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1、 甘氨酸亚铁的合成及表征摘要：本课题主要研究甘氨酸亚铁的合成及表征。主要采用了固相合成法合成甘氨酸亚铁，获得了甘氨酸与Fe2+离子摩尔比为1：1的甘氨酸螯合亚铁。关键词：甘氨酸亚铁；螯合；固相法Synthesis and Characterization of Ferrous GlycineAbstract: The ferrous glycine was synthesized and characterized in this paper. The solid-phase synthesis method was employed，and ferrous glycinate which m
2、olar ratio of Glycine and Fe2+ was 1:1 was gain. At the same time, H2O2 and KSCN reagent was used for the qualitative analysis of ferrous glycine，and for the determination of the ferrous glycine chelated. Futhermore, some quantitative analysis of experiments were done, including the using of method
3、Ce to determine the total Fe2+, non-aqueous titration to determine of free glycine, Kjeldahl method to determine of the total glycine . Through these quantitative experiments, the chelation rate of ferrous glycine which prepared at first can be calculated.Key words: ferrous glycine, chelating, Solid
4、-phase synthesis目录1 绪论11.1 研究背景及意义11.2 甘氨酸亚铁合成及表征测定方法综述11.2.1 甘氨酸亚铁的合成11.2.2 甘氨酸亚铁的表征及各组分含量测定21.3 本课题的研究内容及目的62 实验部分72.1 仪器与试剂72.1.1 实验试剂72.1.2 实验仪器82.2甘氨酸亚铁的合成102.3甘氨酸亚铁定性分析102.3.1双硫腙指示剂定性102.3.2硫氰化钾指示剂定性112.4甘氨酸亚铁各组分含量的测定122.4.1总二价铁离子（Fe2+）的测定122.4.2游离甘氨酸含量的测定122.4.3总甘氨酸含量的测定133 结果与讨论153.1定性分析的结果和
5、讨论153.1.1双硫腙指示剂定性的结果和讨论153.1.2硫氰化钾指示剂定性的结果和讨论163.2定量分析的结果和讨论163.2.1二价铁（Fe2+）含量测定的结果和讨论163.2.2游离甘氨酸含量测定的结果和讨论173.2.3总甘氨酸含量测定的结果和讨论183.2.4螯合率的计算184 结论19致谢20参考文献211 绪论1.1 研究背景及意义缺铁性贫血是体内铁的储存不能满足正常红细胞生成的需要而发生的贫血。是由于铁摄入量不足、吸收量减少、需要量增加、铁利用障碍或丢失过多所至。形态学表现为小细胞低色素性贫血。缺铁性贫血不是一种疾病，而是疾病的症状，症状与贫血程度和起病的缓急相关。铁是血红蛋
6、白、肌红蛋白和多种酶系的重要组成成分，在体内起着营养、免疫等重要作用，它是畜禽所必须的重要微量元素之一。铁添加剂的发展经历的3个阶段，第一代为无机盐类，如硫酸亚铁、碳酸亚铁等；第二代产品为一些接单的有机化合物如柠檬酸亚铁，富马酸亚铁等；第三代为氨基酸络合铁，如甘氨酸铁。前两类均存在其应用弊端，无机盐类不仅吸收利用率差，而且容易造成环境污染、资源浪费，影响饲料中其他活性营养物质的吸收利用。而简单的有机化合物难以克服吸收利用率低的缺陷，不能充分满足动物体生长的需要。因此，需要研究开发安全高效的饲用铁添加剂的新产品，以克服一直沿用的微量元素的无机盐类添加剂的弊端。自17世纪，化学界发现并制备出络合物
7、以来，络合物的研究和应用在许多行业都得到了很大发展。20世纪70年代，微量元素氨基酸络合物的研究推动了络合物在动物营养中的应用。而甘氨酸是动物必需的营养源之一，动物营养研究工作者用其作为络合物，研究和开发出新一代微量元素氨基酸营养性添加剂甘氨酸亚铁。大量实验表明，甘氨酸亚铁成为了新型的微量元素添加剂，它具有较高的生物学效价，接近于动物体内天然形态的微量元素补充剂，可以完全被动物吸收和利用，具有良好的稳定性。如何更高效的合成甘氨酸亚铁，并标准的对其进行质检分析，使其在实际中广泛应用成了研究的课题。1.2 甘氨酸亚铁的合成及表征测定方法1.2.1 甘氨酸亚铁的合成甘氨酸钠盐制备：C2H5NO2+N
8、aOHC2H4NO2Na+H2O甘氨酸亚铁的制备：2C2H4NO2Na+2FeS047H2O+H2SO4Fe(C2H5NO2)2SO44H2OFeSO46H2O+Na2SO4+4H2O（1）水体系合成法目前水体系合成法是合成氨基酸微量元素螯合物的主要方法。不仅用单个氨基酸和金属离子的螯合，也用于复合氨基酸微量元素螯合物的螯合。此法存在工艺周期长，过程较难控制(要维持一定的温度和pH值)，成本高，废液污染等缺点；但能获得很高的产率。另外，一些复合氨基酸微量元素螯合物也是通过水体系来合成的，比单个氨基酸和金属元素的螯合只多了个水解的过程。一般都是利用一些废料来水解获得复合氨基酸，也有用豆粕来水解以
9、获得复合氨基酸的。实验证实，利用饲料级豆粕通过硫酸水解获得的复合氨基酸和硫酸锌螯合物，获得了92的螯合率。（2）固相合成法固相反应中，反应物的粉碎细化，有利于反应物之间的接触，提高了反应效率。固相合成法不仅适合于单个氨基酸与某个金属离子螯合成单项螯合物，且对于复合氨基酸微量元素螯合物的合成也很好。研究证实， 由固相合成的复合氨基酸铜的螯合率达938 。基本工艺：氨基酸+金属盐粉碎、混合加入引发剂微波辐射催化合成用乙醇、乙醚和蒸馏水充分洗涤纯化产物滤渣真空干燥优点是合成操作简单、耗时少、成本低廉、副产物少；制得的产品纯度高。但其原料主要是醋酸盐等有机盐，价格较高；若用价格较低的强酸盐为原料合成氨
10、基酸螯合物，副产物在微波作用下，易引起产物焦糊。其合成中如何快速清除副产物，提高反应物的接触程度，有效控制反应温度都是要解决的问题。（3）小结由于氨基酸与亚铁离子，不仅会络合生成新产物，而且会螯合生成其他的产物。但氨基酸成本较高，而产品的主要作用是为了补充铁元素，防止贫血。所以选取氨基酸含量比例较小的产物，减小成本，达到与其他产物相同的作用。水体系法虽然产率高，但需消耗更多的氨基酸，成本也随之增大，不适合盈利。最终选取固相合成法来制取甘氨酸亚铁。1.2.2 甘氨酸亚铁的表征测定（1）红外光谱分析将纯化后的甘氨酸亚铁产品做红外光谱分析，并和纯品甘氨酸比较（结果见图1、图2）。从图中可以看出：甘氨
11、酸的红外光谱在26003100cm-1有较强宽谱带，这是NH3+的特征吸收峰，而甘氨酸亚铁的红外光谱中无此吸收峰，说明甘氨酸亚铁中没有游离的NH3+，同时，甘氨酸在2100cm-1处有一个较强的吸收峰，这是-氨基酸的特征吸收峰，而甘氨酸亚铁中无此吸收峰。因此可以确定甘氨酸亚铁中没有游离的甘氨酸存在。（2）晶体结构分析单晶X射线衍射（X射线晶体学）是一种广泛应用的分析技术，它使用X射线准确测定结晶样品中各原子的实际位置。利用单晶体对X射线的衍射效应，可计算晶胞的电子密度图。从图赏可以直接得到原子的晶胞中的位置，从而测定出晶体结构和分子结构，分析检测结果： 晶系：三斜 空间群：P1(2#) 晶胞参
12、数： a=5.988(4) A0 b=6.790(6) A0 c=13.396(8) A0 =85.40(3)0 =82.92(2)0 =83.06(3)0 晶胞体积 V=535.4(6) A03，单位晶胞分子数Z=1 注：1 A0=0.1nm 结构因子 R1=0.027，S=1.008， 空间结构（图3）：（3）合成甘氨酸亚铁定性分析双硫腙指示剂：金属微量元素的氨基酸螯合物在甲醇中的溶解度很小，而无机金属离子在甲醇中的溶解度较大。用甲醇来提取氨基酸螯合物商品时，如果金属微量元素螯合完全，则几乎没有金属离子进入甲醇提取液。在甲醇提取液中滴入显色剂双硫腙后，任然显示双硫腙本身的蓝绿色。如果金属微
13、量元素螯合不完全，则有较多的金属离子进入甲醇提取液。在甲醇提取液中滴入显色剂双硫腙后，双硫腙和金属离子显红色至红紫色。 硫氰化钾指示剂：金属微量元素的氨基酸螯合物在甲醇中的溶解度很小，而无机金属离子在甲醇中的溶解度较大。用甲醇来提取氨基酸螯合物商品时，如果金属微量元素螯合完全，则几乎没有金属离子进入甲醇提取液。在提取液中加入双氧水后，溶液中的亚铁离子氧化为铁离子。硫氰化钾对铁离子显红色。（4）总二价铁（Fe2+）含量的测定（铈量法）即采用四价铈盐溶液作滴定剂的容量分析方法。1861年由 L.T.兰格建立。在酸性溶液中，Ce4+与还原剂作用，被还原为Ce3+。(Ce4+/Ce3+)1.61伏。在
14、18高氯酸溶液中，+1.70+1.87伏；在 18硝酸溶液中，-1.44-1.42伏；在盐酸溶液中，Ce4+不很稳定，会缓慢地将Cl-氧化为Cl，随着酸度的增高，氧化速率也增高，但在硫酸存在下，氧化速率会减低。所以，实际上常用硫酸铈的硫酸溶液作滴定剂，它非常稳定。而在硝酸或高氯酸溶液中,在光的作用下，Ce4+会缓慢地被水还原,使其浓度逐渐下降。Ce4+易水解而生成碱式盐沉淀，因此不适合在弱酸性或碱性溶液中滴定。 在铈量法中，虽然Ce4+具有黄色，Ce3+为无色，但由于Ce4+的黄色不够深,不能作为指示滴定终点的自身指示剂，要选用适当的氧化还原指示剂，如邻二氮菲亚铁指示剂，铈量法的滴定曲线见图：
15、（5）游离甘氨酸含量的测定（非水滴定）非水滴定法是在非水溶剂中进行的滴定分析方法。非水溶剂指的是有机溶剂与不含水的无机溶剂。以非水溶剂作为滴定介质，不仅能增大有机化合物的溶解度，而且能改变物质的化学性质，使在水中不能进行完全的滴定能够顺利进行，从而扩大了滴定分析的应用范围。温度变化对滴定介质冰醋酸影响较大，冰醋酸的凝点为15.6，当室温低于15.6，滴定液就会凝结在滴定管中，因此滴定温度应控制在20以上。冰醋酸的膨胀系数较大，为0.0011，即温度改变1，体积就有0.11%的变化，所以当使用与标定温度相差在10以内。由于水分的存在，将严重影响电位滴定曲线的突跃的指示剂颜色的变化，影响终点的灵敏
16、度，所有仪器，供试品中均不得有水分存在，所用的试剂的含水量均应在0.2%以下，必要时应加入适量的醋酐以脱水。（6）总甘氨酸含量的测定（凯氏定氮法）样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4，反应式为：2NH2-+H2S04+2H+(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为: (NH4)2SO4
17、+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O用已知浓度的H2SO4（或HCl）标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量：（NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO31.3 课题的研究内容及目的本课题主要研究以最大的经济效益获得含铁量更高的补铁产品。从甘氨酸亚铁的合成起，使甘氨酸与亚铁离子1：1螯合，追求使用更少的甘氨酸使亚铁离子被螯合，避免其以无机游离形式存在。对合成完毕的产品，进行各方面含量的检测，不断改善，使游离的各组分含量不断减少，提高动物体对亚铁离子的吸收。2 实
18、验部分2.1 仪器与试剂2.11 实验试剂试验中所使用试剂及规格见表2.1 表2.1 实验试剂一览表试剂名称分子式规格浓度备注甘氨酸C2H5NO2AR固体白色晶体粉末7水合硫酸亚铁FeSO47H2OAR固体浅蓝色晶体粉末氢氧化钠NaOHAR固体白色块状固体硫酸H2SO43mol/L，10%，98%无色粘稠状液体盐酸HClAR0.01mol/L无色透明液体双硫腙氯仿溶液C13H12N4S0.001%蓝黑色结晶，将1mg双硫腙溶于100mL氯仿中，蓝黑色溶液过氧化氢H2O230%无色透明液体硫氰化钾指示溶液KSCN无色透明溶液无水甲醇CH3OHAR无色透明液体，不含水份硫酸铈标准滴定溶液Ce2(S
19、O4)3 8H2O0.1mol/L磷酸溶液H3PO4AR10%无色透明溶液二苯胺磺酸钠指示液C12H10NNaO3S氧化还原指示剂，露置空气中变色冰乙酸CH3COOHAR98%以上14摄氏度以下为固体结晶紫指示剂溶液不易长久保存高氯酸标准滴定溶液HClO40.1mol/L混合催化剂0.4g硫酸铜，5个结晶水，6g硫酸钾磨碎混匀混合指示剂甲基红0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿0.5%乙酸溶液两溶液等体积混合硼酸H3BO3AR2%硼酸吸收液H3BO31%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL,0.1%甲基红乙醇溶液7mL,4%氢氧化钠水溶液0.5mL,混合。2.12 实验仪器仪器名
20、称备注电子天平型号：BS224S研钵药匙玻璃棒恒温器烧杯50mL，250mL，500mL,1000mL试管外径（mm）长度（mm）：15150、18180、25200等滴定管酸式滴定管与碱式滴定管锥形瓶250mL量筒10mL，100mL容量瓶250mL，1000mL消煮管自动回零装置凯氏蒸馏装置2.2 甘氨酸亚铁的合成所需药品：甘氨酸，7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)，NaOH（固体） 硫酸溶液（3mol/L）仪器：电子天平，研钵，药匙，恒温器，玻璃棒合成原理：C2H5NO2+NaOHC2H4NO2Na+H2O2C2H4NO2Na+2FeSO47H2O+H2SO4Fe(C2H5NO2)2S
21、O44H2OFeSO46H2O+Na2SO4+4H2O 计算甘氨酸与7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)质量比为 75:278实验步骤：1. 称取甘氨酸6.0096g，倒入研钵中，此时为白色晶体。2. 加入水1.2mL，研磨3分钟，甘氨酸变潮湿。3. 加入NaOH固体0.5172g，加水0.5mL，研磨搅拌5分钟，甘氨酸变为白色糊状，测得pH为10-11。4. 称取7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)22.2371g，倒入研钵，硫酸亚铁与甘氨酸接触部分瞬间变为墨绿色。5. 保持温度70摄氏度，研磨搅拌，混合物逐渐变为墨绿色糊状。搅拌1分钟不到，混合物突然变硬，难以搅拌。用药匙刮下，保持70摄氏
22、度研磨半小时。混合物呈墨绿色块状固体。6. 加入3mol/L硫酸2.4mL调节pH，边加入，边研磨。混合物逐渐变为土黄色。用湿润的pH试纸测定pH，为3-4。7. 将合成的甘氨酸亚铁刮下，呈土黄色颗粒粉末状，称量，26.3446g注意事项：加入7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)研磨一段时间后，混合物会突然变硬，变为墨绿色，此时一定要继续充分研磨，使其与甘氨酸充分反应。研磨到后期，注意土黄色产品中夹杂的墨绿色点，尽量研磨，使其消失参与反应。2.3 甘氨酸亚铁的定性分析2.31双硫腙指示剂定性所需药品：待测样品（甘氨酸亚铁） 双硫腙（0.001%氯仿溶液：将1mg双硫腙溶于100mL氯仿中） 无
23、水甲醇 7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)仪器：电子天平，药匙，玻璃棒，烧杯，试管实验原理：金属微量元素的氨基酸螯合物在甲醇中的溶解度很小，而无机金属离子在甲醇中的溶解度较大。用甲醇来提取氨基酸螯合物商品时，如果金属微量元素螯合完全，则几乎没有金属离子进入甲醇提取液。在甲醇提取液中滴入显色剂双硫腙后，任然显示双硫腙本身的蓝绿色。如果金属微量元素螯合不完全，则有较多的金属离子进入甲醇提取液。在甲醇提取液中滴入显色剂双硫腙后，双硫腙和金属离子显红色至红紫色。实验步骤：1. 称取甘氨酸亚铁与7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)各含等量的金属元素（约25-50mg）分量，按各含25mg金属元素计算，
24、称取7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O) 124.1mg，甘氨酸亚铁58.0mg。2. 分别取两个100mL烧杯，倒入50mL无水甲醇，室温下搅拌30分钟，使其充分溶解，7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)完全溶解，而甘氨酸亚铁几乎不溶。过滤甘氨酸亚铁浑浊液，取其清液。取3支干净，干燥的试管，各加入5mL配制的双硫腙氯仿溶液。取7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)溶液与甘氨酸亚铁溶液各5滴，滴入双硫腙氯仿溶液，观察现象。注意事项：滴加样品后双硫腙可能不会立即显色，需要等待较长时间。如果仍不变色，可以考虑多滴加几滴样品溶液。静置继续等待。2.32硫氰化钾指示剂定性所需药品：待测样品（甘氨酸亚铁）
25、 双氧水（H2O2），硫氰化钾（KSCN） 无水甲醇 7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)仪器：电子天平，药匙，玻璃棒，烧杯，试管实验原理：金属微量元素的氨基酸螯合物在甲醇中的溶解度很小，而无机金属离子在甲醇中的溶解度较大。用甲醇来提取氨基酸螯合物商品时，如果金属微量元素螯合完全，则几乎没有金属离子进入甲醇提取液。在提取液中加入双氧水后，溶液中的亚铁离子氧化为铁离子。硫氰化钾对铁离子显红色。Fe3+（SCN）-=Fe（SCN）3实验步骤：1. 称取甘氨酸亚铁与7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)各含等量的金属元素（约25-50mg）分量，按各含25mg金属元素计算，称取7水合硫酸亚铁(FeSO
26、47H2O) 124.1mg，甘氨酸亚铁58.0mg。2. 分别取两个100mL烧杯，倒入50mL无水甲醇，室温下搅拌30分钟，使其充分溶解，7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)完全溶解，而甘氨酸亚铁几乎不溶。过滤甘氨酸亚铁浑浊液，取其清液。3. 取2支干净，干燥的试管，各加入上述配制的两种溶液5mL。向两支试管中各滴加1滴双氧水，轻微震荡。然后各滴加1滴硫氰化钾（KSCN）显色剂，观察现象注意事项：双氧水氧化性较强，所以需要确保，溶液中没有未溶解的样品，否则会把为溶解的甘氨酸亚铁中的亚铁氧化，这样无法表明样品是否螯合。2.4 甘氨酸亚铁各组分含量的测定2.41总二价铁离子（Fe2+）含量的测
27、定所需药品：测定样品（甘氨酸亚铁） 硫酸铈标准滴定溶液：cCe(SO4)2=0.1mol/L 5%硫酸溶液，10%磷酸溶液 二苯胺磺酸钠指示液仪器：电子天平，药匙，烧杯，玻璃棒，滴定管，锥形瓶实验原理：Fe2+ Ce(SO4)2 =Ce3+Fe3+3SO42- 利用二苯胺磺酸钠指示液不同的显色性质辨别滴定终点实验步骤：1. 试样溶液配制：称取甘氨酸亚铁约2.0055g，倒入100mL烧杯中，加入5%硫酸60mL，加入10%磷酸溶液20mL，然后注入100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度线。溶液出初始显浅黄色，放置长时间后显无色。2. 用移液管移取25mL甘氨酸亚铁溶液，置于锥形瓶中，再加入25
28、mL蒸馏水，滴入4滴二苯胺磺酸钠指示液。3. 用硫酸铈标准滴定溶液滴定溶液。终点现象：溶液初始为无色透明，滴加工程中，逐渐变为黄色透明溶液，当滴入最后一滴硫酸铈标准滴定溶液时，溶液突然变为紫红色，空气中放置一会，溶液又变为墨绿色，再滴加2-3滴，溶液再次变为紫红色，放置不变色，判定为滴定终点。4. 做平行实验。注意事项：虽然Ce4+具有黄色，Ce3+为无色，但由于Ce4+的黄色不够深,不能作为指示滴定终点的自身指示剂，要选用适当的氧化还原指示剂，如二苯胺磺酸钠指示剂2.42游离甘氨酸含量的测定所需药品：甘氨酸亚铁，冰乙酸，结晶紫指示剂溶液，高氯酸标准滴定溶液仪器：自动回零滴定装置，锥形瓶，量筒
29、，电子天平，药匙实验原理：以冰乙酸为溶剂，结晶紫为指示剂，高氯酸标准溶液为滴定剂，反应生成氨基乙酸的高氯酸盐。实验步骤：1. 称取1g甘氨酸亚铁，置于250mL锥形瓶，加入30mL冰醋酸溶解（样品大部分难以溶解），加入2-4滴结晶紫指示剂。溶液此时显紫红色。2. 用高氯酸标准滴定溶液滴定，溶液由紫红色变为蓝绿色为滴定终点。3. 做平行实验。注意事项：整个实验不能引入水份。以非水溶剂作为滴定介质，不仅能增大有机化合物的溶解度，而且能改变物质的化学性质，使在水中不能进行完全的滴定能够顺利进行，从而扩大了滴定分析的应用范围。由于水分的存在，将严重影响电位滴定曲线的突跃的指示剂颜色的变化，影响终点的灵
30、敏度，所有仪器，供试品中均不得有水分存在，所用的试剂的含水量均应在0.2%以下，必要时应加入适量的醋酐以脱水。2.43总甘氨酸含量的测定所需药品：测定样品(甘氨酸亚铁) 硫酸：98%化学纯 混合催化剂 硼酸：化学纯，2%水溶混合指示剂盐酸标准溶液：0.01mol/L硼酸吸收液仪器：电子天平 凯氏烧瓶 凯氏蒸馏装置（右图） 锥形瓶 容量瓶 消煮管实验原理：样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生
31、成（NH4）2SO4，反应式为：2NH2-+H2SO4+2H+(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为: (NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量：（NH4)2B4O7+2HCl+5H2O2NH4Cl+4H3BO3实验步骤：1. 称取甘氨酸亚铁0.03-0.05g样品，置于干净的煮解瓶中，加入0.5g催化剂混合物以
32、及3-4mL硫酸。将煮解瓶呈450斜置。用小火加热使其溶解，然后强火沸腾，反应物先变黑，然后渐渐变为透明兰绿色。再煮解5分钟，冷却，加3mL水再冷却。2. 在通气的情况下。打开B夹，将消化液经加料漏斗E转入蒸馏器D中（用少量水冲洗多次，直至E内不显酸性）将磨口塞F塞好后，E中加入15毫升40%NaOH溶液备用。3. 吸收瓶G中加入10mL饱和硼酸溶液及4滴混合指示剂，此时吸收液显红紫色，打开冷凝水。4. 将吸收瓶G提高到使冷凝管出口刚好插入吸收液的液面以下。夹住B，通入蒸汽，适当旋转磨口塞F，慢慢从E中加入预先装好的NaOH溶液（反应液由兰绿色变为土黄色，还有大量沉淀），待剩下0.5mL左右时
33、，加入少量水冲洗，再慢慢放入。注意：磨口塞始终要液封，加入过程小心，防止倒吸。最后再继续蒸馏1分钟，用水冲洗冷凝管末端，检验蒸出液不显碱性，蒸馏结束。5. 用0.01mol/L标准盐酸滴定吸收液，溶液由绿色变为蓝紫色时，为终点。6. 做平行实验。注意事项：a) 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。b) 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。c) 硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。d) 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶
34、底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。e) 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。 f) 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。 g) 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。 h) 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。 i) 以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。 j)
35、 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物Cu(NH3)42+ k) 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。3 结果与讨论3.1 定性分析的结果和讨论3.11 双硫腙指示剂定性的结果和讨论实验结果：滴入溶液的两支时光上层浮有红紫色液体，震荡试管后消失。在室温下长时间放置，滴加7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)溶液的双硫腙逐渐变为红紫色，而底价甘氨酸亚铁溶液的双硫腙虽也有些微变色，但并不明显。2支
36、试管有明显颜色差异，而滴加甘氨酸亚铁溶液的双硫腙溶液，与未滴加任何溶液的原双硫腙溶液试管颜色基本无差异。以此区别微量元素氨基酸螯合物与无机盐金属元素。讨论：双硫腙显色对样品的量和显色时间比较难以控制。显色剂比较灵敏，溶剂中，玻璃器皿中参杂的一些金属元素都会影响显色，导致结果难以判断。3.12 硫氰化钾指示剂定性的结果和讨论实验现象：7水合硫酸亚铁(FeSO47H2O)明显变为血红色，而甘氨酸亚铁溶液虽也变色，颜色却十分浅，两支试管颜色有明显差异。以此区别微量元素氨基酸螯合物与无机盐金属元素。讨论：过氧化氢具有很强的氧化性，会使螯合的二价铁离子也转化为三节铁离子，影响实验，所以要过滤得尽量完全。
37、最后，滴加硫氰化钾后，甘氨酸亚铁也些微变色，说明甘氨酸亚铁中也有极少量的游离的亚铁离子。3.2 定量分析的结果和讨论3.21二价铁（Fe2+）含量测定的结果和讨论数据记录：第一份样品溶液第二份样品溶液滴定液初读数（mL）0.000.02滴定液末读数（mL）17.4217.47消耗滴定液（mL）17.4217.45计算公式：亚铁含量()= （CxVx0.05585）/(mx25.00/100)x100 0.5585与1.00mL硫酸铈标准溶液(c=1.000mol/L)相当的铁的质量，单位为克（g）C为硫酸铈标准溶液的摩尔浓度(molL)；V为消耗硫酸铈标准溶液的体积(mL)；m为样品的质量(g
38、)。数据计算：第一份溶液亚铁含量为：（0.1x17.42x0.05585）/（2.0055x25.00/100）x100%=19.40% 第一份溶液亚铁含量为：（0.1x17.45x0.05585）/（2.0055x25.00/100）x100%=19.44% 平均亚铁含量为：19.42% 平均相对偏差为：0.21%讨论：硫酸铈标准溶液不必标定配制的标准溶液非常稳定，可长期放置。当加热时，它也是稳定的，因此有利于测定在室温下不易被氧化的有机化合物。反应中没有中间价态的产物生成，反应很简单，不像高锰酸钾滴定法和重铬酸钾滴定法那样，会引起诱导反应或其他有干扰的副反应。3.22游离甘氨酸含量测定的结
39、果和讨论数据记录：高氯酸标准滴定溶液浓度：0.1333mol/L第一份样品溶液 第二份样品溶液甘氨酸亚铁质量（g）0.99791.0243高氯酸滴定液初读数（mL）0.000.04高氯酸滴定液末读数（mL）0.720.81消耗高氯酸体积（mL）0.720.81计算公式：游离甘氨酸（%）=cxVx0.07507/m x100C高氯酸标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）V试样消耗高氯酸标准滴定液的体积，单位为毫升（mL）0.07507与1.00mL高氯酸标准滴定溶液c(HClO4)=1.000mol/L相当的氨基乙酸的质量，单位为克（g） m试样的质量，单位为克（g）数据计算：第一份试样游
40、离甘氨酸含量（%）=（0.1333x0.72x0.07507/0.9979）x100%=0.72% 第二份试样游离甘氨酸含量（%）=（0.1333x0.83x0.07507/1.0243）x100%=0.79%平均游离甘氨酸含量（%）=0.76%平均相对误差（%）=9.21%讨论：整个实验不能引入水份，由于水分的存在，将严重影响电位滴定曲线的突跃的指示剂颜色的变化，影响终点的灵敏度，所有仪器，供试品中均不得有水分存在，所用的试剂的含水量均应在0.2%以下，必要时应加入适量的醋酐以脱水。由于游离甘氨酸的含量非常少，需要视实际情况调整滴定标准液的浓度与测定甘氨酸亚铁的量。3.23 总甘氨酸含量测定
41、的结果和讨论数据记录：盐酸标准滴定溶液浓度：0.01107mol/L第一份样品溶液第二份样品溶液甘氨酸亚铁质量（g）0.04690.0475盐酸滴定液初读数（mL）0.000.03盐酸滴定液末读数（mL）10.2310.72消耗盐酸溶液（mL）10.2310.69计算公式：甘氨酸（%）=(VxCx0.0140x6.25/m)X100 V滴定试样消耗的盐酸体积；mL C盐酸的浓度；mol/L m试样的质量；g 0.0140每毫克量氮的克数 6.25氮换算成蛋白质的平均系数数据计算：第一份试样甘氨酸含量（%）=（10.23x0.01107x0.0140x6.25/0.0469）x100%=21.1
42、7% 第二份试样甘氨酸含量（%）=（10.69x0.01107x0.0140x6.25/0.0475）x100%=21.80% 平均总甘氨酸含量（%）=21.49% 平均相对偏差(%)=2.9%讨论：样品消煮完毕后，溶液并非透明澄清液，有白色乳状沉淀，可能是因为样品中有无法消解成分。实验整个凯氏定氮装置要保持密闭，防止生成的NH3泄露，导致最后含氮量偏少，特别是加入NaOH过程中保持液封。加入NaOH过程中需要非常小心，NaOH的加入会使反应非常剧烈，会引起倒吸。实验结束记得冲洗冷凝管的内外壁，因为倒吸使得管壁粘附了少量的氮。3.24 螯合率的计算螯合率（%）=（总甘氨酸含量游离甘氨酸含量）/
43、总甘氨酸含量 =（21.49% 0.76%）/21.49% =96.46%4 结论：运用固相合成法，获得了较满意的1：1螯合的甘氨酸亚铁产品。产品呈土黄色粉末状，在水中有很大的溶解度，难溶于绝大多数有机溶剂。将产品溶于有机溶剂并过滤，可以使游离的亚铁离子分离，并对分离液使用金属离子显色剂，可以初步地判断产品是否螯合成功。通过对其各组分含量的测定，发现未参加螯合的游离亚铁离子与游离甘氨酸的量非常少，螯合率非常高，达到了96.46%，说明原料的利用率非常高，并没有过多的浪费。致谢在郭晓明老师的悉心指导下，此论文得以很好地完成。在论文的选题、构思阶段，和资料的收集方面，郭老师都给于了极大的引导和帮助
44、，使很多问题等到实际的解决。在最后的论文撰写与修改时期，郭老师都给予了详细而认真的指导。特别是他严谨的科学态度，渊博的理论知识与实践知识，敏锐的科学思维和忘我的工作精神是学生永远的学习榜样。值此论文完成之际，我谨向郭老师表示衷心的感谢。同时，感谢各位实验室工作的老师，对我的论文实验给予了最大的方便，使我能专心于解决自己的问题，不受仪器、药品方面的影响。参考文献1 顾天爵、生物化学M，北京：人民卫生出版社，1988，284-2872 Wider EA、Batlle DC、Tigier HAD 、Amino laevuli Nate synthetase in extracts of cultured soybean cells J，Bioc him Biophys Acta，1971，235：511-5173 欧阳培、何灌生，细胞内的金属螯合物M， 西安：陕西科学技术出版社，1989，85- 964 Vogel W 、Richert D A 、Pixley B Q、 Heme synthes
