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1、,实验三、叶绿体色素含量的测定（分光光度法 和SPAD叶绿素仪法）高等植物在光合反应中吸收光能的主要色素为叶绿素,其含 有的叶绿素 a和叶绿素 b能将光能转化为化学能,形成有机物质。因此,叶片中叶绿素含量的高低是反映植物叶片光合能力的一个重要指标。一、目的:了解分光光度计和SPAD叶绿素仪的使用方法；理解分光光度计测定叶绿体色素含量的实验原理；掌握计算叶绿体各色素成分含量的方法。,要求：,2、问答题：（1）Lambert-Beer定律又叫什么定律？列出其数学表达式（并说明各符号的代表意义）。Lambert-Beer 定律中的比例系数“K”的物理意义是？Lambert-Beer 定律本身是否有局
2、限性？何谓吸光度的加和性？（2）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰,为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？（3）本实验为什么要用光路宽度为1cm的比色杯？,二、原理,叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b,二者的吸收光谱虽有不同,但又存在着明显的重叠（如图）,在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度,可分别测定在665nm和649nm的光吸收,由于在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert-Beer定律,列出浓度C与光密度D之间的关系式：D665=83.31Ca+18.60Cb.(1)D649=24.54Ca+44.24Cb.
3、(2)从而计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度.,叶绿素a、b的比吸收系数,注：(1)(2)式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。叶绿素a、b的浓度单位为：g/L,解方程式(1)(2)，则得：Ca=13.7 D6655.76D649(3)Cb=25.8 D6497.6 D665.(4)G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649(5),注：此时，Ca、Cb为叶绿素a、b浓度，单位为:mg/L，利用上面（3）（4）(5)式，即可以计算叶绿素a、b含量及总叶绿素的总含量(G总)。,二、材料：大红花老叶和嫩叶 三、实验步骤,1.取新鲜大红花叶片（或其
4、它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2.称取剪碎的新鲜样品0.5g，放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及23ml95乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，暗处静置35min。3.取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5.把叶绿体色素提取液稀释5倍后倒入光径1cm的比色杯内。以95乙醇为参比，在波长665nm、649nm下测定光密度。,四、实验结
5、果计算,将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.7 D6655.76D649(3)Cb=25.8 D6497.6 D665.(4)G总=Ca+Cb=6.10D665+20.04D649(5)分别计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量Chl（mg/g.FW）=,原理：SPAD-502 叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式650nm 和940nm来确定叶片当前叶绿素的相对数量。测量值是通过对在二个不同波长区域，叶片传输光的数量进行计算，在这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区(对光有较高的吸收且不受胡萝卜素影响)和红外线区(对光的吸收极低),开机,调零,测量1,测量2,测量3
6、,求平均值,一 分光光度计的工作原理：,分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。,二 分光光度计的基本常识：,1、紫外光分光光度计，其使用波长在190400nm,可见光分光光度计，其使用波长在400800nm。2 消光系数：是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用K表示。它取决于溶质性质、入射光波长和温度。消光度（也叫光密度OD，或吸光值A）：表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也用E表示。E值愈大，溶液对光吸收的
7、程度愈大。透光率（用T表示）：是透射光强度（透过比色皿）与入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（用T=It/I0表示）。,三、分光光度计的基本维护及使用注意事项：,1 分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。2 分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。3 仪器连续使用时间不应超过2小时，每次使用需歇半小时以上才能再用。用完仪器后，务必关避电源开关，拔下插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。4 千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。5 盛待液时，必须达到比色杯的2/3左右，不宜过
8、多。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。6 每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。7 测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大峰的波长作为测定的波长。一般所制成的溶液应尽量使光密值在0.10.7的范围内测定。,VIS-723N可见分光光度计,比色皿校正和多波长测定操作步骤：1.在主菜单下选择“2光度测量”,主菜单1波长扫描2光度测量3定量分析4时间扫描5实时测量6系统设置,3.比色皿配对完成后，按“RETURN”键退回光度测量参数设置界面。4.按F2开始测量。可按照屏幕上的提示进行测量操作，当有多个样品需要测量时，可测完一个后再按“F2”测下一个。注意样品
9、的编号N值必须和比色皿的编号一致。,2.按“F1”进行比色皿的校正，输入除参比杯外的比色杯个数后按“ENTER”键，再按“F2”，根据仪器提示进行操作即可。,AM-300手持式叶面积仪测定叶面积,原理：内置固体标准光源的CCD扫描系统,开机,按住电源开关1秒,选择显示方向,放入材料（不能直接接触探头）,按住探头上红色button,直至发出两种连续蜂鸣,屏幕提示“measure”可开始测量,探头从材料上方匀速滑过，等屏幕显示出完整叶片形状后再次按红色button结束测量,植物叶面积的测定（画纸称重法）将所测叶片放在厚度均匀的称量纸上，用铅笔将叶形画好，剪下所画的纸叶，在电子天平上称重，记为W1；
10、另取10*10cm2的纸片，称重记为W2；则所测叶片面积X可按下面公式计算出。X（cm2）W1/W2100,CB-1102便携式光合蒸腾测定仪,特点：,非破坏性测量，即不离体测量 具有开路和闭路测量两种光合测量方式 可以手动或自动测量，可编程自动定时测量 全部测量参数和计算结果可以存贮，并通过 RS232接口传输到计算机,原理：,利用红外CO2分析器和湿度传感器对参考气和流经叶室后的测量气进行测量，根据CO2浓度差和湿度差以及流量等参数，利用气体通量公式，分别计算净光合（或呼吸）速率和蒸腾速率。,仪器中使用的参数：,a温度CO2i室内CO2浓度CO2o室外CO2浓度RHi室内相对含水量RHo室外相对含水量PA光合有效辐照度净光合速率蒸腾速率CO2int 胞间CO2浓度,
