱导后样；3：上清样；4：沉淀样；5：穿柱样； 6：洗涤样；7 9：洗脱1、2、3次得到的纯化蛋白。 Fig. 5 SDS-PAGE detection of prokaryotic expression product of His-CsKF1-N（A）and His-CsKF2-C（B）by different condition M：Marker；1：Total proteins from non-induced E. coli；2：Total proteins from IPTG-induced E. coli；

38、 3：Soluble proteins from IPTG-induced E. coli；4：Insoluble proteins from induced E. coli；5：Flowing through protein from induced E. coli；6：Washing protein from induced E. coli；79：Eluting soluble protein purified for three times through Ni-NTA affinity column. 2.6 anti-KF1-N和anti-KF2-C多克隆抗体制备及纯化 His-Cs

39、KF1-N经过镍柱纯化（图6，A）后作为抗原，His-CsKF2-C包涵体经过裂解缓冲液重悬后的样品进行SDS-PAGE后用KCl染色法将目的条带切下液氮研磨成粉末作为抗原（图7，A），制备多克隆抗体，0.5 mg抗原/次，免疫4次加强免疫1次后对兔子进行心脏取血，抗血清进行ELASA测定，anti-KF1-N效价值16 000，anti-KF2-C效价值为4 000。抗体经亲和纯化试剂盒Amino Link Plus 6期 王 燕等：黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备 1215 Immobilization Kit纯化后，进行SDS-PAGE（图6，B；图7，B）。可以看出，ant

40、i-KF1-N在第4 6收集管中纯化的抗体浓度比较高，anti-KF2-C第3 5收集管中抗体浓度较高，因此合并分装后80 保存。另外将电泳可见但浓度比较低的几个收集管也合并保存备用。 图6 anti-CsKF1-N多克隆抗体的亲和纯化 A：His-CsKF1-N抗原纯化（M：Blue plus protein marker；1 8：镍柱洗脱后得到的纯化蛋白）。 B：anti-CsKF1-N多克隆抗体纯化（M：Blue plus protein marker；a：抗原结合柱子前；a：抗原结合柱子后； b：穿柱前抗血清；b：穿柱后抗血清；1 8：亲和柱洗脱抗血清）。 Fig. 6 Affinit

41、y-purification of anti-CsKF1-N polyclonal antibody A：Purification of antigen His-CsKF1-N（M：Marker；18：Eluting soluble protein through Ni-NTA affinity column）. B：Affinity-purification of anti-CsKF1-N polyclonal antibody（M：Marker；a：The antigen before binding to the resin；a：The antigen after binding to

42、the resin；b：The antiserum before binding to the resin； b：The antiserum after binding to the resin；18：Elution fraction from affinity column）. 图7 anti-CsKF2-C多克隆抗体的亲和纯化 A：His-CsKF2-C抗原纯化（M：Blue plus protein marker；1：诱导前样；2：诱导后样；3：上清样；4：沉淀样；5：穿柱样； 6：镍柱洗脱得到的纯化蛋白）。B：anti-CsKF2-C多克隆抗体纯化（M：Blue plus protei

43、n marker； b：亲和柱穿柱前抗血清；b：亲和柱穿柱后抗血清；1 7：亲和柱洗脱抗血清）。 Fig. 7 Affinity-purification of anti-CsKF2-C polyclonal antibody A：Purification of antigen His-CsKF2-C（M：Marker；1：Total proteins from non-induced E. coli；2：Total proteins from IPTG-induced E. coli；3：Soluble proteins from IPTG-induced E. coli；4：Insolub

44、le proteins from induced E. coli； 5：Flowing through protein from induced E. coli；6：Eluting soluble protein through Ni-NTA affinity column）. B：Affinity-purification of anti-CsKF2-C polyclonal antibody（M：Marker；b：The antiserum before binding to the resin. b：The antiserum after binding to the resin； 17：Elution fraction from affinity column）. 2.7 Western blot分析 以表达的融合蛋白His-CsKF1-N和His-CsKF2-C为抗原，以免疫兔子得到的纯化多克隆抗体anti-CsKF1-N，以anti-CsKF2-C为一抗，碱磷酶标记的羊抗兔抗体为二抗，对多克隆抗体的原核表达产物进行Western blot分析，结果显示，未诱导的大肠杆菌泳道上未出现目的条带（图8，A，泳道1），在免疫印迹结果中也没有相应的杂交条带（图8，B，泳道1）。通过SDS-PAGE和Western blot检测结果可以看出His