工业微生物产生菌的分离筛选课件.ppt

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1、第五章 工业微生物产生菌的分离筛选,第一节 含微生物样品的采集 第二节 含微生物样品的富集 第三节 微生物的分离 第四节 野生型菌株的筛选和目的产物的鉴定,菌株分离（seperation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并迸行代谢产物鉴别。,菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：（1）向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。国内外著名的菌种保藏机构有：中国微生

2、物菌种保藏管理委员会（CCCCM），美国典型菌种保藏中心（ATTC），英国国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。（3）从一些发酵制品中分离回的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒糟中分离淀粉酶或糖化酶的产生曲等。该类发酵制品经过长期的人工选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。,新的微生物菌种需要从自然生态环境中混杂的微生物群中挑选出来，因此必须要有快速而准确的新种分离和筛选方法。分离微生物新种的具体过程大体可分为:采样、增殖、分离纯化、性能测定 产物鉴别和生化鉴定几个步骤。,补

3、充:新菌种的分离筛选,菌种的来源:1、根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；2、从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,新菌种的分离思路：,新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。,定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进

4、行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。,新菌种分离与筛选的步骤,增殖培养,为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。,培养分离,尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这步，增殖

5、培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,筛 选,这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。,毒性试验,自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。,第一节 含微生物样品的采集,采样应根据筛选的目的、微生物分布情况、菌种的主要特征及其生态关系等因素，确定具体的时间、环境

6、和目标物。土壤是微生物的大本营，菜园和耕作层土壤是有机质较多的土层，常以细菌和放线菌为主；果园树根土层中，酵母菌含量较高；动植物残体及霉腐土层中，分布着较多的霉菌。此外，豆科植物根系土中，往往存在根瘤菌；河流湖泊的淤泥中能分离到产甲烷菌；油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物等。季节、表面的植被、温湿、通风情况、养分、水分、酸碱度和光照等都会影响土壤中的微生物分布，故在采土样时应予以重视。,一、从土壤中采样 1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）放线菌（107）霉菌（106）酵母菌（105）藻类（104）原生动物（103）,从自然界筛选,（一）根据土壤特点 1土壤有机质含量和

7、通气状况 采土样最好的上层是5-25cm、一般每克上中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。总的来说酵母菌分布土层最浅，约5-10 cm；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。2土壤的酸碱度和植被状况 3地理条件：南方、北方 4季节条件：以温度适中，雨量不多的秋初为好。710 月,（二）采样方法 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样1025 g，装入事先准准备好的塑料袋内扎好、北方土壤干燥在10-30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离。以免微生物死亡。但有时样品较多，或到外地取样

8、，路途遥远，难以做到及时分离，则可采先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。到一处将取好的土样混匀，取3-4g撒到试管斜面上这样可避免菌株因不能及时分离而死亡。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。,二、根据微生物生理特点取样 1根据微生物的营养类型 每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的效果。不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生长。2根据微生物的生理特性,三、特殊环境下采样1局部

9、环境条件的影响2极端环境条件的影响,第二节 含微生物样品的富集培养,一、控制培养基的营养成分,1、根据微生物的营养特点 例如:酵母富集培养基 葡萄糖 5%尿素 0.1%(NH4)SO4 0.1%KH2PO4 0.25%Na2HPO4 0.05%MgSO4 7H2O 0.1%FeSO4 7H2O 0.01%酵母膏 0.05%孟加拉红 1/3万 PH=4.52、根据微生物的不同种类来选择富集培养基例如:丝状真菌的 增殖 可选用 淀粉琼脂培养基 但是要注意酵母浸膏的加量,过多会刺激菌丝的生长,而不利于孢子的产生.3、根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点来分离,鉴别培养基(different

10、ial medium),选择培养基(selective medium),用于鉴别不同类型微生物的培养基特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征性变化，根据这种特征性变化,可将该种微生物与其他微生物区分开来。,用于将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。,鉴别培养基,选择培养基,选择培养基,第二节 含微生物样品的富集培养,二、控制培养条件 从土壤中分离芽孢杆菌时，由于芽孢具有耐高温特性100很难杀死，要在121才能彻底死亡

11、、可先将土样加热到80或在50%乙醇溶液中浸泡1h，杀死不产芽孢的菌种后再进行分离。在富集培养基中加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性菌无抑制作用。分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原剂，它能使培养基氧化还原电势下降，造成缺氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。筛选霉菌时，可在培养基中加人四环素等抗生素抑制细菌；分离放线菌时，在样品悬浮液申加人10滴10的酚或加青霉素（抑制G+菌）、链霉素（抑制G-菌）各3050Uml，以及丙酸钠10ugml（抑制菌类）抑制霉菌和细菌的生长、在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到100保温1h，可简少细菌和链霉

12、菌的数量。分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度度甘蔗溶液中处理一段时间。杀死非目的的微生物后再迸行分离。对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养以提高分离工作效率,第三节 微生物的分离,一、好气及兼性微生物的分离“菌落纯”:如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等 组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。另一类是较细单细胞或单孢子分离方法，可达到“菌株纯”和“细胞纯”的水平。这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操纵装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离、,第三节 微生物的分离,（一）稀释涂布法（二）划线分离法（三）利用平皿的生

13、化反应进行分离1透明圈法2变色圈法 3生长圈法4抑菌圈法,纸片培养显色法,透明圈法,琼脂块培养法,一、好气及兼性微生物的分离方法,（四）组织分离法1对一般有病组织的分离方法2食用菌孢子分离法（1）组织分离法（2）单孢子分离法：单孢子稀释,一、好气及兼性微生物的分离方法,（五）单细胞或单孢子分离法1、小滴分离纯化方法2、滤纸进法,二、通过控制营养和培养条件进行分离,1.培养基的营养成分 2.培养基的pH3.排除不需要的菌类（1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50Uml制霉菌素；可以抑制霉菌和酵母菌的生长。（2）分离放线菌时，在样品中加入 0.05 十二烷基磺酸钠（SDS）不仅可以抑制细菌的主长

14、；还能激活放线菌孢子的菌发。加人氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+卜青霉素（0.5mg/L）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。（3）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各30Uml，可以抑制细菌和放线菌生长。（4）分离根霉和毛霉时由于这些微生物的菌丝易蔓延成片，难以得到纯化的菌落通常在培养基中添加0.1%去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。4控制培养温度,三、厌氧菌的分离,（一）加还原剂 分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、D型维生素C、硫化钠等，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内（充日CO2或N2

15、也可），适温培养。（二）焦性没食子酸法（三）平皿厌气培养法（四）试管厌气培养法（五）玻璃板隔绝空气培养法（六）生物吸氧法（1）保加利亚乳杆菌的分离筛选（2）嗜热链球菌的分离筛选,第四节野生菌株的筛选和目的产物的鉴别,一、初筛1平板筛选 较粗放的检筛方法 2摇瓶筛选 效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广,通过该法可淘汰85-90%不符合要求的微生物 二、复筛 一个菌株通常要重复3-5个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定,实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选,采样（造纸厂）,80度30分钟处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素）

16、，pH10.5培养34天，选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,例：醛肟水解酶的筛选,-Journal of biotechnology 94(2002),65-72,培养基中含0.05%of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基,不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落,极端环境中的微生物的筛选,极端环境：高、低温环境 高盐环境 高酸、高碱环境 高压环境。,极端环境中的微生物,（一）嗜热微生物1、发现,地热泉,热水系统 制糖厂,极端环境中的微生物,（一）嗜热微生物2、生存机制（高温对微生物的一般影响是什么？）有限

17、的保护机制：细胞膜的蜡质程度、震热蛋白 极端嗜热菌的保护机制：高溶点脂肪、抗热蛋白、核酸保护蛋白,（二）嗜冷微生物1、发现（红雪现象：嗜寒水藻）,极端环境中的微生物,耐寒喜温型嗜冷型,（二）嗜冷微生物2、生存机制 特殊的酶、细膜含特殊的脂肪,极端环境中的微生物,PHA,PHA是聚羟基脂肪酸酯类材料的总称，目前产业化品种已有四代。第一代产品的典型代表为均聚物PHB（聚3-羟基丁酸酯）。该材料脆性大，很难大规模应用。为了改善加工性能，人们又研发了第二代产品PHBV（聚3-羟基丁酸酯/3-羟基戊酸酯共聚物）、第夏商周产品PHBHHx（3-羟基丁酸酯/3-羟基己酸酯共聚物）以中举四代产品P34HB（聚

18、3-羟基丁酸酯/4-羟基丁酸酯共聚物）。P34HB克服了之前塑料加工成型工艺产品可选单体少、成本高、难以产业化的难题，具有成本低、发酵效率高、综合性能优异、应用范围广、可在传统塑料加工机械上加工成型等优点。第四代产品P34HB的综合性能已接近聚乙烯、聚丙烯等通用塑料，并且还可以路程经过过程调整单体比例，来调节P34HB性能，满足不同应用领域对范性和弹性的需要。该公司表示，P34HB不仅性能与石油基塑料接近，成本也与石油基塑料相接近。,与各人熟知的PLA等有生命的物质基材料比拟，PHA的显著优点是能路程经过过程布塑料加工工艺 ppt局调节使最终产品适用于不同的应用领域，而支撑这类优点的就是其单体

19、的多样性。海内外研究证明，有生命的物质合成PHA新材料的潜力几乎是无穷的。在2000年时人们就已发现了跨越150种的PHA单体。单体布局变化和共聚物中不同单体比例的不同，给PHA布局变化带来了无穷可能。布局的多元化，又带来了性能的多样化。PHA可以坚硬如硬塑料，也可以绵软如弹性体，可以制成吹膜级、压片级、吹瓶级、发泡级和弹性体级的产品。路程经过过程调整单体配比，PHA产品质性格能可以横跨纤维、塑料、橡胶、热熔胶等不同范畴，加之PHA兼具杰出的有生命的物质相容性，其应用领域已不局限在单一的塑料成品，还可以在杀虫药缓释剂、高性能生化滤膜、医疗药品缓释长效药物载体和骨钉、手术缝合塑料挤出成型工艺线、

20、人的身体整容填充材料方面大显身手。,生物柴油Biodiesel,基本内容,1、生物柴油研究的意义2、生物柴油及生产方法3、生物柴油的优缺点4、生物柴油的国内外现状,一、生物柴油研究的意义,世界石油资源的枯竭石油资源对国家和个人的影响2004年中国成为全球第二大石油消耗大国3亿吨生物柴油,二、生物柴油及生产方法,2.1 生物柴油一种脂肪酸甲酯类化合物，通过植物油或动物脂肪与醇类化合物在催化剂存在下进行酯化反应生成原料油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂，以及动物油脂、废餐饮油料。,2.2生物柴油的生产方法直接混合法微乳化法裂解法酯化法酯交换（醇解）法,物理方法,化学方法,酯化-酯交换联

21、合法生物柴油生产流程,三、生物柴油的优缺点,3.1 优点具有优良的环保优势运动粘度高安全性能好燃烧性能优良属于天然可再生性能源，减少人们对石油的依赖单独使用，也可与石化柴油调和使用，还可以作为添加剂提高燃烧效率,3.2 缺点低温启动性能不佳燃烧排放物中NOx 含量较高含有微量甲醇与甘油，会使接触的橡胶零件，如橡胶膜、密封圈、燃油管等逐渐降解油脂来源分散，品种复杂,四、生物柴油的国内外现状,4.1国外生物柴油发展现状4.2国内生物柴油发展现状,4.1国外生物柴油发展现状,美国美国有4家生物柴油生产厂，总能力为30万吨/年。德国现有8家生物柴油生产厂，拥有300多个生物柴油加油站，2003年生产生

22、物柴油50万t/a法国法国有7家生物柴油生产厂，总能力40万t/a欧洲其他国家的生物柴油生产量为:捷克和斯洛伐克10万吨/年、比利时2万吨/年（2001年)、意大利12.5万吨/年、奥地利2.5万吨/年。,微藻制油,藻类含有大量的生物油脂，部分品种含油达70，而且它们的光合作用效率高，生长迅速。研究表明，每公顷土地上，玉米的年产油量只有120升，大豆为440升，而藻类可达1.5万8万升，是玉米的数百倍。因此，如果能找到最适宜的品种，加上培育得当，藻类将是非常有潜力的生物柴油来源。据介绍，这些藻类属于微藻，是海带、紫菜的“远亲”。不过微藻比细菌稍大，个头在几微米。它们之所以是绿色的，是因为细胞内

23、含有叶绿素，在适宜的温度下，微藻能大量吸收二氧化碳，并通过叶绿素的光合作用制造生长所需的养分。待微藻长成经脱水干燥，就能得到浅绿色的粉末。从这些藻粉中可提取出油脂，经化学方法处理制备出的生物柴油，其性质和成分与传统石化柴油非常相似，某些指标比如发动机低温启动性能甚至更好。一般而言，科学家把玉米制油等作为生物质能利用的第一代技术，秸秆发电是第二代，而微藻制油就是第三代，其应用前景非常广阔。,生物制氢,1.氢能的利用历史2.生物制氢研究发展历程及现状3.三大微生物制氢法,1.氢能利用的曲折史,重视 20世经70年代世界性的能源危机爆发，制氢技的实用性及可行性得到高度的重视，当时的能源界将氢气誉为“

24、未来燃料”.80年代能源危机结束之前，人们对各种氢源及其应用技术己经进行了大量的研究。,冷落 石油价格回落以后，氢气及其它替代能源的技术研究一度不再出现在一些国家的议事日程中。重新重视 到了90年代，人们对由以化石燃料为基础的能源生产所带来的环境问题有了更为深入的认识。利用化石燃料不是长久之计。此时，世界再次把目光“聚焦”在制氢技术上。,氢能的优势,1.地球上的氢元素十分丰富2.氢气是最洁净的燃料3.氢能的高效率4.氢是可储存的二次能源,微生物为何能产生氢气？,微生物产氢的关键因素产氢酶,产氢过程中能够使质子还原为氢气的酶有固氮酶和氢酶两种。,固氮酶是由两种蛋白质分子构成的金属复合蛋白酶,能催

25、化还原氮气成氨，氢气作为副产物产生。氢酶是微生物体内调节氢代谢的活性蛋白。氢酶又可以分为吸氢酶、可逆性氢酶。氢酶在微生物中主要功能是吸收固氮酶产生的氢气。可逆性氢酶的吸氢过程是可逆的，吸氢酶的吸氢过程是不可逆的。因此从产氢需求出发，常勾践吸氢酶基因缺陷的突变体以增加产氢的速率。,微生物制氢的三大方法,1.光合微生物产氢2.微生物水气转换制氢3.暗发酵制氢,光合微生物产氢,投入：光能产出：氢气,直接光解产氢,光能 光能自养型微生物 氢气 特点：直接利用光能产生氢气,至今对细菌光合产氢的具体步骤没有定论设想反应机理以下式简单表示：6CO2+10H2OC6H12O6+4H2+8O2,例绿藻,绿藻属于人类已知的最古老植物之一，通过进化形成了能生活在两个截然不同的环境中的本领。当绿藻生活在平常的空气和阳光中时，它像其他植物一样具有光合作用。光合作用利用阳光，水和二氧化碳生成氧气和植物维持生命所需要的化学物质。,