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1、 淮北师范大学 2013届学士学位论文 不同培养条件对雪莲果愈伤组织中低聚果糖的影响学院、专业 生命科学学院 生物科学 研 究 方 向 药用植物培养技术 学 生 姓 名 学 号 指导教师姓名 指导教师职称 2013年5月25日不同培养条件对雪莲果愈伤组织中低聚果糖的影响董小英 (淮北师范大学，生命科学学院)指导教师：张爱民摘要 目的：研究糖的种类(蔗糖、葡萄糖）、糖的含量（30 gL-1、50 gL-1、70 gL-1)和pH（5.5、6.0、6.5)对雪莲果愈伤组织中低聚果糖的影响。方法：以愈伤继代培养基MS+2.0 mgL-16-BA+0.2 mgL-1NAA+1.0 mgL-1KT+7.
2、5 gL琼脂为基本培养基，采用正交试验，研究糖的种类（蔗糖、葡萄糖），糖的含量（30 gL-1、50 gL-1、70 gL-1）和pH（5.5、6.0、6.5）对雪莲果愈伤组织中低聚果糖的影响。结果与结论：葡萄糖显著影响雪莲果愈伤组织中低聚果糖的含量，适合雪莲果愈伤组织中低聚果糖积累的最优组合为：MS+2.0 mgL-16-BA +0.2 mgL-1NAA +1.0 mgL-1KT +7.5 gL-1琼脂+30 gL-1蔗糖+50 gL-1葡萄糖，pH=6.0，培养时间为15d, 15C。关键词不同培养条件；雪莲果愈伤组织；低聚果糖；正交试验 Effects of different cult
3、ure conditions on the oligosaccharide in yacon callus DONG Xiao-ying(College of Life Science, Huaibei Normal University) Tutored by ZHANG Ai-minAbstract objective: To study effects of type (came sugar、glucose) of sugar, content (30 gL-1、50 gL-1、70 gL-1) of sugar and pH (5.5、6.0、6.5) on the oligosacc
4、haride in yacon callus. Methods: On the basis of callus subculture medium: MS+2.0mgL-16-BA+0.1mgL-1NAA+1.0 mgL-1KT+7.5gL-1agar, the type (cane sugar、glucose) of sugar ,content (30 gL-1、50 gL-1、70 gL-1) of sugar and pH (5.5、6.0、6.5)on the oligosaccharides in the yacon callus were studied by using ort
5、hogonal experiment. Results and Conclusions: Glucose played a significant role on the amount of the oligosaccharides in the yacon callus. The optimal combination for oligosaccharides accumulation in callus was: MS+2.0 mgL-16-BA+0.2 mgL-1NAA+1.0 mgL-1KT+7.5 gL-1Agar+30 gL-1Sucrose+50 gL-1Glucose unde
6、r the temperature of 15 C and the pH was6.0.The appropriate time of culturing yacon callus was 15 days.Keywords Different culture conditions; yacon Callus; Oligosaccharide; Orthogonal experiment 目录引言11材料和方法11.1材料11.2方法11.2.1获取愈伤组织11.2.2 培养基和培养条件11.2.3材料处理21.2.4雪莲果愈伤低聚果糖的提取21.2.5总糖标准曲线的制作(苯酚-硫酸法)21.2
7、.6还原糖标准曲线的制作(DNS比色法)31.2.7低聚果糖含量的测定41.2.8数据统计分析42结果与分析43讨论9参考文献10致谢11引言雪莲果(Smallanthus sanchifalius)学名Yacon（亚贡，或者阿贡）即“神果”之意1,2，原产于南美洲安第斯山脉，是当地印第安人的一种传统根茎食品，属菊科，葵花属植物，又称为菊薯3,4，别名为地参果，亚贡。雪莲果果肉晶莹如玉，香甜脆爽，富含多种维生素，属低热量食品5,6。雪莲果块根中所含有的果寡糖（低聚果糖）是干物质的60-70%为所有植物中最高7，该糖在人体中不被分解消化，其低聚果糖并不为人体所吸收，因此非常适合于糖尿病病人及减肥
8、者食用8。此外，雪莲果还可以促进消化，调理胃肠道，调理血液，清除高血脂，有效地控制胆固醇和糖尿病，对老年人的心脑血管病有明显的保健作用。另外，它还能降火清毒，防治面部暗疮，对皮肤美容及改善体质效果显著，雪莲果是集药、果、菜三位一体的营养保健品9。当前，由于雪莲果的种植面积有限，市场上雪莲果供不应求，雪莲果中低聚果糖的开发才刚刚起步。且低聚果糖的代谢被认为环境胁迫的一种调节机制10，本试验通过正交试验研究糖的种类、糖的含量和pH对雪莲果中低聚果糖含量的影响，以期获得高产量低聚果糖的愈伤，为低聚果糖的工业化生产奠定基础。1材料和方法1.1材料雪莲果无菌苗由资源植物生物学安徽省重点实验室提供，经薛建
9、平教授鉴定为向日葵属植物雪莲果(Smallanthus sanchifalius)。1.2方法1.2.1获取愈伤组织取雪莲果无菌幼苗的茎段，在无菌水下反复冲洗干净。在超净工作台上先用70%的酒精消毒30 s，然后用0.1%氯化汞溶液消毒3 min，用无菌水冲洗3-4次并用无菌滤纸吸干，转接至培养基MS+2.0 mgL-1 2,4-D+1 mgL-1 NAA进行愈伤组织的诱导，经多次继代培养，获得大量的愈伤组织。1.2.2 培养基和培养条件 选用MS基本培养基，用0.75%琼脂固化，pH5.8-6.0，添加2.0 mgL-1 6-BA，1.0 mgL-1KT和0.2 mgL-1 NAA，分装于1
10、00-150 mL锥形瓶中，121 C湿热灭菌15-20 min。选用L9(34)正交表研究糖的种类含量和pH对雪莲果愈伤组织中低聚果糖含量的影响。 表1 L9 ( 34 )正交设计表Table 1 Orthogonal table of L9( 34) 水平（Level）因素（Factor）蔗糖（gL-1）葡萄糖（gL-1）pH值 1 30 30 5.5 2 50 50 6.0 3 70 70 6.51.2.3材料处理按照正交试验表配制3批9种培养基，每瓶培养基接种愈伤2.0 g，置于15 C恒温培养箱中培养5、10、15 d后取出60 C烘干待用11。整体试验重复3次。1.2.4雪莲果愈伤
11、低聚果糖的提取准确称取1 g不同处理烘干后的雪莲果愈伤，分别研磨成粉末形状放入圆底烧瓶，加入适量蒸馏水混均,按1:40料液比，80C水浴提取4 h，后低速离心，合并上清液即为所需要的低聚果糖提取液，最后放入冰箱低温保存待用12,13。1.2.5总糖标准曲线的制作(苯酚-硫酸法)总糖标准曲线的制作：称取葡萄糖样品20 mg定容至500 mL容量瓶中，摇匀。精密吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL述溶液加入到具塞试管中，补水至2 mL，加入1.0 mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速加入5.0 mL浓硫酸，盖上塞，摇匀，在室温显色20 min，以空白校正零点，于490
12、 nm处测定其吸光度14。以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，做出总糖的标准曲线见下图1，并得回归方程y=15.789x-0.0605，R2 =0.9991 图1总糖标准曲线 Fig.1 Standard curve of the total sugar1.2.6还原糖标准曲线的制作(DNS比色法) DNS溶液的配制：称取酒石酸钠18.2 g，溶于50 mL蒸馏水中，加热（温度不宜超过50 C），于热溶液中先加入NaOH 2.1 g，后加入3，5-二硝基水杨酸0.63 g，苯酚0.5 g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏水定容至100 mL，贮于棕色瓶中，室温保存。 还原糖标准曲线的制作：取6支2
13、5 mL具塞试管，编号为0号、1-5号。精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖标准溶液(1mg mL-1)加入到已编号的具塞试管中，补水至2 mL，精密加入2 mL DNS试剂。将各试管摇匀，在沸水浴中加热2 min后立即流水冷却至室温，蒸馏水定容至15 ml，混匀。在540 nm波长下，用0号校零，分别读取1-5号试管的吸光度。以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，做出还原糖的标准曲线见下图2，并得回归方程y=1.8623x+0.0028，R2=0.9991 图2还原糖标准曲线 Fig.2 Standard curve of the reducing sugar1.
14、2.7低聚果糖含量的测定分别取5 l提取液，稀释40倍，按上述方法分别测定其中总糖和还原糖吸光度值，并计算出总糖和还原糖含量，按下式计算出不同处理愈伤中低聚糖含量。雪莲果愈伤中低聚果糖含量(%)= 总糖含量(g)-还原糖含量(g)*100% 原料(g)1.2.8数据统计分析定期观察记录，待5 d、10 d、15 d后将其烘干准确称重，并测定低聚果糖含量，用Minitab15软件分析数据。 2结果与分析 雪莲果愈伤中低聚糖积累的正交试验最终统计试验结果见表5，比较蔗糖的均值K可知K1K2K3，说明低聚糖含量随蔗糖浓度增大而减少即30 gL-1的蔗糖较适合低聚果糖的积累。比较葡萄糖的均值K可知K2
15、K3K1，说明低聚果糖的含量随葡萄糖浓度增大先增后减即50 gL-1的葡萄糖较适合低聚果糖的积累。比较pH的均值K可知K2K3K1，说明低聚果糖含量随pH值增大先增后减即pH为6.0较适合低聚果糖的积累。比较三者R值可知葡萄糖对低聚果糖含量影响较大，进一步方差分析可知葡萄糖对低聚果糖含量的影响极显著（见表6）。 表2 低聚果糖含量正交试验结果(5d)Table.2 Results of orthogonal experimental on content of oligosaccharides in suspendedcells of yacon (5d)固体培养基编号因素Factors低聚糖
16、含量/%蔗糖（gL-1） 葡萄糖（gL-1）pH（gL-1） 130305.52.63230506.0 6.13330706.53.21450306.0 5.12550506.5 5.80650705.5 5.64770306.5 3.15870505.5 5.95970706.0 4.53K1 3.99 3.63 4.74 K2 5.52 5.96 5.26K3 4.54 4.46 4.05 R 1.53 2.33 1.21 表3 低聚果糖含量正交试验结果(10 d)Table.3 Results of orthogonal experimental on content of oligos
17、accharides in suspended cells of yacon (10 d)固体培养基编号因素Factors低聚糖含量/%蔗糖（gL-1） 葡萄糖（gL-1）pH130305.512.80230506.0 18.95330706.5 13.78450306.0 15.34550506.5 15.15650705.5 15.01770306.5 13.96870505.5 15.85970706.0 14.73K1 15.17 14.03 14.55K2 15.16 16.65 16.34K3 14.84 14.50 14.29R 0.33 2.62 2.05 表4 低聚果糖含量正
18、交试验结果(15 d)Table.4 Results of orthogonal experimental on content of oligosaccharides in suspended cells of yacon (15 d)固体培养基编号因素Factors低聚糖含量/%蔗糖（gL-1） 葡萄糖（gL-1）pH130305.517.12230506.032.73330706.522.20450306.020.23550506.519.56650705.519.06770306.517.73870505.519.50970706.018.50K124.0118.3618.56K219
19、.6123.9323.82K318.5719.9219.83R5.445.575.26综合5 d，10 d，15 d三组数据的均值K来看，可得下表： 表5 雪莲果愈伤组织中低聚果糖含量的极差分析 Table.5 Range analysis on content of oligosaccharides in callus from Smallanthus sanchifalius K因素 蔗糖（gL-1）葡萄糖（gL-1）pHK114.3911.9112.62K213.4315.5115.14K312.6512.9612.72R 1.743.62.52表6雪莲果愈伤中的低聚果糖含量方差分析Ta
20、ble.6 Variance analysis on the content of oligosaccharides from yacon来源偏差平方和自由度均方FP值显著性培养天数3541.08121770.540370.3580.000*蔗糖36.890218.4453.8580.026*葡萄糖183.952291.97619.2390.000*pH92.983246.4929.7250.000*Error344.205724.781Total18992.59081 注：*表示在0.05水平上差异显著 Note:*means significant difference at P=0.05
21、由表2、3、4直观分析可知，适合雪莲果愈伤组织中低聚果糖积累的最优组合为：MS+2.0 mgL-1 6-BA+0.2 mgL-1NAA+1.0 mgL-1KT+7.5 gL-1 琼脂+30 gL-1的蔗糖+50 gL-1的葡萄糖，pH=6.0，培养时间为15 d，15 C。配制该培养基，转接愈伤，15 培养，进行验证该组合较适合雪莲果愈伤组织中低聚果糖的积累。 3讨论 低聚果糖具有与普通食糖迥然不同的消化过程和代谢途径，并具有许多的生理功能。植物中低聚果糖的代谢是植物调节环境胁迫的一种重要机制，它的积累能够使植物在多种环境胁迫下的抗逆性增强，如低温和干旱引起的缺水、缺氧、贫瘠等11。本试验发现
22、，葡萄糖显著影响雪莲果愈伤组织中低聚果糖的积累。30 gL-1的葡萄糖培养条件下，雪莲果愈伤组织中低聚果糖单位含量积累较低，70 gL-1的葡萄糖培养条件下，雪莲果愈伤组织中低聚果糖单位含量积累居中，50 gL-1的葡萄糖培养条件下，雪莲果愈伤组织中低聚果糖单位含量最高。可见50 gL-1葡萄糖含量可明显增加低聚果糖积累，而随葡萄糖含量进一步升高或降低至超过它的耐受范围其含量明显呈下降趋势。可能因为耐受范围内适宜低葡萄糖胁迫，低聚果糖的积累和植物的细胞代谢显著相关。可能因为耐受范围内适宜低葡萄糖浓度控制。本试验中，70 gL-1葡萄糖含量培养条件下雪莲果愈伤生长较慢，此时细胞代谢缓慢，因而低聚
23、果糖含量积累较低；而50 gL-1葡糖糖含量培养条件下为其耐受范围内的胁迫，可能低葡萄糖浓度信号引起细胞内相关基因高水平表达，进而增加低聚果糖合成相关酶的分泌，引起低聚果糖含量的增高，从而应答低葡萄糖浓度环境。目前，雪莲果愈伤中低聚糖含量的变化研究还处于初级阶段，本试验仅仅研究了糖的种类、糖的含量和pH对其含量的影响，而其它胁迫条件还未研究，因而有必要进一步研究多因素对低聚糖积累的影响，进而获取更高产低聚糖的愈伤，为低聚糖的工业化生产奠定基础。总之，随着低聚果糖这类新型功能性的出现和生理功能作用的研究，其作为一种功能性食品的应用也将不断得以扩展，也将有力的推动医药、食品、保健等相关行业的发展，
24、提高人们的生活水平和促进国民经济的发展具有现实和深远的意义。 参考文献 1吴先英, 韦廷才. 雪莲果的生物学特性及其栽培技术J. 农技服务, 2007, 1:4-5.2陆 琳, 蒋亚莲, 黎 霞, 苏 艳. 雪莲果的组织培养研究J. 西南师范大学学 报, 2009, 34(3):199-200.3李卓亚. 菊属化学成分及其药理作用的研究进展J. 食品与药品, 2007, (6):41-43.4中国蔬菜编辑部. 关于菊属（雪莲果）J. 中国蔬菜, 2007, (2):4-6.5范菊琼. 雪莲果的功能及栽培J. 种植园地, 2008, 10:17.6李美桂, 谢文龙, 李健. “雪莲果”的植物学正
25、身与价值J. 福建果树, 2007, 143: 2829.7Kuroda S, Ishihara J. Field Growth Characteristics of Plantlets Propagated in vitro and Line Selection for Increased Percentage of Surger in Tuberous Roots of Yacon. Polimnia SonchifoliaJ. Shikoku Nat Agric Exp Sta, 1993, 57:111-1218林若冰. 药用型水果-雪莲果J. 农技服务, 2005, (6):4-5.
26、9井明艳, 孙建义. 天然活性成分-低聚果糖的应用前景J. 浙江大学动物分子营养学教育部重点实验室, 2004, 28(13):22-27.10Ji X M, Van den Ende W, Schroeven L, et al. The rice genome encodes two vacuolar invertases with fructan exohydrolase activity but lacks the related fructan biosynthesis genes of the PooideaeJ. New Phytologist, 2007, 173(1):50-6
27、2.11程焕欣, 梁玉玲, 姚红宝. 干旱胁迫对甘草愈伤组织总黄酮含量的影响J. 安徽农业科学, 2010, 38(11):5633-5635. 12王照波, 周文美, 徐子婷等. 匀浆辅助水浴法提取雪莲果低聚糖的工艺研究J. 贵州大学学报, 2009, 26(4):100-101.13王照波, 周文美, 徐子婷等. 雪莲果水浴性低聚糖的提取工艺J. 贵州农业科学, 2010, 38(2):173-176.14饶之坤, 封良燕, 张虽栓. 雪莲果营养成分分析研究J. 云南化工, 2007, 34(1):52-54.致谢本论文即将完成之际,我的心情久久无法平静。岁月如梭, 我大学的四年时光也即将
28、敲响结束的钟声。离别在即,站在人生的又一个转折点上,心中难免思绪万千,一种感恩之情油然而生。回顾四年来的学习学习经历,面对现在的收获,我感到无比欣慰。为此,我向热心帮助过我的所有老师和同学表示由衷的感谢！ 感谢淮北师范大学生命科学学院提供的实验器材和实验药品。非常感谢薛建平教授和张爱民高级实验师给我提供开放实验室这个宝贵的平台，使我的实验动手能力有了很好的提高。同时感谢他们在我论文工作中的指导和督促。感谢薛老师实验室里的各个成员,正是由于他们的帮助和支持,我才能一个个克服困难解明疑惑,直至实验论文顺利完成。特别感谢我的实验搭档张婷同学，她对本课题做了不少工作，给予我不少帮助。非常感谢朱秀云学姐
29、在我论文中的热心帮助和耐心的解答。同时我还要感谢实验室里郭朝阳师兄雷婷学姐等在我论文实验环节中的帮助。没有他们的帮助是没有办法完成论文的。同时在实验室里也很庆幸能够认识这么多的同学,是他们让我懂得了团结互助的力量,很开心,也很感激。 论文做到这才明白，做学问搞研究，真的不是一件容易的事情，但我们必须学会在苦中作乐，把它变成一件快乐的事情。从论文选题到今天顺利完成，我经历了人生的一次考验，学到的远远超过论文本身，这样的经历也让我更加充满自信去面对未来的生活。在这个过程中，还有许多可敬的师长、同学朋友给了我无言的帮助，在这里无法一一提及，谢谢！在此,我再一次真诚的向帮助过我的老师、师兄师姐和同学表示感谢！ 董小英 2013 年 5月 25号
