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1、毕 业 论 文（设计）题 目 茶叶多糖的抗氧化性初步研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010 年 5 月 30日摘 要主要研究龙井陈茶中茶叶多糖抗氧化活性效果。 方法：从绿茶叶中提取纯化了茶叶多糖，研究了不同浓度的茶叶多糖对O2自由基、有机自由基DPPH的清除作用。结果：浓度为115.57mg/L的茶叶多糖的清除率为50%。而茶叶多糖对DPPH自由基的清除能力要略低于10%相同浓度的抗氧化剂BHT溶液。结论：实验仅对茶叶多糖的抗氧化能力进行简单分析，为茶叶多糖的利用提供一点参考意义。关键词：茶叶多糖；超氧自由基；DPPH自由基；抗氧化活性目 录引言.11 材料
2、与方法.21.1材料.21.1.1 实验原材料及试剂.21.1.2 实验仪器与设备.21.2方法.21.2.1实验试剂的配制.21.2.2茶叶多糖的制备.31.3抗氧化活性研究.31.3.1清除O2自由基能力的测定.31.3.2清除DPPH自由基能力的测定.32 结果与分析.42.1茶叶多糖对O2自由基的清除能力.52.2茶叶多糖对DPPH自由基的清除能力.53总结与讨论.6参考文献.8引言O2自由基的化学性质很活跃，能够攻击细胞膜上的脂肪酸，这种物质是毒性很强的一种物质，它会侵害体内的核酸、蛋白质等等而引起一系列的细胞破坏作用，人体内氧自由基积累越多，衰老的进程就越快。DPPH自由基是一种很
3、稳定的氮中心的自由基，该品具有刺激性，吸入、口服或皮肤接触都有害，能够使人体衰老。O2自由基和DPPH自由基常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价。抗氧化剂是阻止氧气不良影响的物质。 它是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。饮食中抗氧化剂长期以来倍受国内外学者关注，这是因为食物中抗氧化剂能够保护食物免受氧化损伤而变质；在人体消化道内具有抗氧化作用，防止消化道发生氧化损伤；吸收后可在机体其他组织器官内发挥作用；来源于食物的某些具有抗氧化作用的提取物可以作为治疗药品。抗氧化剂的作用机理包括鳌合金属离子、清除自由基、淬灭单线态氧、清除氧、抑制氧化酶活性等。多糖作为来自高等植物
4、、动物细胞膜、微生物细胞壁中的天然大分子物质，是构成生命的四大基本物质之一，具有多种生物活性，与维持生物机能密切相关。近20年来，由于生物学、化学等学科的飞速发展，人们对多糖及其复合物的活性作用有了越来越深入的认识，多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血等方面发挥着重要的生物活性作用1。茶叶多糖是从茶叶中提取出来的具有多种生物活性且结构复杂的杂多糖或其复合物。茶叶起源于中国，是一种深受人们喜爱的健康饮品。饮茶有许多益处，这是众所周知的。但饮茶为什么会有许多好处呢？这对一般人来说，是知其然而不知其所以然。茶叶自古就享有养生之誉并且是在中国古代文献中被提及的最早的天然药物之一。茶叶可以
5、作为一些有毒草药的解毒剂, 在药物知识中，其中就有这样的记载：“神农尝百草，日遇七十二毒，得荼而解之”。随着科学的发展，到了19世纪初，茶业的成分才逐渐明确起来。其中的有机化学成分和无机矿物元素含有许多营养成分和药效成分。茶多酚、茶色素、咖啡碱等生理活性成分已研究较多，而茶叶多糖的研究则相对较少。随着对多糖研究的日益深入，特别是发现茶叶中降血糖的有效成分是水溶性组分中的多糖复合物以来，茶叶多糖的研究就引起了人们的极大关注，国内外学者对其进行了较为广泛的研究2。本文研究了已纯化并鉴定其单糖组成的茶叶糖蛋白对O2自由基、DPPH自由基的清除作用的研究，以此来评价该糖蛋白的抗氧化能力，其结果可为该天
6、然抗氧化产品的开发研究提供相关依据。1 材料与方法1.1材料1.1.1实验原材料与试剂龙井陈茶：购于杭州茶叶市场三羟甲基氨基甲烷（Tris），盐酸，甲醇，甲苯， 邻苯三酚， 1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，95%乙醇，蒽酮，浓硫酸，氯化钠均为分析纯；BHT抗氧化剂，抗坏血酸为生物制剂。1.1.2实验仪器与设备仪器及设备型号制造商真空泵SHZ-D上海豫华仪器有限公司；层析柱(2.670cm)上海亚荣生化仪器厂；水浴锅HHS-2浙江海宁新华医疗器械厂电子天平JT余姚市金诺天平仪器有限公司旋转蒸发仪SHZ-D上海豫华仪器有限公司冷冻干燥仪1-2LD德国ALPHA紫外分光光度计UV2000尤尼柯仪
7、器有限公司蠕动泵BT1-100E上海琪特分析仪器有限公司核酸蛋白自动测定仪SHQT-6A上海琪特分析仪器有限公司；1.2方法12.1实验试剂的配制Tris-HCl缓冲溶液（pH为8.2）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9mL 0.1mol/L盐酸混合并稀释至100mL；浓度为2g/L的蒽酮硫酸溶液：将0.2g蒽酮溶于100mL浓硫酸中； 浓度为0.1mol/L的NaCl溶液：将0.585gNaCl溶于5.85L蒸馏水中；DPPH溶液:称取少量DPPH溶于少量的甲苯溶液，用50%乙醇配成0.1g/L溶液。1.2.2茶叶多糖制备茶叶多糖提取准确称取300g茶叶
8、以1：6的蒸馏水，70，40min浸提2次过滤，合并滤液得3L 滤液浓缩至1L加入3倍量的95%乙醇沉淀 粗多糖沉淀物。茶叶多糖的纯化溶解茶叶粗多糖的沉淀物上凝胶色谱柱，以0.1mol/L的NaCl为洗脱液洗脱，洗出液通过自动收集仪以1.5mL/min的流速每6min逐管收集并逐管检测620nm（多糖的蒽酮-硫酸显色）和280nm（蛋白）处的吸收，收集相应组分。样品干燥：洗出液浓缩（90转/分，浓缩至溶液1/3）冷冻干燥（-56）茶叶多糖。1.3抗氧化活性研究3,41.3.1清除O2自由基能力测定5,6茶叶多糖抗氧化溶液配制：在10mL容量瓶中加5ml Tris-HC1缓冲液，然后分别加入10
9、mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L的质量浓度的茶叶多糖溶液。抗坏血酸溶液的配制：在10mL容量瓶中加5ml Tris-HC1缓冲液，然后分别加入10mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、125mg/L的抗坏血酸溶液。在25恒温水浴中放置20min后，加入0.1mL的25预热过的邻苯三酚溶液，迅速混匀，在5min内，每隔30s在420nm处测定溶液的吸光度。计算吸光度随时间的变化率，并与空白液比较，便可得出被测物抑制 O2积累作用的能力。清除率计算式：清除率=(F0- Fx/F0)100式中F0和Fx分别表示空白溶液和
10、被测液的吸光度随时间的变化率。1.3.2清除DPPH自由基能力测定7,8茶叶多糖的DPPH溶液配制：将0.1mL 50.00mg/L的茶叶多糖溶液加入5mLDPPH溶液中，迅速混匀。BHT的DPPH溶液配制：0.1mL50.00mg/L的BHT溶液加入5mLDPPH溶液中，迅速混匀。在10min内，每隔1min在525nm处测定溶液的吸光度，计算吸光度随时间的变化率。抗氧化能力(AA)=(A1/A)*100%式中，A1为样品吸光度随时间的变化率，A为对照组(50mg/LBHT甲醇溶液)吸光度随时间的变化率。A1或A的计算方法：在10min内，以时间为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，得到线性曲线
11、。 2 结果与分析9,102.1茶叶多糖对O2自由基的清除能力按1.3.1所述方法，分别做了不同质量浓度的茶叶多糖和抗坏血酸对O2自由基的清除作用，超氧自由基清除率对比差异见表2.1、图2.1。表2.1 茶叶多糖与抗坏血酸对超氧自由基清除率对比质量浓度mg/L茶叶多糖清除率（%）抗坏血酸清除率（%）104.3315.612510.8139.015021.6378.257532.44117.1910044.67156.2512554.13195.3105010015020025010255075100125质量浓度（mg/L）清除率(%)茶叶多糖抗坏血酸图2.1 茶叶多糖及抗坏血酸对O2自由基清
12、除效率曲线图试验中以对O2自由基有较强清除作用的抗坏血酸作对照，从图1中可以看出，对O2自由基产生50清除效应所需的抗坏血酸的质量浓度为32.04 mg/L，而在同样清除率的情况下，茶叶多糖所需的质量浓度是115.57 mg/L，这说明了该多糖在体外可以清除O2自由基，具有直接清除超氧自由基的抗氧化活性，但其抗氧化能力要比抗坏血酸低得多。2.2 茶叶多糖对DPPH自由基的清除能力众所周知，BHT是食品工业中常用的抗氧化剂，本试验采用BHT对DPPH自由基的清除能力作为茶叶多糖对DPPH自由基的清除能力的对照。按1.3.2所述方法，分别研究了不同质量浓度的茶叶多糖对DPPH自由基的清除作用和50
13、.00mg/L的BHT溶液对DPPH自由基的清除能力，所得结果可见表2.2。表2.2 茶叶多糖对DPPH自由基动态抗氧化能力时间 吸光度BHT甲醇溶液茶多糖溶液50mg/L15.00mg/L30.00mg/L01.0820.8910.710-抗氧化能力/吸光度11.02164.4%/0.85322.9%/0.69620.98075.6%/0.82239.0%/0.68030.96030.0%/0.81625.0%/0.67540.93528.0%/0.80920.0%/0.67050.91322.7%/0.8044.5%/0.66960.86918.2%/0.7964.5%/0.66770.8
14、2315.2%/0.7896.5%/0.66480.77410.2%/0.7796.1%/0.661茶叶多糖的抗氧化能力随时间变化趋势见下图2.200.10.20.30.40.50.60.70.80246810时间（min)清除率15.00mg/L茶多糖多糖溶液30.00mg/L茶多糖溶液从计算结果及图2.2的比较可以清楚地看出，茶叶多糖溶液对DPPH自由基的清除能力略低于相同质量浓度的BHT溶液。同时，茶叶多糖的抗氧化能力随时间的变化有所波动，先呈上升趋势，然后下降，最后趋于平稳。由此可见，茶叶多糖溶液对DPPH自由基有较好的清除能力。3总结与讨论11，12试验以抗坏血酸和茶叶多糖溶液的清除
15、率来进行比较，结果表示，O2自由基产生50清除效应所需的茶叶多糖的质量浓度为115.57 mg/L，这表明茶叶多糖在体外可以清除O2自由基。但其清除率和抗坏血酸相比要低得多。因此，茶叶多糖具有清除O2自由基的能力，但这个清除能力和抗坏血酸相比来说就不是很强。试验通过采用BHT对DPPH自由基的清除能力作为茶叶多糖对DPPH自由基的清除能力的对照试验，结果可以表明，茶叶多糖对DPPH自由基的清除能力比BHT抗氧化剂对DPPH自由基的清除能力要低10%左右。同时通过数据和图谱可以发现茶叶多糖的抗氧化能力随着时间的变化会有所波动。通过文献查找，可以发现不同地区的茶叶种类和茶叶的新，陈程度对茶叶多糖的
16、提取和抗氧化能力都有所不同的。一般情况下，陈茶中的多糖含量比新茶中多，所以陈茶的抗氧化能力比新茶强，因此建议大家饮用陈茶。通过以上两个对照试验我们可以清除了解茶叶多糖的抗氧化能力的强弱与茶叶多糖的浓度有关12。同时说明了茶叶多糖在抗衰老，抗炎症等方面有一定的作用。 参考文献1王健,龚兴国.多糖的抗肿瘤及免疫调节作用研究进展J.中国生化药物杂志,2001,22(1):52-54.2谢明勇,聂少平.茶叶多糖的研究进展J.食品与生物技术学报,2006,25(2).3 聂少平,谢明勇,罗珍.茶叶多糖的抗氧化活性研究J.天然产物研究与开发,2005,17(5):549-552.4 申明月,聂少平,谢明勇
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