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1、LOGO,液相色谱基础及方法开发,2013,年,5,月,7,日,主要内容,1.,液相色谱基础知识,2.,液相色谱方法开发过程,3.,液相色谱方法开发实例,一,液相色谱基础知识,?,液相色谱法：利用组分在两相间分配系数不,同而进行分离的技术,?,移动相：携带样品流过整个系统的流体,?,固定相：静止不动的一相,-,色谱柱,色谱分离的机理,色谱是一种分离技术,色谱分离是一个物理过程,流动相（,Mobile Phas,）,固定相（,Stationary Phase,）,样品（溶解于流动相中的溶质）,液相色谱分离机理,高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微,粒作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速
2、,分配和高效分离的柱液体色谱方法。,样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微,小差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两,相之间产生不同的相互作用力，从而导致柱上迁移,速率的微小差异。,随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不,断扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最,终达到组分完全分离,。,液相色谱的基本流程图,流动相,色,谱,柱,A,B,C,进样阀,检测,器,D,E,F,G,泵,泵输,液,进样,分离柱,检测,器,记录,HPLC,的仪器配置,溶剂,数据处理系统,色谱泵,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,液相色谱图相关术语,?,色谱图,(chromatogram),样品流经色谱柱和检测
3、器，所得到的信号,-,时,间曲线，又称色谱流出曲线,(elution,profile),。,?,基线,(base,line),经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测,出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。,?,噪音,(noise),基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检,测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。,?,漂移,(drift),基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温,度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下,来也会产生漂移。,?,峰底基线上峰的起点至终点的距离。,?,峰高,(peak,height,，,h),峰的最高点至峰底
4、的距离。,u,峰面积,(peak,area,，,A),峰与峰底所包围的面积。,液相色谱图相关术语,?,色谱峰,(peak),组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出,曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯,Gauss,曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰,(leading peak),和拖尾峰,(tailing peak),。,?,拖尾因子,(tailing factor,，,T),是用以衡量色谱峰的对称性，也称,为对称因子,(symmetry factor),或不对称因子,(asymmetry factor),。,中国药典规定,T,应为,0.951.05,。,T,0.
5、95,为前延峰，,T,1.05,为拖尾,峰。,?,峰宽,(peak width,，,W),峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点,间的距离。,?,半峰宽,(peak width at half-height,，,Wh/2),峰高一半处的峰宽。,?,标准偏差,(standard deviation,，,),正态分布曲线,x,1,时（拐点）,的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的,0.607,倍处。标准偏差的大小说明,组分在流出色谱柱过程中的分散程度。,小，分散程度小、极点浓度,高、峰形瘦、柱效高；反之，,大，峰形胖、柱效低。,液相色谱图相关参数,?,定性参数（保留值）,?,柱效参数,?,相平衡参数,
6、容量因子,k,选择性因子,a,?,分离参数,定性参数（保留值）,?,死时间,(dead time,，,t,0,),不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通,过色谱柱的时间。,?,死体积,(dead volume,，,V,0,),由进样器进样口到检测器流动池未被固定相,所占据的空间。,V,0,F,t,0,（,F,为流速）,?,保留时间,(retention time,，,t,R,),从进样开始到某个组分在柱后出现浓,度极大值的时间。,?,保留体积,(retention volume,，,V,R,),从进样开始到某组分在柱后出现浓,度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。,V,R,F,t,R,。,
7、?,调整保留时间,(adjusted retention time,，,t,R,),扣除死时间后的保留,时间。在实验条件（温度、固定相等）一定时，,t,R,只决定于组分的性质，,因此，,t,R,（或,t,R,）可用于定性。,t,R,t,R,t,0,?,调整保留体积,(adjusted retention volume,，,V,R,),扣除死体积后的保,留体积。,V,R,V,R,V,0,或,V,R,F,t,R,柱效参数,理论塔板数,(theoretical plate number,，,N),用于定量表示色谱,柱的分离效率（简称柱效）。,N,取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况
8、、柱,长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并,符合正态分布，,N,可近似表示为：,?,t,R,?,t,R,?,?,N,?,5,.,54,?,W,h,?,?,16,?,?,?,2,?,?,W,?,2,2,N,为常量时，,W,随,t,R,成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各,组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。,N,与柱长成正比，柱越长，,N,越大。用,N,表示柱效时应注明柱长，如果,未注明，则表示柱长为,1,米时的理论塔板数。（一般,HPLC,柱的,N,在,1000,以,上。）,相平衡参数,容量因子,(capacity factor,，,
9、k),化合物在两相间达,到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因,子也称质量分配系数。,t,R,?,t,0,溶质在固定相中的量,k,?,或,k,?,t,0,溶质在流动相中的量,性质,-,与柱子的大小及流速无关,只与溶质在固定相和,流动相的分配性、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之,体积比）有关。,范围,0.4,k,20,30,相平衡参数,选择性因子,(selectivity factor,，,),相邻两组分的,分配系数或容量因子之比。,t,R,?,2,?,k,?,2,?,a,t,?,k,?,a,?,?,t,R,?,1,?,k,?,1,?,t,k,R,?,2,?,?,2,?,?,1
10、,?,R,?,1,?,要使两组分得到分离，必须使,1,。,与化合物在固定,相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填,充情况无关。从本质上来说，,的大小表示两组分在两相间,的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。,分离参数,分离度,(resolution,，,R),相邻两峰的保留时间之差,与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程,度。,R,?,t,2,?,t,1,1,?,w,2,?,w,1,?,2,分离参数,基本分离方程影响分离度的因素很多，但可慨刮为三个基本,项,(a),柱效项。,(b),柱选择性项,(,c,),柱容量因子项。即：,从基本分离方程可看出，提高
11、分离度有三种途径：增加塔板数。,方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方,法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当,1,时，,R,0,，,无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变,选择性：,a.,改变流动相的组成及,pH,值；,b.,改变柱温；,c.,改变固定,相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过,调节流动相的组成来实现。,k,2,趋于,0,时，,R,也趋于,0,；,k,2,增大，,R,也增大。,但,k,2,不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离,度和检测灵敏度。一般,k,2,在,110,范围内，最好为,25,。
12、,二,液相色谱方法开发过程,1.,得到样品信息，确定分离目标,2.,确定特定的液相过程、样品预处理等需求,3.,选择合适的检测器,4.,初步分离，优化分离条件,5.,检测特定过程的问题及需求，优化分离条件,检测器种类,紫外吸收,?,紫外吸收检测器,?,光电二极管阵列检测器,荧光,示差折光,化学发光,紫外吸收检测器,紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外,-,可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波,长选择范围宽,(190nm,800nm),。它有两个流通池，一个作,参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，,若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几,乎无吸
13、收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。,当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接,受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与,组分浓度有关。,局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外,吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小,于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至,10%,以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的,截止波长。,色谱基本分类,色谱基本分类：,按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质,可以分为：,1.,分配色谱分配系数,2.,亲和色谱亲和力,3.,吸附色谱吸附力,4.,离子交换色谱离子交换能力,5.,凝胶色谱（体积排阻
14、色谱）分子大小引起的,体积排阻,分配色谱,分配色谱分为：,正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为,非极性。,反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相,为极性，极性高的先被洗脱，用得最多，约占,60-,70%,。,相对应的色谱柱：,反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如,C,18,（,ODS,）、,C,8,、,C,4,、,C,3,、,苯基等。,正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为,-CN,氰,基，,-NH2,氨基等。,分配色谱的分离机理,流动相极性,流动相洗脱强度,反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：,水,甲醇,乙腈,乙醇,丙醇,异丙醇,四氢呋喃,最常用的流动相组成“甲醇,-,水；乙腈,-,水”,正
15、相色谱最常用的流动相及其洗脱强度：,正己烷,乙醚,乙酸乙酯,异丙醇,方法开发的具体步骤,?,?,?,?,?,?,先用一根短的色谱柱,用相对较高的流速,使用尽可能纯度高的标准品,先用高强度的洗脱液,调节,k,值改变保留值,调节,a,值改变选择性,?,通过改变流动相的,pH,值，使样品成中性,?,加入“对离子”，使,样品呈中性,?,调节柱长度改变柱效及分离,速度,请记住,每次改变一个参数,三,液相色谱方法开发实例,?,色谱条件,?,色谱柱：,C,18,，,4.6mm,150mm,?,流动相：乙腈,/,水，乙腈从,100%,逐渐降低（或走梯度）,举例中用不同的溶剂强度，,60/40,、,50/50,
16、、,40/60,，,由强渐弱,?,流速：,1ml/min,?,样品：,对羟基苯甲酸甲酯,(Methyl,Paraben),对羟基苯甲酸丙酯,(Propyl,Paraben),对羟基苯甲酸丁酯,(Butyl,Paraben),?,实例一：,1.,改变容量因子,K,谱图,60/40,50/50,40/60,2.,调节,值改变选择性,同样强度的不同溶剂，改变了流动相,值,THF,/,H,2,O,28,:,72,MeOH,/,H,2,O,58,:,42,CH,3,CN,/,H,2,O,38,:,62,改变色谱柱,液相色谱方法开发实例,?,实例二（正相系统）,?,?,色谱条件：流动相：正己烷（含三氟乙酸
17、,0.1%,）：异丙醇,=70,：,30,22.5,20.0,17.5,15.0,12.5,10.0,7.5,5.0,2.5,0.0,-2.5,-5.0,-7.5,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0,30.0,35.0,40.0,45.0,mi,n,1,9,.,2,1,2,/,7,2,7,0,6,7,峰,#,1,2,3,保留时间,19.212,20.626,37.216,面积,727067,302631,14660969,2,0,.,6,2,6,/,3,0,2,6,3,1,面积,%,4.6338,1.9287,93.4375,分离度,-,0.87,8.033,3,7,.,2,1,6
18、,/,1,4,6,6,0,9,6,9,mV,检测器,A:220nm,理论塔板,#,1774.29,3350.758,3028.137,拖尾因子,-,-,1.275,高度,11026,6203,13988,6,液相色谱方法开发实例,?,?,流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸,=80,：,20,：,0.1,40,30,2,6,.,0,4,0,/,7,9,7,8,9,0,20,10,0,-10,-20,-30,-40,-50,-60,0,10,20,2,8,.,6,5,5,/,2,9,8,2,4,0,30,40,50,60,6,3,.,1,2,0,/,1,4,0,7,1,0,6,5,mV,检测器,A:
19、220nm,50,70,mi,n,峰,#,1,2,3,保留时间,26.04,28.655,63.12,面积,797890,298240,14071065,面积,%,5.2606,1.9663,分离度,-,1.223,理论塔板,拖尾因,#,子,1826.184,3879.604,-,-,1.342,高度,8917,4148,78202,92.773,10.581,2917.955,液相色谱方法开发实例,?,流动相：正己烷：（异丙醇：乙醇,=70,：,30,）三氟乙酸,=72,：,28,：,0.1,2,6,.,6,5,3,/,3,7,0,1,9,4,7,5,mV,检测器,A:220nm,50,1,
20、7,.,6,0,3,/,1,8,1,7,8,8,MPa,A.,压力,(,状态,),30,40,30,20,10,0,-10,1,9,.,0,2,7,/,9,1,6,5,0,20,10,0,10.0,12.5,15.0,17.5,20.0,22.5,25.0,27.5,min,峰,#,1,2,3,保留时间,17.603,19.027,26.653,面积,181788,91650,37019475,面积,%,0.4875,0.2458,99.2668,分离度,-,1.548,6.888,理论塔板,拖尾因子,5009.057,8102.810,6066.492,1.207,1.147,1.233,液
21、相色谱方法开发实例,?,实例三（正相系统）,?,流动相：正己烷：乙醇：三氟乙酸,=98,：,2,：,0.1,8,.,9,7,2,/,1,7,5,7,2,1,8,2,6,.,0,6,1,/,1,4,5,3,5,2,0,mV,检测器,A:238nm,200,MPa,A.,压力,(,状态,),30,20,10,0,100,0,-100,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0,min,?,正己烷：异丙醇：三氟乙酸,=98,：,2,：,0.1,1,3,.,6,4,9,/,1,0,0,6,5,9,1,4,mV,500,检测器,A:238nm,MPa,A.,压力,(,状态,),1,4,.,7,5
22、,9,/,9,5,7,6,1,2,30,20,10,0,250,0,0.0,2.5,5.0,7.5,10.0,12.5,15.0,17.5,20.0,22.5,min,液相色谱方法开发实例,实例四（反相系统）,?,?梯度程序（,A,：甲醇,T,（,min,）,0,4,4.1,21,21.1,30,A%,35%,35%,56%,56%,35%,35%,B,：水）,B%,65%,65%,44%,44%,44%,68%,液相色谱方法开发实例,?,?,流动相,A:,水：磷酸,=1000,：,1,流动相,B,：乙睛：磷酸,=1000,：,1,时间,(min),流动相,A%,流动相,B%,0.01,10 90,3.00,10 90,43.00,50,50,43.10,90,10,50.00,90,10,LOGO,由于本人学术水平有限，,本文可能会有很多缺点和不足，,诚恳诸位领导、同事给予批评和指正。,
