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1、乳酸菌的双层包埋Bouble coating of Lactic Acid Bacteria摘要 天然乳酸菌如果未经改造，生命力十分脆弱，是绝对无法耐久存。乳酸菌专业厂商塞尔生技公司投入可观资源，成功开发出一种独特的双层包埋技术：以牛奶蛋白为内层包埋剂 , 一卡拉胶和刺槐豆胶为外层包埋剂 ,对嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌进行双层包埋 。利用这种特殊双层包埋技术，最外层的胶体在强酸性的胃酸中凝结，保护乳酸菌。等到益生菌进入较高酸碱值较高的十二指肠时，胶体自然分解溶化，释放益生菌，而后第二层的蛋白质就会促进乳酸菌与肠壁纤毛附着，同时提供乳酸菌繁殖所需营养。考察双层包埋乳酸菌与未包埋乳酸菌在PH=2.1
2、的胃酸环境 、高温长时环境及室温存放一年等条件中的生物活性； 同时将包埋乳酸菌应用于 酸奶产品 中 ,测定在酸奶储架期间包埋乳酸菌的存活率。结果表明 ,双层包埋乳酸菌在上述试验条件中比未包埋乳酸菌保持更高的存活率 ,显示出用这种双层材料包埋的乳酸菌具有稳定的生物活性 ,耐久存 ,耐胃酸 ,耐高温 ,适于在酸奶中应用 。关键词 乳酸菌 ； 双层包埋技术 ； k-卡拉胶 ；刺槐豆胶 ；生物活性Abstr actNatural lactic acid bacteria (LAB) are fragile microorganisms that could not survive for long d
3、uring storage. Most of them are st ill unstable against food processing conditions. A new technology recently has been developed to resolve this problem. LAB of various species have been produced as double coated dry powder that could serve both as a controlled release formulation, as well as extrao
4、rdinarily stable health food ingredient. L.acidophilus and l.casei were embedded by milk protein firt and then embedded by k-kara gum and locast bean gum.The biological activities of this embedding lactobacillus and not embedding Lactobacillus in stomach-acid circumstances(PH=2.1),in high temperatur
5、e and Long time(60/60min),in storage(one year time) or in yohourt were investigated. The double coated LAB (Named Duolac by the manufacturer) was highly stabl e so that it could be added into acidic drinks such as yogurt, fruit juice etc. without losing viability of the culture. It also has been app
6、lied in milk powder, chocolate, cookie, chewing gum, chewable tablets and ice creams with a shelf-life stability of over 6 months, conferring nutraceutical attributes to conventional food items. Key word lactic acid bacteria； double coating目录1 绪论-2双层包埋乳酸菌的特性 - 3 材料与方法- 3.1 材料与设备- 3.2实验方法- 3.3 结果与讨论-
7、4 双层包埋乳酸菌的应用-5总结-致谢-参考文献-1 前言乳酸菌是自古以来就被人类作为食品微生物利用的一大类菌，广泛应用于发酵乳制品、医药、轻工业和畜牧业等领域。近几年来，透过传播媒体，乳酸菌对人体的益处包括整肠，帮助消化,甚至抑制幽门杆菌，解决胃胀气等功能林林总总，不再赘言。但乳酸菌能对人体健康产生贡献，其前提是乳酸菌必须具有足够的活性，才能对人体产生作用。何谓足够的活性？第一，乳酸菌是活的而且能稳定持久，维持生命力；第二，浓度够高；第三，耐胃酸且能在肠内定殖。乳酸菌根据其包埋技术的演进的四种型态 市面上常见的乳酸菌根据其包埋技术的演进大致可分为四种型态： 第一型：未经包埋处理的乳酸菌；不耐
8、酸、不耐久存。 第二型：巨包埋型乳酸菌；一般是利用硬胶囊包裹，保护乳酸菌通过胃部，但是不易溶解，而且应用范围窄，只能用在胶囊型商品上，同时不耐久存。第三型：微胶囊包埋型乳酸菌；利用凝胶作为包覆材以微包埋方式包覆，耐久存、耐胃酸，但是热稳定性不好，同时凝胶不易溶解，在肠道中需要六小时左右才能溶解释出， 因此一般只用在双歧杆菌的包埋，而且价格十分昂贵。 第四型：双层包埋型乳酸菌 DUOLAC；最新型包埋技术处理，不仅耐久存、耐胃酸，到达肠道后立即释出，任何益生菌都可以利用该技术包埋。而且包覆材内含天然纤维寡糖益生物质，可以帮助乳酸菌在肠道内定殖，同时DUOLAC双层包埋乳酸菌的菌种来源限制严格，必
9、须来自只喝母奶的东方人种婴儿。因此DUOLAC乳酸菌完全符合前述筛选优良乳酸菌的五项原则，而且价格与一般未经包埋的乳酸菌相当，绝对称得上是价廉物美。本实验采用双层包埋方法 ,内层用牛奶蛋白包埋 ,外层用-卡拉胶和刺槐豆胶进行包埋 ,用这种双层材料包埋乳酸菌 ,包埋剂在强酸性的胃酸中凝结 ,保护乳酸菌 ,等到益生菌进入较高 pH值十二指肠时 ,包埋剂自然分解溶化 ,释放益生菌 ,第二层的牛奶蛋白促进乳酸菌与肠壁纤毛附着,其双层包埋剂保护乳酸菌不受胃酸的侵蚀而安全到达小肠、 大肠后定殖产生功效 ,同时牛奶蛋白提供营养于乳酸菌 ,可有效保持乳酸菌在各种条件中的高生物活性。通过双层包埋技术后的乳酸菌具
10、有耐久存性；耐胃酸、胆盐性；热稳定性。2 材料与方法2.1材料与设备乳酸菌种为嗜酸乳杆菌L.acidophilus 和干酪乳杆菌L.casei (粉状) TA培养基(改良番茄汁琼脂培养基 ),乳酸菌落数测定用 纯牛奶为厦 门心鲜乳业有限公司提供 k一卡拉胶 、刺槐豆胶(化学纯)、 显微镜XSP-2XC3A为上海光学仪器六厂生产, 生化培养箱为SPX-2508生化培养箱 ,上海福玛设备有限公司生产； 冷柜为BCD-198冷冻冷藏箱 ,广东顺得中宝冷橱具设备厂产品及手提式高压蒸汽灭菌锅 。2.2 试验方法2乳酸菌活菌数目检测 (cfu/mL )【2】TJA 培养基 (改良番茄汁琼脂培养基 ),采用
11、稀释平板菌落计数法进行菌落计数 。存活率=测 出的菌落数/ 起始菌落数2.2-1 双层包埋乳酸菌DUOLAC的制程：乳酸菌酦酵、收成第一层蛋白质包埋第二层包埋冷冻干燥配 制 0.03k-卡拉 胶 ,0.25刺槐豆胶 ,灭菌后待用； 用无菌水配制乳酸菌菌悬液 。第一层包埋: 将乳酸菌菌悬液加入到牛奶中 ,搅拌均匀 ,将混合液用小号注射器滴人到 PH=4 的酸溶液中，静置 10分钟,收集小颗粒 ,用 PH=4的无菌水洗涤数次 。第二层包埋：0.03k-卡拉胶和0.25 刺槐豆胶充分混合后 ,将上述收集的颗粒投人混合液 ,搅拌均匀 ,用大号注射器滴人到10 冷水中 ,得到小颗粒 ,将小颗粒用10 无
12、菌水洗涤数次 ,滤干后放-18冷柜中冷冻 ,备用 。2.2-2 在4个250ml 沙的锥形瓶 中各放200ml的人工胃酸溶液(PH=2.1) ,标记为A、B、C、D,往A 杯 投 入 双 层 包 埋 的 嗜 酸 乳 杆 菌 L-acidophilus；B杯 双 层 包 埋 的 干 酪 乳 杆 菌 L.casei；C杯D杯 分 别 投 入 未 包 埋 嗜 酸 乳 L.acidophilus、干酪乳杆菌 L.casei。定时测活菌数 ,具体方法: 取一定量溶液进行样品稀释 ,培养基浇注菌液后在 36士1 的培养箱培养 72h士3h ,用稀释平板菌落计数法计算菌落(cfu/ml),算出存活率 。2.
13、2-3 双层包埋的乳酸菌与未包埋的乳酸菌在室温下储存一年 ,定月测定乳酸菌活菌数 。2.2-4 制造恶劣的后加工程序环境 ,进行加热试验 ,定时测定双层包埋乳酸菌经过后加工程序环境后的存活率 。2.2-5 双层包埋乳酸菌稳定性试验 蛋白质与一些特定载体结合后, 溶解度会随水溶液的 pH 质改变, 例如玉米蛋白或奶蛋白在pH 4 时溶解度极低, 会在水中沉淀, 但是 pH 质调整到中性时, 蛋白质却会在水中溶解。DUOLAC 外层的蛋白质及特殊胶体都具有这样的特性, 在酸性环境中不会溶解, 保护乳酸菌安全通过胃部, 不受胃酸及胆盐的破坏 （参见图4和图1）。相对来说, 一般未经包埋处理的乳酸菌不
14、耐酸,在胃里大约30 min后就会死亡。 同时,蛋白质层在小肠中一方面缓冲胆汁及胆酸对菌体未复活前可能的伤害,一方面协助乳酸菌黏附在肠壁绒毛上,同时提供菌体复活时立即可以使用的营养, 借此繁殖增加数量。所以其功能除了控制释放活菌速度外, 还兼顾提供营养, 而且此等包覆层能有效隔离乳酸菌与外界直接接触,对温度以及空气中水分较不敏感,因此活菌浓度可以维持又高又久。DUOLAC的稳定度加速试验结果（图2），在40、湿度70%的加速试验环境中，35d后，DULAC乳酸菌活菌数只降低12个对数，但一般未经包埋的乳酸菌，却至少损失34个对数以上，存活率极低。 图1 DUOLAC耐胆盐度（in 0.5 Ox
15、gall Solution） 图2 DUOLAC活性稳定加速试验（40，温度70）待添加的隐藏文字内容3由于有双层保护，除了上述耐久存、耐酸等特性外，DUOLAC乳酸菌还有优越的热稳定性，详见表1，可以忍受更严苛的后加工程序，应用范围更加广泛，以打锭为例，高温高压(3.1-3.5Kg/cm2)再加工过程中DUOLAC乳酸菌打锭后存活率仍可维持50%以上。因此可说是目前市面上保持益生菌活性效果最好的技术获得多项世界专利。tu2.2-6 双层包埋乳酸菌的热稳定性试验由于有双层保护, 除了上述耐久存、 耐酸等特性外, DUOLAC 乳酸菌还有优越的热稳定性, 以嗜酸乳杆菌和长双岐乳杆菌为例, 在不同
16、温度和时间条件下其菌种的存活率见表 1。表 1 DUOLAC 热稳定度从表 1 可以看出, 双层包埋乳酸菌可以忍受更严苛的后加工程序, 而且仍具有一定的存活率,这让乳酸菌有了更广泛的应用范围。表1 DUOLAC热稳定度温度/时间 嗜酸乳杆菌 存活率 长双岐乳杆菌 存活率（分） ( cfu/g) (%) (cfu/g) (%)50/00 100x10(9) 100 100x10(9) 100 50/20 60x10(9) 60 30x10(9) 30 50/60 57x10(9) 57 15x10(9) 15 60/20 42x10(9) 42 20x10(9) 20 60/60 32x10(9
17、) 32 15x10(9) 15 3 结果与讨论3.1 双层包埋后的乳酸菌溶解度随PH值变化情况用牛奶蛋白/k -卡拉胶和刺槐豆胶作为包埋剂,k-卡拉胶和刺槐豆胶协同作用 ,形成网状结构的弹性凝胶 ,牛奶蛋白与外层胶体接触后 ,与其中的 k-卡拉胶形成触变凝胶 ,蛋白质与外层胶体结合后 ,溶解度随溶液PH而改变 ,在高酸溶液中凝聚沉淀 ,在中性溶液中溶解。试验结果表明 ,双层包埋的乳酸菌在PH=4的酸性溶液中 ,包埋材料产生聚集现象 ,当 PH逐渐上升到7 时 ,牛奶蛋白层逐渐剥离 ,释放出包埋层内的乳酸菌（图3）. 图3 双层包埋乳酸菌随PH值变化产生的凝集及分散现象3.2 胃酸对双层包埋乳
18、酸菌和未包埋乳酸菌活性的影响经双层包埋剂处理的嗜酸乳杆菌、 干酪乳杆菌在胃液达两 2h,仍有 87%和 90%的存活率（图4） ,不受胃酸破坏 ,而未经包埋处理的乳酸菌不耐酸 ,在胃里大约 30min后就死亡殆尽。 图4双层包埋乳酸菌在人工胃液溶液（PH=2.1）中的存活率 3.3 双层包埋乳酸菌的耐久存性从图 5可见,在室温下存放1年,包埋的嗜酸乳杆菌由起始的 21011cfu. mL- 1活菌数降为 2 5 1010cfu mL - 1,存活率保持在 12%以上,包埋的干酪乳杆菌由起始的 2 1010cfu mL - 1活菌数降为 2 109cfu mL - 1,存活率保持在 10%以上,
19、两种包埋乳酸菌活菌数仅降低 1个对数左右;但未包埋嗜酸乳杆菌的活菌数,由起始的 1 1011cfu mL- 1活菌数降为 2 105cfu mL - 1,未包埋的干酪乳杆菌,由起始的 7 . 9 1010cfu mL - 1活菌数降为 2 . 5 104cfu mL - 1,两种未包埋乳酸菌活菌数降低 56个对数左右。实验显示出双层包埋的乳酸菌稳定的生物活性及耐久存特性,未包埋的乳酸菌经长时间存放,存活率极低。 图5 乳酸菌的活性稳定度试验3.4 高温条件对双层包埋乳酸菌活性的影响乳酸菌在细菌中属高温菌 ,其中耐热性较强的嗜热链球菌生长温度为 2053,大于 53则很难存活;嗜酸乳杆菌耐热性差
20、 ,温度高于 50 则不能生长;干酪乳杆菌的生长温度为 2545 3 。这使得益生菌在食品加工中的使用范围受很大的限制 ,而经过双层包埋的乳酸菌克服了这些局限。,（见表1）双层包埋的乳酸菌经过严格的后加工环境 ,如嗜酸乳杆菌在 50、 60min的环境下 ,存活率可维持在 57% ,在60、 60min环境下 ,存活率仍可维持在 32%以上;干酪乳杆菌在 50、 60min环境中,仍有 58%的存活率 ,在 60、 60min环境下 ,存活率有 42%。实验表明 ,双层包埋的乳酸菌耐热性强 ,在高温环境中保持较高的生物活性。3.5 双层包埋乳酸菌在酸奶中的活性酸奶中的发酵菌保加利亚乳杆菌和嗜热
21、链球菌 ,在冷藏前几天 ,活菌数继续增加 ,但随酸奶 pH值下降 ,在冷藏第 9天 , pH降为 3.8时 ,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数呈下降趋势 ,在冷藏第 15天 ,保加利亚乳杆菌由起始 7 . 9 107cfu mL - 1活菌数降为 1 106cfu mL - 1,存活率为 1.3% ,嗜热链球菌由起始 719 107cfu mL - 1活菌数降为 2.5 106cfu mL -1,存活率为 3.2% ;双层包埋嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌在酸奶中呈现凝聚现象 ,充分保护凝聚层内的乳酸菌 ,活性特别稳定 ,（图6）,通过双层包埋的乳酸菌在酸奶中保持着较高的活性 ,在酸奶储存期的第 1
22、5天 ,嗜酸乳杆菌由起始的 4.4 1011cfu mL - 1活菌数降为2.5 1011cfu mL -1,存活率保持在 57% ,干酪乳杆菌由起始的 2.61011cfu mL - 1活菌数降为 1.31011cfumL-1,存活率为 50%。随着酸奶进入人体后 ,由于胃酸作用,双层包埋乳酸菌凝聚现象仍然持续 ,直到小肠后 ,由于pH值上升 ,凝聚现象逐渐消失 ,包埋层随之溶解 ,释放乳酸菌在肠道产生功效。而未包埋的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌无法通过人体胃酸的侵蚀 ,大都无法到达肠道。 图6 双层包埋乳酸菌在酸奶中的活性4 结论包埋乳酸菌在胃液酸度条件下 2h内可以保持稳定的活性 ,包埋嗜
23、酸乳杆菌存活率87，包埋干酪乳酸菌存活率90，而未经包埋的乳酸菌则几乎全部失活。 包埋乳酸菌可以显著地提高 5060 下的抗逆性 ,大大延长了室温下的存放时间。 酸奶中添加包埋乳酸菌 ,也可以明显地延长保存时间 (第 15天 ,菌存活率仍在 50%以上 ) ,显示出包埋后的乳酸菌稳定的生物活性。 应用成本按本实验所使用的纯乳酸菌 ,在 1 t产品中添加 0.05kg乳酸菌 ,完型产品菌种含量即可达到 1 106cfu g- 1浓度 ,而 0105kg乳酸菌成本为 125元。实际操作时 ,考虑在包埋、 添加过程中乳酸菌的损耗 ,实际添加时以 0.05kg t- 1 1152,成本为 187.52
24、50元t- 1。参 考 文 献 1 杨汝德.乳酸菌发酵制品研究的现状与发展 J .广州食品工业科技, 2003, 3 (17) : 79 -80 . 2 牛天贵.食品微生物学实验技术 M .北京:中国农业大学出版社, 2002 . 141 - 143 . 3 贾英民.食品微生物学 M .北京:中国轻工业出版社, 2003 . 177 - 178 . 4 曹军卫.微生物工程 M .北京:科学出版社, 2004 . 261 - 270 . 5 高福成.现代食品高新技术 M .北京:中国轻工业出版社, 2002 . 51 - 91 . 6 姜成林.微生物资源开发利用 M .北京:中国轻工业出版社, 2001 . 54 - 64 . 7 王 璋.食品化学 M .北京:中国轻工业出版社, 2002 . 77 - 79 . 8 林 莹.益生菌保健酸奶发酵剂配制 J .广州食品工业科技, 2003, (增刊 ) : 20 - 21 . 9 李 伟.适用于酶包埋的高分子载体材料 J .功能高分子学报, 2001, (3) : 14 - 15 .
