《选择性阻断cGMP-依赖性蛋白激酶对内毒素孵育的大鼠血管环收缩功能的影响.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《选择性阻断cGMP-依赖性蛋白激酶对内毒素孵育的大鼠血管环收缩功能的影响.doc（10页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、选择性阻断cGMP依赖性蛋白激酶对内毒素孵育的大鼠血管环收缩功能的影响作者简介：郭君 (1983-)，女，硕士生；电子信箱：guojunfay通讯作者：王学敏，电子信箱：wangxm郭君1 王学敏2 支建明3 王海燕2 刘文涛1 薛瑛2（1.苏州大学，苏州 215006；2.上海交通大学附属第六人民医院麻醉科，上海 200233；3.上海交通大学医学院生理教研室，上海 200025）摘要：目的 观察选择性阻断cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）对恢复内毒素（LPS）孵育的大鼠血管环收缩功能的作用。方法 取SD大鼠胸主动脉血管环，随机分为四组：对照组、LPS组、LNAME组以及DT2组。在体外测定L
2、PS孵育2h,3h,4h后各组血管环在苯肾上腺素（PE）作用下收缩的浓度效应曲线、最大收缩（Emax）以及产生最大收缩力的半数有效浓度（EC50）。结果 LPS孵育后各时间点血管环的收缩浓度效应曲线与对照组比较明显降低（P0.05）。LNAME可以提高LPS孵育2h,3h,4h时血管环的收缩功能，Emax,EC50较LPS组差异明显（P0.05）。DT2可以显著提高LPS孵育3h时血管环的收缩功能（P0.01），Emax,EC50有显著差异（P0.01），但在2h,4h时，DT2组与LPS组血管环收缩的浓度效应曲线比较没有统计学差异。结论 选择性阻断cGMP依赖性蛋白激酶可以部分恢复LPS孵育
3、的大鼠胸主动脉血管环的收缩功能。关键词：脓毒症休克；内毒素；血管环；cGMP依赖性蛋白激酶Effect of selective blockade cGMP-dependent protein kinase on the systolic function of rats thoracic aortic rings incubated with endotoxinGUO Jun1, WANG xue-ming2, WANG hai-yan2, LIU wen-tang1, ZHI jian-min3, XUE Ying2(1. Soochow University, Suzhou 215006
4、, China; 2. Department of Anesthesiology, The Sixth Peoples Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200233, China; 3. Department of Physiology, Basic Medical College, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China)Abstract：Objective To observe the role of selective
5、 blockade cGMP-dependent protein kinase on recovery contractility of the rat aortic rings incubated with endotoxin (LPS). Methods The SD rat thoracic aortic rings were randomly divided into four groups as follows: Control group, LPS group, LNAME group and DT2 group. Meanwhile the contractive concent
6、ration response curves of vascular rings, Emax and EC50 of each group of vascular rings to phenylephrine (PE) were measured at different times (2h, 3h, 4h) in vitro. Results The contractive concentration response curve of vascular rings incubated with LPS was significantly lower compared with contro
7、l group (P0.05). LNAME effectively improved the vascular systolic function after incubation with LPS for 2h,3h and 4h; the EC50, Emax were of significant difference compared with LPS group (P0.05). DT2 significantly enhanced the contractile function of vascular rings after incubation with LPS for 3h
8、; EC50, Emax were of significant difference compared with LPS group (P0.01); however, the concentration response curve of DT2 group had no significant difference compared with LPS group at 2h or 4h. Conclusion Selective blockade of cGMP-dependent protein kinase can partially recover systolic functio
9、n of the rat aortic rings being incubated with LPS. Key words: septic shock; endotoxin(LPS); vascular rings; cGMP-dependent protein kinases 脓毒症是创伤、休克、感染和大手术后患者的重要并发症之一，脓毒症休克是ICU患者死亡的主要原因，其死亡率高达30-45%1。脓毒性休克的终末期往往表现为严重的低血压和血管麻痹，最终导致一个或多个器官功能障碍。研究表明，一氧化氮（NO）的过量生成是脓毒性休克血管低反应性的主要原因之一，但NO本身还有抗氧化、抗凋亡等保护作用
10、，所以在脓毒性休克时完全抑制NO的生成虽然可以提高血压，但动物的死亡率却升高2。因此目前的研究主要着眼于选择性阻断NO通路的下游环节。NO进入细胞后可激活cGMP依赖性蛋白激酶（PKG），PKG的磷酸化可通过激活大电导钙离子依赖性钾离子通道，外向电流增加，引起细胞膜超极化；抑制L型Ca2+通道，使钙内流减少；激活钙泵（Ca2+Mg2+ATP酶）的使钙外流增加；促进Na+/Ca2+大量交换等通路引起肌球蛋白轻链去磷酸化，使血管平滑肌舒张3。但是选择性阻断PKG对脓毒症时血管功能的影响以往未有报道。本研究通过体外观察LPS孵育大鼠血管环收缩功能的变化，探讨在脓毒性休克时选择性的阻断PKG以恢复血管
11、反应性的可能性。1材料和方法 1.1 材料1.1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠，体重250-300g，购自中国科学院上海实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK（沪）2004-0005，使用许可证号：SYXK（沪）2007-0007。1.1.2 主要试剂及仪器： 内毒素（LPS，Escherichia coli 055:B50）、乙酰胆碱、N-硝基精氨酸甲酯（L-NAME，一氧化氮合酶抑制剂）、DT-2（特异性PKG抑制剂）均购自美国sigma公司，苯肾上腺素（PE,上海禾丰制药有限公司）， ALC-M离体组织器官实验装置（上海奥尔科特生物科技有限公司）。1.2 离体血管环的制备及分组：将大
12、鼠用0.5%戊巴比妥钠溶液（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，开胸取出胸主动脉，在预冷的PBS中洗净，去除血管周围的结缔组织，将主动脉剪成2-3mm长的血管环。分为4组：对照组，LPS（75ug/ml）组，LNAME（LPS 75ug/ml +L-NAME 0.1mM）组，DT2（LPS 75ug/ml +DT-2 210-3mM）组；分别检测LPS孵育2h,3h,4h后各组血管环对不同浓度PE收缩反应的浓度效应曲线、EC50以及Emax, L-NAME和DT-2在测定反应性前0.5h加入。1.3 血管环收缩功能的测定：将大鼠胸主动脉血管环挂在充有Krebs-Henseleit液(NaCL 11
13、8mmolL，KCL 4.7mmolL，NaHCO3 25mmolL，KH2PO4 1.03mmolL，MgS047H2O 0.45mmolL，葡萄糖11.1mmolL，CaCL2 2.5mmolL，pH7.4)的离体器官灌流槽中，持续充入95的O2和5%的CO2混合气体，每15分钟换液1次，血管环初张力1.5g，37孵育60min。实验前给予60mmol/L KCl诱发血管环收缩，连续两次最大收缩反应之差大于10的血管弃去。以10-6M的PE刺激血管环,达到最大收缩幅度后给予10-5M的乙酰胆碱舒张血管，若舒张幅度80表示血管内皮受损，血管弃去。冲洗至刺激前的状态，稳定30min后加入LPS
14、孵育2h,3h,4h。采用PE累积浓度法绘制血管收缩浓度梯度反应曲线，测定血管在PE刺激下的最大收缩力（Emax），并计算产生最大收缩力的半数有效浓度（EC50）4，它们分别代表了药物作用的效力和潜力。1.4 统计学处理 采用SAS8.0统计软件分析，计量资料以均数标准差(xs)表示，血管环对PE浓度梯度反应曲线的比较采用双因素方差分析，以CONTRAST检验作曲线间两两比较。各时间点Emax,EC50的比较采用单因素方差分析的Tukeys检验。P0.05表示差异有统计学意义。2 结果2.1 不同时间点各组浓度梯度反应曲线的比较与对照组相比，LPS孵育2h后，血管环的收缩功能较对照组明显降低，
15、两反应曲线差异明显（P0.05，图1a）；LNAME组与LPS组相比血管环的收缩功能升高(P0.05)；而DT2组血管环的收缩功能虽然较LPS组有所升高但差异不明显。LPS孵育3h后血管收缩功能与对照组相比显著降低（P0.01，图1b）；LNAME组浓度效应曲线接近对照组，与LPS组差异显著（P0.01）；DT2组血管环的收缩功能增强与LPS组差异明显（P0.01）。第4h时LPS孵育的血管收缩功能显著降低（P0.01，图1c）；LNAME组血管环的收缩功能部分恢复，但与对照组比较差异明显（P0.05）；DT2组与LPS组比较变化不明显。2.2 不同时间点各组血管环EC50和Emax的比较LP
16、S组各时间点的EC50较对照组均明显增加（P0.05），Emax均显著降低（P0.01，表1）。跟LPS组比较2h,4h时LNAME组EC50明显降低（P0.05），3h时降低显著（P0.01）。各时间点Emax较LPS组均显著升高（P 0.01，表1）。 在3h时DT2组EC50较LPS组显著降低（P0.01），Emax显著升高（P 0.01）；而2h,4h时DT2组EC50、Emax与LPS组比较没有统计学差异（表1）。图1.不同时间点大鼠胸主动脉离体血管环对PE反应的浓度效应曲线(xs, n=5)Fig 1. Phenylephrine (PE) log-dose response cu
17、rves in rat thoracic arteries at different time(xs, n=5). A,B,C represents PE log-dose response curves in rat thoracic arteries at 2h、3h、4h respectively. A. B. C.*P0.05, *P0.05 vs control group; #P0.05, #P0.01 vs LPS group 表1.不同时间点各组EC50、Emax的比较(x+s ,n=5)Tab 1. The comparison of EC50、Emax for each g
18、roup at different time (x+s ,n=5)Group2h3h4hEC50(nM)Emax(g)EC50(nM)EmaxEC50(nM)EmaxControl156.0652.1383.150.06107.369.683.160.09146.5431.193.050.08LPS229.27122.39*2.960.13*217.9736.34*2.500.12*273.7317.10*2.010.06*2.630.11*#2.040.09*LNAME98.0727.609#3.230.13#118.4212.29#3.100.14#204.7528.86*#DT2148.
19、30337.473.060.14145.2010.95*#2.830.12*#234.3930.04*P0.05, *P0.01 vs Control group; #P0.05, #P0.01 vs LPS group3讨论大量研究证明5,6，脓毒性休克晚期血管对升压药的反应性下降，导致用药后血压不能有效提升、组织灌注难以改善，造成器官功能进行性恶化。脓毒性休克时血管对升压药反应性下降机制复杂，主要与NO的过量生成，内皮素1(ET-1)的大量表达，肿瘤坏死因子、白介素1、血小板激活因子等的血清水平升高有关，其中iNOS的大量合成造成NO过度释放在血管舒张、血管低反应性中起着至关重要的作用7,
20、8。NO进入细胞后激活可溶性鸟苷酸环化酶，使GTP转变为cGMP9，从而激活PKG。PKG活化后可（1）激活钙离子依赖性钾离子通道，引起细胞膜超极化；（2）抑制L型钙通道，减少钙内流；（3）激活钙泵（Ca2+Mg2+ATP酶），增加钙外流；（4）促进Na+/Ca2+交换；（5）抑制肌浆网IP3受体减少Ca2+的动员；（6）激活肌球蛋白轻链（MLC）磷酸酶，使MLC去磷酸化，最终导致血管平滑肌舒张。以往研究应用一氧化氮合酶抑制剂虽然能够升高血压，但器官损伤反而加重，死亡率升高，这是因为NO还有抑制血小板聚集和粒细胞粘附，抗氧化、凋亡等细胞保护作用2。因此在后期的研究中人们试图抑制NO通路的下游环
21、节，以期恢复血管对升压药的敏感性的同时，保留NO抗氧化应激等的保护作用。有学者用可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝治疗脓毒症休克，可短暂提高脓毒症休克时的血压10。在脓毒症大鼠模型中，应用KATP通道的阻滞剂可以提高血压，但未能改善其死亡率11。总之，有关阻断NO下游通道在脓毒性休克中的保护作用的研究目前还不多，其应用前景有待于进一步探讨。哺乳动物细胞中存在PKG-I和PKG-II两种同功异构体。其中PKG-I主要表达在平滑肌、血小板、心脏、肾血管、肺、小脑和海马中的细胞质内，它在心血管系统中的主要作用是调节血管张力，抑制血小板聚集等，其包括PKG-I,两种亚型。PKG处于NO-sGC-PKG通路
22、的中枢环节，起着重要作用。以往研究证实PKG-I基因敲除大鼠基础血压升高12，阻断PKG-I可以提高正常大鼠的血压13，但PKG在脓毒症休克时对血压的影响未有报道，这可能与以往缺乏强效特异性的PKG-I阻断剂有关。近年来，合成了一种强效的特异性PKG-I阻断剂DT214，为我们深入研究PKG阻断在脓毒症休克中的作用提供了有效的工具。本实验发现，LPS孵育后血管对升压药的反应性下降，而在各时间点LNAME可以提高血管对PE的反应性，尤其在2h,3h时LNME组血管环的反应性接近正常，这说明在脓毒性休克早、中期NO机制起最主要作用；第4h时LNAME组血管的收缩功能较对照组降低明显，这是因为在脓毒
23、性休克晚期还有多种其它机制参与影响血管的收缩功能15,16。DT2组可以有效的提高3h时血管的收缩功能但提升幅度低于LNAME组，这是因为NO可以通过激活可溶性鸟苷酸环化酶引起血管舒张，还可以通过生成过氧亚硝酸阴离子(OONO-)从而激活非PKG依赖性途径，导致血管低反应性15。2h时DT2组反应曲线较LPS组也有升高但差异不明显，这可能早期LPS组血管反应性下降幅度不大有关。而第4h时DT2组与LPS组比较差异不明显，可能与脓毒性休克晚期多种其它机制加入有关。 本实验还存在一些不足，首先，体外实验不能完全反映机体的内部情况。其次，我们使用的是大鼠胸主动脉血管环，而在脓毒性休克时影响血压变化的
24、主要是终末细小血管17。第三，本实验虽然证实了体外阻断PKG可以部分恢复血管的收缩功能，但其对于器官功能的影响还不清楚，这是我们下一步实验的重点。总之，本实验首次证实了选择性阻断PKG可以提高内毒素孵育的大鼠血管环的收缩功能，这为我们防治脓毒性休克提供了一个新的思路，我们将在后期研究中深入探讨该方法对在体实验动物器官功能方面的保护作用。参考文献：1.Opal S.M., Endotoxins and other sepsis triggersJ. Contrib Nephrol, 2010, 167:14-24.2.Petros A, Bennett D, Vallance P. Effect
25、 of nitric oxide synthase inhibitors on hypotension in patients with septic shockJ. Lancet, 1991, 338(8782-8783):1557-8.3.Lucas K.A., Pitari G. M.,Kazerounian S,et al. Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMPJ. Pharmacol Rev, 2000, 52(3):375-414.4.Dixon W.J., Staircase bioassay: the up-and-down
26、 methodJ. Neurosci Biobehav Rev, 1991, 15(1):47-50.5.Garcia Soriano F, Liaudet L, Marton A,et al. Inosine improves gut permeability and vascular reactivity in endotoxic shockJ. Crit Care Med, 2001, 29(4):703-8.6.Mansart A, Bollaert P. E., Giummelly P, et al. Effect of arginine vasopressin on vascula
27、r reactivity and calcium sensitivity after hemorrhagic shock in rats and its relationship to Rho-kinaseJ. J Trauma, 2006, 61(6):1336-42.7.MacMicking J.D., Nathan C, Hom G, et al. Altered responses to bacterial infection and endotoxic shock in mice lacking inducible nitric oxide synthaseJ. Cell, 1995
28、, 81(4):641-50.8.Gunnett C.A., Chu Y, Heistad D. D.,et al. Vascular effects of LPS in mice deficient in expression of the gene for inducible nitric oxide synthaseJ. Am J Physiol, 1998, 275(2 Pt 2): H416-21.9.Katsuki S, Arnold W, Mittal C, et al. Stimulation of guanylate cyclase by sodium nitroprussi
29、de, nitroglycerin and nitric oxide in various tissue preparations and comparison to the effects of sodium azide and hydroxylamineJ. J Cyclic Nucleotide Res, 1977, 3(1):23-35.10.Donati A, Conti G, Loggi S,et al. Does methylene blue administration to septic shock patients affect vascular permeability
30、and blood volumeJ? Crit Care Med, 2002, 30(10):2271-7.11.Landry D.W. and J.A. Oliver, The ATP-sensitive K+ channel mediates hypotension in endotoxemia and hypoxic lactic acidosis in dogJ. J Clin Invest, 1992, 89(6):2071-4.12. Weber S,Bernhard D,Lukowski R,et al. Rescue of cGMP kinase I knockout mice
31、 by smooth muscle specific expression of either isozymeJ. Circ Res,2007,101(11):1096-103.13.Nickl C.K., Raidas S. K., Zhao H, et al. (D)-Amino acid analogues of DT-2 as highly selective and superior inhibitors of cGMP-dependent protein kinase IalphaJ. Biochim Biophys Acta, 2010. 1804(3):524-32.14.Ta
32、ylor M.S.and Okwuchukwuasanya C., Inhibition of cGMP-dependent protein kinase by the cell-permeable peptide DT-2 reveals a novel mechanism of vasoregulationJ. Mol Pharmacol, 2004, 65(5):1111-9.15.Oliveira P.J., Bjork J. A., Santos M. S.,et al. Carvedilol-mediated antioxidant protection against doxor
33、ubicin-induced cardiac mitochondrial toxicityJ. Toxicol Appl Pharmacol, 2004, 200(2):159-68.16. Cauwels A. Nitric oxide in shockJ. Kidney International, 2007, 72:557-565.17. Mizumura K, Gon Y, Kumasawa F,et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1-mediated signaling pathway regulates lipopolysaccharide-induced tissue factor expression in pulmonary microvasculatureJ. Int Immunopharmacol, 2010,10(9):1062-7.
