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1、第四章 生物氢气,随着能源危机、环境污染、温室效应等问题的加剧，各国政府对清洁、可再生能源的研究投入正在不断增加。氢气因其相对密度低，燃烧热值高，在转化为热能或电能时只产生水蒸气，不会产生有毒气体和温室气体，是最清洁的环保能源，特别适用于交通运输，同时也是航天航空的理想燃料。因此，在21世纪氢能经济所描绘的蓝图中，氢气是未来最理想的终端能源载体，它的实现将会为人类文明带来新的变革。,4.1.1 氢气的性质,4.1 氢气的燃料特性,在各种气体中（包括空气等混合气体），氢气的相对密度最小。标准状况下（常压与0时），H2以无色、无味无臭的气体存在，1L氢气的质量是0.0899g；在常压下，温度为-2
2、52.87时，氢气可转变成无色的液体；温度为-259.1时，变成雪状固体。由于氢键键能大，燃烧1g氢能释放出142kJ的热能，是汽油发热量的3倍。与汽油、天然气、煤油相比，氢的质量特别轻，携带、运送方便，因而是航天、航空等高速飞行交通工具最合适的燃料。,氢与氧气反应的火焰温度可高达2500，因此也常是切割或者焊接钢铁材料的最佳燃料。氢气可以被金属氢化物、碳基吸附剂以及金属-有机配位子结构等多孔性且具有非常大表面积的材料大量吸附。当外界加热或加压时，吸附于这些材料中的氢气释放出来，这是目前开发新型氢气储运方法的理论基础。,4.1.2 氢的特性,在大自然中，氢主要以化合态的形式存在于水、石油、煤炭
3、、天然气、各种生命有机体及其有机产物中。地球表面约71%为水所覆盖，储水量很大，其中海洋的总体积约为13.7亿km3，因此，水是氢的大“仓库”，以原子百分比表示，水中含有11%的氢。生物体及其所产生的各种有机物中也含有大量的氢，而地球上有机物归根结底来源于光合作用，其中蕴藏的氢来源于水。由于氢气燃烧后仍然形成水，所以，水和有机物是氢气“取之不尽、用之不竭”的源泉，关键是用什么样的方法从水中或来源于光合作用的各种有机物中制取氢气。,生物制氢技术可以在常温、常压、能耗低、环境友好的条件下，从水或各种有机物中制取氢气，这一技术将有望取代目前主要来源于钢铁厂、焦化厂、氯碱厂等的副产品回收纯化及煤、烃类
4、、天然气和生物质的水蒸气重整技术。正因为如此，对生物制氢技术的研究正在受到人们普遍关注。2005年以来，有关生物制氢方面的论文数量和专利数量在急剧增加，这说明了生物制氢技术的研究步伐正在大大加快。,4.2 生物制氢原理,自Nakamura于1937年首次发现微生物的产氢现象，到目前为止已报道有20多个属的细菌种类及真核生物绿藻具有产氢能力。其中，产氢细菌分属兼性厌氧或厌氧发酵细菌、光合细菌、固氮菌和蓝细菌四大类。依据产氢能力，目前备受关注的微生物产氢代谢途径主要有三种：,以厌氧或兼性厌氧微生物为主体的暗发酵产氢，它以各种废弃生物质为原料、工艺条件要求简单、产氢速度最快，因此，暗发酵产氢技术的研
5、究进展最快，离规模化生产的距离最近；,以紫色光合细菌为主体的光发酵产氢，是暗发酵产氢的最佳补充，既能在暗发酵产氢的基础上，进一步提高底物向氢气的转化效率，又能消除暗发酵产氢过程中积累的有机酸对环境危害的隐患，暗、光发酵偶联制氢技术有望成为由废弃物或废水制氢的清洁生产工艺；蓝细菌和绿藻进行裂解水制氢，尽管目前生物裂解水制氢技术在效率上仍处于劣势，但其以水为制氢底物，在原料上具有优势。虽然，许多固氮菌也具有产氢能力，但是因为这类微生物产氢时需要的ATP来源于氧化有机物，而这些微生物氧化有机物产生ATP的效率非常低，所以，相对于以上其他产氢微生物，其产氢速率低，应用前景不是很好。,4.2.1 生物制
6、氢的微生物学,依据产氢代谢途径及产氢机理不同，我们将分别介绍光解水产氢的微藻和蓝细菌、光发酵产氢的紫色光合细菌及暗发酵产氢的厌氧或兼性厌氧微生物。,4.2.1.1 光解水产氢的微生物,近年，随着对绿藻光水解制氢技术研究的不断深入，发现了许多能够用于生物制氢的绿藻，主要包括淡水微藻和海水微藻。莱茵衣藻是一种研究生物制氢的模式微藻，另外，斜生栅藻、海洋绿藻、亚心形扁藻和小球藻等都具有产氢的能力。,能够产生氢气的蓝细菌有固氮菌鱼腥藻、海洋蓝细菌颤藻、丝状蓝藻等和非固氮菌如聚球藻、黏杆蓝细菌等。研究表明，鱼腥藻属蓝细菌生成氢气的能力远远高于其他蓝细菌属，其中，丝状异型胞蓝细菌和多变鱼腥蓝细菌都具有强大
7、的产氢能力，因而受到人们的广泛关注。,目前研究比较深入的放氢蓝细菌主要有鱼腥藻属，念珠藻属的几种异型胞蓝细菌如丝状异型胞蓝细菌、多变鱼腥蓝细菌和念珠藻，个别胶州湾聚球菌属和集胞藻属的蓝细菌种类，它们的产氢速率为0.174.2molH2/(mgchlah)。绿藻研究的种类也非常少，最常见的是莱茵衣藻，其最高速度低于2mL/(L h),蓝细菌或绿藻都具有两个光合作用系统，其中，光合作用系统（PS）能吸收光能分解水，产生质子和电子，并同时产生氧气。在厌氧条件下，所产生的电子会被传递给铁氧还蛋白，然后分别由固氮酶或氢酶将电子传递给质子进一步形成氢气。但产氢的过程同时也是产氧的过程，而氧气的存在会是固氮
8、酶或氢酶的活性下降，所以在一般培养条件下，蓝细菌或绿藻的产氢效率非常低，甚至不能产氢。研究者们希望通过传统育种或基因工程的方法，来提高绿藻或蓝细菌的光裂解水产氢效率。,4.2.1.2 暗发酵产氢的微生物,发酵产氢微生物可以在发酵过程中分解有机物产生氢气、二氧化碳和各种有机酸。它包括梭菌科中的梭菌属，丁酸芽孢杆菌属，肠杆菌科的埃希氏菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属，瘤胃球菌属，脱硫弧菌属，柠檬酸杆菌属，醋微菌属，以及芽孢杆菌属和乳杆菌属的某些种。其中，研究比较多的是专性厌氧的梭菌科和兼性厌氧的肠杆科的微生物。不同种类的微生物对同一有机底物的产氢能力不同，通常严格厌氧菌高于兼性厌氧菌。随着研究的广泛开
9、展，不断有新的具有高效产氢能力的菌株被分离。,通过基因工程改造产氢微生物的代谢途径将有助于提高它们的产氢能力。除了分离纯化出来的纯菌用于生物制氢，近几年来，优化选育后的混合菌群产氢更受关注。,4.2.1.3 光发酵产氢的微生物,在光照条件下，紫色硫细菌（荚硫菌属和着色菌属）利用无机物H2S，紫色非硫细菌（红螺菌属和红细菌属）利用有机物（各种有机物）作为质子和电子供体产氢，由于这类反应在厌氧条件下进行，类似于发酵过程，所以这种产氢方式常被称为光发酵产氢。,紫色硫细菌和紫色非硫细菌具有PS,并由PS通过光合磷酸化提供给光发酵产氢的驱动力ATP，但这些微生物不具有PS，不能裂解水，所以不存在同时产氧
10、气的现象。目前常用来产氢的光合细菌种类主要有：深红红螺菌，沼泽红假单胞菌，类球红细菌，荚膜红细菌等。由于光发酵产氢依赖于固氮酶催化，因此，铵抑制现象也是阻碍光发酵产氢技术应用的重要环节。目前，科学家们更注重采用诱变、分子生物学和基因工程技术手段相结合的办法来选育产氢速率快、底物转化效率高、光能利用效率高、利用底物或者有机废弃物范围广、对铵离子的耐受能力高的优良产氢菌株。,同样针对产氢光合细菌对光能的利用率比较低的现象，除了对吸氢酶进行敲除外，对其捕光系统的改造也是一个趋势。研究发现能进行光发酵产氢的许多微生物在黑暗厌氧条件下也能进行发酵产氢。,4.2.2 生物制氢的关键性酶,光解水、厌氧发酵及
11、光发酵产氢过程都涉及许多不同的代谢途径，许多酶参与这些产氢代谢的催化，其中，固氮酶和氢酶是生物制氢的两个最关键的酶。不同微生物类群或者利用氢酶产氢、或者利用固氮酶产氢：同是光裂解水产氢，微藻依靠氢酶产氢，蓝细菌主要依靠固氮酶产氢，黑暗厌氧发酵微生物依赖氢酶产氢，而光发酵细菌依赖固氮酶产氢。,4.2.2.1 固氮酶,固氮酶还原分子氮为氨，也可以还原氮气以外的叁键化合物，包括氰化物、乙炔及氮氧化物和质子。乙炔还原为乙烯常被用来测定离体或整体的固氮酶活性。质子还原的反应就是光合产氢的生物学依据。由于固氮反应需要消耗大量能量，固氮酶的合成和调控受严格控制：,首先，固氮酶的活性对氧气非常敏感。另外，固氮
12、酶的合成和活性还受体内体外氮源的丰富程度影响，当氮源充足时，固氮酶也是受抑制的，甚至基本不会表达，只有在氮饥饿时固氮酶才会高效表达。最后，固氮酶本身的活性还受到翻译后修饰的调控。,4.2.2.2 氢酶,氢酶是另一种参与产氢代谢的关键性酶，它催化氢气与质子相互转化的反应：H2 2H+2e-。氢酶存在于原核和真核生物中，按催化反应的结果可分为放氢酶和吸氢酶两种。氢酶是Fe-S蛋白，在它们的活性中心一般有两个金属原子。根据活性中心的金属组成类型可以分为三类：,活动中心由一个Fe原子和一个Ni原子组成的NiFe 氢酶；由两个Fe原子组成的FeFe 氢酶；近年只在一些甲烷菌中发现的不含有Fe-S簇和Ni
13、原子的无Fe-S簇氢酶或Fe氢酶，它的功能是生成氢气的甲基四氢蝶呤脱氢酶。,4.2.3 生物制氢的产氢机理,蓝细菌和绿藻的产氢具有两个独立但协调起作用的光合作用中心，即接收太阳能分解水产生H+、电子和O2的光合系统（PS）以及产生还原剂用来固定CO2的光合系统（PS）。PS产生的电子经由PS再由铁氧还蛋白携带至氢酶（绿藻）或固氮酶（蓝细菌），在厌氧条件下，H+在氢酶或固氮酶的催化作用下形成H2，同时，电子也可能经由铁氧化还原蛋白传递至NAD(P)+，形成NAD(P)H用于固定二氧化氮，生成碳水化合物（图4.1）。,4.2.3.1 蓝细菌和绿藻的光解水产氢机理,图4.1 微藻光解水产氢过程电子传
14、递示意图,绿色植物由于没有氢酶或固氮酶，所以不能产生氢气，这是藻类和绿色植物光合作用过程的重要区别所在。因此除氢气的形成外，绿藻的作用机理和绿色植物光合作用机理相似，绿色植物的光合作用规律和研究结论可以用于藻类新陈代谢过程分析。,蓝细菌和微藻均可光裂解水产生氢气，它们的产氢机制也基本相似，需要强调的是，微藻在光照和厌氧条件下的产氢由氢酶催化，但蓝细菌的产氢主要由固氮酶催化。微藻的氢酶属于FeFe氢酶，为双向氢酶。,4.2.3.2 暗发酵产氢,产氢微生物能够根据自身的生理代谢特征，通过发酵作用，在逐步分解有机底物的过程中产生分子氢。目前发现细菌黑暗厌氧发酵的产氢途径主要分为三种：,丙酮酸脱氢途径
15、 甲酸裂解途径 NADH+H+产氢途径,梭状芽孢杆菌类专性厌氧微生物主要为丙酮酸脱氢发酵型产氢细菌，直接产氢过程发生于丙酮酸脱羧作用中，丙酮酸首先在丙酮酸脱氢酶的作用下脱羧，形成硫胺素焦磷酸-酶的复合物，将电子转移给铁氧还蛋白，形成还原态的铁氧还蛋白（Fdred）,然后在氢酶的作用下被重新氧化成氧化态的铁氧还蛋白（Fdox）,并产生分子氢；肠杆菌类兼性厌氧微生物属于甲酸裂解型发酵产氢菌，直接产氢过程也发生于丙酮酸脱梭过程中，丙酮酸脱羧后形成的甲酸（也包括厌氧环境中CO2和H2生成的甲酸），通过铁氧还蛋白和氢酶作用分解为CO2和H2。NADH+H+产氢途径的产氢能力取决于NADH+H+的剩余量和
16、转化率。,A,图4.2 暗发酵产氢途径,B,A.梭杆菌属的丙酮酸脱氢途径；B.肠杆菌的甲酸裂解途径,在暗发酵产氢中，通常是将复杂的糖类水解后生成单糖，单糖通过丙酮酸途径实现分解，产生氢气的同时伴随着一些低分子有机酸和醇类产生。也正是因为大量的有机酸或醇类产生，使得单糖转化成氢气的理论值也较低。微生物的糖降解经过丙酮酸主要有EMP途径、HMP途径、ED途径、PK途径。丙酮酸经发酵后转化为乙酸、丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等。根据丙酮酸的不同去路，可以将各种发酵产氢途径分为丁酸型发酵、乙酸型发酵、丁醇型发酵、混合型发酵产氢途径。其中，梭状芽孢杆菌属主要为丁酸型发酵产氢途径；肠杆菌主要为混合型发酵产氢途径
17、；丙酮-丁醇梭菌和拜氏梭菌主要为丁醇型发酵产氢途径；梭菌属中部分细菌、瘤胃球菌属、,拟杆菌属等主要为乙醇型发酵产氢途径。可溶性糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、淀粉等的发酵以丁酸型发酵为主，这是一种经典的发酵产氢方式，发酵产生的末端产物主要为丁酸、乙酸、H2、CO2和少量的丙酸，如图4.3所示。一些糖类在发酵过程中，经EMP途径产生的NADH+H+通过与一定比例的丙酸、丁酸、乙醇和乳酸等发酵过程相偶联而氧化为NAD+，来保证代谢过程中的NADH/NAD+的平衡。为了避免NADH+H+的积累从而保证代谢的正常进行，发酵细菌可以通过释放H2的方式将过量的NADH+H+氧化，反应式为：NADH+H+NAD
18、+H2，此反应是在NADH铁氧还蛋白氧化还原酶、铁氧还蛋白氢化酶作用下完成，其末端产物主要是丙酸和乙酸，气体产物非常少，一些学者把这种制氢称作为丙酸型发酵制氢。,图4.3 丁酸型发酵途径,乙醇型产氢途径与传统的乙醇发酵不同，传统的乙醇发酵没有氢气产生，而乙醇型产氢途径产生乙醇和乙酸的同时有氢气产生，主要末端发酵产物为乙醇、乙酸、H2、CO2和少量丁酸，如图4.4所示。,图4.4 乙醇型发酵途径,4.2.3.3 光合细菌制氢,在产氢光合细菌中，外源性有机物，特别是各种有机酸作为电子供体，通过EMP和TCA循环生成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、CO2以及电子，这些电子通过胞内的电子传递链传至光反应中
19、心，低能态的电子在光反应中心受到光的激发，生成高能态的电子。高能态的电子一部分离开电子传递链被传递给铁氧还蛋白，铁氧还蛋白则又将电子传给固氮酶；另一部分的电子则在电子传递中传递，通过光合磷酸化途径并生成ATP。在光照条件下，固氮酶利用ATP、质子和电子生产氢气，氢酶主要起吸氢作用，以回收部分能量。光合细菌产氢的机理和途径见图4.5.,图4.5 光合细菌产氢的机理和途径,光合细菌所固有的只有一个光合作用中心的特殊简单结构，决定了它所固有的相对较高的光转化效率，以及提高光转化效率的巨大潜力。由于固氮酶的表达及活性受铵抑制调控，因此，光发酵产氢也同样受铵离子浓度的影响。在光发酵产氢的过程中同时伴随着
20、吸氢现象，在发酵过程中，吸氢活性增加，固氮酶活性较弱，产氢量减少。,对各类微生物的产氢机理的解析，将对优化生物产氢工艺条件，包括光能、温度、pH、气相组成和培养基营养组成等具有很好的指导作用，也将为通过代谢工程提高微生物的产氢效率奠定基础。,蓝细菌和微藻的光解水产氢以水作为唯一的质子与电子的供体。尽管与其他生物产氢途径相比，目前生物裂解水制氢技术在效率上仍处于劣势，但其以水为制氢底物，在原料成本上具有优势，因此，光解水产氢技术一直是人类希望实现的目标。厌氧发酵产氢与光合细菌发酵产氢都需要有机物作为产氢原料。许多暗发酵产氢微生物都能利用葡萄糖、蔗糖、果糖、淀粉产氢，有的暗发酵微生物还能利用五碳糖
21、、木聚糖产氢，还有些微生物能利用纤维素产氢。研究表明不同微生物利用同一种原料，或者同一种微生物利用不同的原料，其产氢效率或产氢速度也会有差异。一些厌氧发酵微生物也可以利用纤维素类物质产氢。,4.3 生物制氢原料,虽然许多光合细菌也能利用单糖产氢进行还有些微生物能利用纤维素产氢。研究表明不同微生物利用同一种原料，或者同一种微生物利用不同的原料，其产氢效率或产氢速度也会有差异。一些厌氧发酵微生物也可以利用纤维素类物质产氢。虽然许多光合细菌也能利用单糖产氢进行光发酵产氢，有的还可以利用蔗糖、果糖产氢，但利用糖类的产氢效率一般低于以有机酸为底物的产氢效率。所以，各种有机酸，特别是三羧酸循环中的各种有机
22、酸，是大多数光合细菌进行光发酵产氢的最佳原料。但许多微生物只能利用上面所描述底物中的一部分进行产氢，所以，通过驯化或选育来增加产氢微生物的底物范围，也是目前生物产氢技术研究中的方向之一。,为了降低制氢成本，也为了生物制氢技术同时能治理环境，近年来许多研究者都在尝试利用各种废弃生物质，包括农业废弃物、生活垃圾或者有机废水进行生物产氢。已经尝试过用于厌氧暗发酵生物制氢的废弃原料有：各种作物秸秆（纤维素）、食品加工废水、橄榄油加工废水、牛奶加工废水、酿酒废水、柠檬酸生产废水、糖蜜废水、橱余垃圾以及城市固体废弃物或者污泥处理厂的污泥等。光合细菌的光发酵产氢底物也可以来源于各种废水。如果将光发酵产氢与暗
23、发酵产氢进行偶联，那么可以更有效地利用各种组成复杂的有机废水产氢。由此可见，光合细菌既可以将工业有机酸废水和工业发酵废水直接转化为清洁能源，同时又可以降低废水中COD，具有减少环境污染和产生氢能的双重作用，这将是很有前景的研究方向。,4.4 生物制氢工艺（自学）,4.5 生物制氢实践,目前有关生物制氢技术的研究多处于实验室研究阶段，而且，目前生物制氢的产氢成本尚无法与工业废气回收制氢竞争。利用暗发酵速度较快，产量较多，能广泛利用废弃生物质和工业有机废水发酵产氢。如“生物制氢-产甲烷发酵-交叉流好氧”为主体的高浓度有机废水生物制氢和废水处理综合工艺系统。,图4.生物产氢中试主要工业流程,生物制氢将废弃物资源化、能源化和环保化融为一体，具有环节国家能源紧张同时减少环境污染的双重作用，是非常有发展前途的生物技术。但是，生物制氢技术从实验室研究走向大规模应用还有许多基础理论问题和工程技术问题需要解决。今后的研究重点应主要集中在：继续筛选自然界中具有高效发酵产氢活性的微生物；寻找最佳的产氢条件，提高固氮酶、双向氢酶和其他负责调控产氢效率的重要功能酶的催化活性及抗逆性；利用定点突变、基因敲除、代谢途径的改变等分子生物学和遗传学技术手段，得到高效率产氢的工程菌株。,作业：1.简述微生物制氢种类、途径。2.微生物制氢关键酶有哪些？,
