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1、巴黎重楼叶多糖提取工艺及其抗氧化活性研究摘要 在单因素分析的基础上，利用中心组合设计实验优化巴黎重楼叶多糖的提取条件。设置三个独立的变量，包括提取温度（），水料比和时间（h)并研究其对多糖得率的影响。采用多元回归分析和统计学方法对拟合一个二次多项式方程实验数据进行。 最佳工艺条件为：提取温度为90.8，水料比为21.3:1，提取时间为4.8h。在最佳条件下，实验的回收率为54.18%，与模型预测值匹配。此外，纯化的多糖对DPPH自由基、羟自由基离子和超氧阴离子自由基有很强的抗氧化作用。关键字 重楼 优化 多糖 抗氧化1.引言巴黎滇重楼，广泛分布在中国的西南地区，长时间被作为中药使用。它能有效的
2、消肿、有效的减轻疼痛、消除咽喉肿痛、治疗蛇毒咬伤和擦伤1。巴黎滇重楼中有许多生物活性成分，如皂甙，蜕皮激素，植物甾醇和黄酮甙2。它们被广泛应用于抗肿瘤、抗菌、止血和镇痛3。多糖是高分子碳水化合物结构，形成重复单元由糖苷键连接在一起4。因为多糖特殊的理化性质和生物活性高，所以对多糖的研究受到了许多关注5。然而，一些研究已经从云南滇重楼叶多糖（PPLPs)提取中开展了。热水提取技术是常用的植物多糖的提取方法，已经被广泛应用于许多研究6。在提取过程中，提取率是由多个独立变量影响的。因此，开发一个可以确定所有因素的优化方法是必要的。另外，要确定最佳提取条件就应该考虑自变量之间的相互作用。当自变量有一个
3、联合的效果的时候，响应面法（RSM）在优化工艺方面是一种有效的统计技术。RSM的优化过程比传统方法需要较少的材料和时间7是一种典型的响应面设计。在本设计中，处理结合在试验点，轴点，中心点。设计是旋转（或接近旋转），要求每一个因子五水平。与传统方法相比CCD能更有效的进行试验。活性氧是细胞代谢过程中产生的副产品。过多的自由基会引起许多疾病，如癌症、心血管疾病、动脉粥样硬化。抗氧化剂和癌症治疗的常规药物，如BHA、BHT和TBHQ的疗效有限并且有显著的毒性8。多糖是一种天然的生物大分子，广泛存在于生物界中。因为多糖具有抗氧化、抗癌和免疫活动，所以植物多糖引起了极大的关注。9。然而，很少资料是研究P
4、PLPs的。本研究的目的是调查关键变量（提取温度，提取时间和水料比）并进一步优化pplps的提取工艺。另外，对获得纯化的多糖及其抗氧化活性进行了评价。2.材料与方法2.1材料和试剂将巴黎重楼叶干燥，将干燥的材料用粉碎机，然后过60目筛。将巴黎重楼叶粉末分别用石油醚（60-90）和乙醇在索氏抽提器中回流5小时。脱脂后将粉末干燥，室温下放置在干燥器中保存。乙醇，苯酚，硫酸，和葡萄糖分别来自成都科隆化工厂购买。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），1,10-菲咯啉，,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氮蓝四唑（NBT）购自西格玛化学公司。所有化学试剂均为分析纯。2.2提取pplps每个预处理粉
5、末（1.0克），在设定的提取温度，水料比和提取时间下萃取多糖。将所得的悬浮液通过离心（5000r/min,10分钟）分离。收集上清液并加蒸馏水补至100ml。采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量10。使用葡萄糖作为标准，并将结果表示为葡萄糖当量。2.3实验设计通过单因素实验确定提取变量的初步范围。设计一个五水平三因素的CCD用于优化pplps的提取率的最佳变量组合。分别选择提取温度（X1），水与原料的比例（X2），和提取时间（X 3）用于多糖的提取率待优化的独立变量。三个变量和五个水平的范围如表一所示。提取率（Y）被作为对三个变量在表2中的相互作用的响应。根据等式三个变量进行编码： xi -x0 X
6、i= i=1,2,3 (1) X其中X是独立变量的编码值，Xi独立变量的实际值，X0是自变量的中心点的实际值，和x为变量的阶跃变化。该系统的行为由下列二次方程解释： 3 3 2 3Y=A0+AiXi +AiiXi+AijXij (2) i=1 i=1 i=1i=1 其中Y是预测响应，A0是一个常数，AI，AII和AIJ是由模型估计系数，以及XI和XJ是独立变量。这些数值分别代表的是截距，线性，二次互动变量的影响在响应面中的情况。该模型评价三个变量的影响。所有实验均重复三次。来估计自变量的响应，实验设计进行分析，并使用设计专家软件预测的数据进行了计算11。随后，三个额外的实验以验证统计实验策略的
7、有效性。2.4制备和多糖的纯化取预处理的样品（100.0 g），采用优化的条件下热水提取方法提取PPLPs溶液。将悬浮液以5000rpm离心10分钟，并且将上清液收集并浓缩至约100毫升。浓缩液采用Sevag法除蛋白12。四体积的乙醇加入到浓缩物中，并将混合物在4保持12小时。收集沉淀物并真空干燥获得PPLPsPPLPs（1.0克）溶解在去离子水中。该溶液通过DEAE-纤维素DE-52柱（3厘米60厘米）膜过滤（0.45微米; 直径）。用水平衡后，将柱用梯度的NaCl水溶液（0-1.00摩尔/毫升）水洗。将洗脱物收集到10毫升每管并用苯酚 - 硫酸法确定每管多糖的总含量。主适当部分（纯化的多糖
8、）收集，透析，并冻干，并指定为PPLP。在使用之前，PPLP溶解在去离子水，并根据需要稀释成各种浓度。2.5抗氧化活性的检测方法2.5.1对DPPH自由基清除作用的影响根据13的方法并略有改动做多糖对DPPH自由基的清除作用实验。在一个典型的方法中，将2毫升样品溶液（0.05，0.1，0.3，0.5，0.7，以及0.9毫克/毫升）和2ml的DPPH的乙醇溶液（0.1毫摩尔/升）混合，混合物在25下反应30分钟。反应液在517nm处测定吸光度。DPPH自由基清除效果，计算用下面的公式：清除效果（%）=（1-AS/AC）100其中，AS是样品和DPPH溶液的混合物的吸光度，和AC是控制反应的其中样
9、品被替换乙醇的吸光度。2.5.2对羟基自由基清除作用的检测羟基自由基测定按照文献的方法14稍作修改。在一个典型的方法中加入1.0ml样品溶液（0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0毫克/毫升）再加入邻二氮菲（5mM的1.0毫升），磷酸盐缓冲液（50mM，PH值7.4），硫酸亚铁（7.5毫，0.5毫升），和H 2 O 2（0.1，0.5毫升）在37下保温1小时。在510 nm波长下用光谱仪测定混合物的吸光度。羟基自由基的清除效果，计算用下面的公式：清除效果（%）=（1-AS/AC)100其中，AS是样品和反应溶液的混合物的吸光度，和AC是控制反应的其中样品代替去离子水的吸光度。
10、2.5.3对超氧阴离子自由基清除作用的测定方法对超氧阴离子自由基的清除作用的测定方法按文献方法15略有修改。在一个典型的方法中，PPLP溶解在水中，稀释成一系列不同浓度的样品溶液（0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0毫克/毫升），每个样品溶液加入 1毫升16毫摩尔/毫升的Tris-HCl（PH8.0，含有557u M + NADH），1毫升16毫摩尔/毫升的Tris-HCl（PH8.0含有108 uM + NBT），和1毫升16毫摩尔/毫升Tris-HCl中（PH混合8.0，含45uM的PMS)。将反应混合物在25下保温5分钟，并在560nm处测定吸光度。计算用下面的公式：
11、清除效果（%）=（1-AS/AC)100%其中，AS是样品的平均吸光度值，AC为对照的平均吸光度值。3. 结果与讨论3.1单因素实验分析3.1.1提取温度对PPLPs提取率的影响 当提取时间为3小时，水与原料的比率为30：1时研究了温度对提取效率的影响，提取过程中进行了在60，70，80，90，和100。当温度60提高到90提取率升高。如图1（a）所示，提取温度持续上升90是，提取率提高到了最大量49.15，然后提取率不在增大。因此，85-95C的温度范围内被选为最优的CCD的实验。3.1.2提取时间对PPLPs产量的影响提取时间是影响萃取效率的另一因素。提取过程中当水与原料的比率为30：1，
12、温度在80是时，提取时间（2，3，4，5，和6小时）对产率的影响，设计表如图1（b）。当提取时间变化从2小时至6小时，提取效率提高和PPLPs产量在4小时时达到最大值的46.44，然后随时间降低。结果表明在本实验中4-6小时时的范围被认为是最佳的提取时间范围。3.1.3水与原料的比例对pplps提取率的影响水与原料的比例是本实验的重要提取参数，它可以显著的影响萃取效率。在本研究中，在提取温度为80，提取时间为3小时的条件下，水料比设定为10:1，20：1，30:1，40:1和50:1，实验结果如图1(c)所示，当提取效率提高到47.22%时，水料比达到30:1，当水料比提高时，提取效率下降。因
13、此，水料比的最佳范围在20:1-40:1时，有利于pplps的提取。3.2 pplps的提取条件3.2.1预测模型和统计分析RSM实验设计矩阵和相应的结果如表2，RMS实验设计三个独立变量，包括萃取温度（X1），水与原料的比率（X2）和提取时间（X3）。基于CCD的实验数据多元回归分析，预测的模型表示由下述的二次多项式方程：Y = 53.41 + 2.06X1 1.19X2 + 0.35X3 + 1.21X1X2 0.55X1X3 0.88X2X3 1.72X12 0.97X22 0.64X32 (3) 其中Y是多糖的预测的良品率，X1，X2和X3分别代表提取温度，水料比和提取时间。进行方差分
14、析（ANOVA）来评估预测模型和变量。p值被用作一种工具来检查每个系数的意义，并表示变量之间的相互作用的模式。p的值是越小，越显著相应系数。甲显著缺乏合适的显示，拟合模型失败未能代表在该点不包括在回归中的实验域的数据。方差分析对提取效率的拟合二次多项式模型示于表3中。“模型F-价值”54.75隐含的模式是显著。一个“F型价值”有只有0.01（ P 0.0001）的机会出现偏差。同时，“缺乏合适的F值”2.77暗示缺乏合适的不显著，相对于纯的错误。“缺乏合适的F值”这个大的有14.37%，P = 0.1437）的发生机会发生偏差。决定系数（R2）表明，98.03%的变化可以通过拟合模型解释。调整
15、后的决定系数的值为0.9626，这也证实了该模型是高度显着的。此外，变异系数相对较低的值（1.09%）显示高精度和大量的可靠性实验值。“足够的精度测量的信噪比。大于4的比例是可取的。21.10的比例表明适当的信号。因此，实验结果表明，该模型可用于导航的设计空间。回归系数的值（3）如表3所示，所有的系数均显著（P 0.05），包括线性项系数（X1，X2和 X3），交互项的系数（X1X2，X1X3和X2X3），和二次项系数（X12，X22和X32）。经验模型转化为三维（3D）和等高线图来预测的自变量和响应之间的关系。3.2.2提取方法的优化 回归公式的图形由表三（3）中使用设计专家评估独立变量的影
16、响以及它们对PPLPs的提取效率的相互作用获得的。在响应面图和等高线图，PPLPs的提取效率有两个连续变量研究沿，而另一个变量保持在其零电平。多糖的提取效率受提取温度，水与原料的比例，并提取时间的影响结果如示图2所示，.受提取温度和水与原料比多糖的提取率示于图2（a），并且（a1）具有固定在零电平（4小时）提取时间。提取温度由85到89.35多糖的产量明显增加。然而，除了89.35，提取率下降非常缓慢，随着温度上升。根据提取温度和提取时间的响应面和等高线图显示在图2（b）和（b1）的水到原料固定比率在零电平（30：1）。多糖产量的增加可以显著伴随提取温度的增加而增加。提取率随着时间的增加，从3
17、小时到4.5小时迅速增加。然而，除了4.5小时，的时间。基于水与原料比例和提取时间的响应面和等高线图显示在图2（c）和（c1）与提取温度固定在零电平（90）。它表明，水与原料的比率为20：1至26：1时，多糖的产率提高。然后用水与原料的比例下降26：1到40：1的提取率增加非常缓慢。根据单因素实验和重复分析，提取多糖的最佳工艺条件如下：提取温度90.83，水与原料的比例21.3：1和提取时间4.8小时。在三种测试的独立变量中，根据二次多项式模型（表3）和梯度的回归系数意义显示，萃取温度是影响多糖的产率最显著因素，其次是提取时间，水与原料的比例斜率在响应面图（图2）。图2.响应面图和等高线图显示
18、出的变量对PPLPs的提取率的影响（X1：提取温度，X2：水与原料配比和X3提取时间）。3.3预测模型的验证验证模型方程的充足程度，适合用于预测最佳值选择的最佳的条件下进行了测试。如表4中所示，优化的提取条件为提取温度90.83C，水与原料的21.3：1的比例，提取时间4.8小时，PPLPs的预测的良品率是54.24。以确保该预测结果不偏于实用价值，三验证实验进行了修改后的最佳条件下：提取温度90.8C，水与原料的21.3：1的比例，并提取时间4.8小时。实验产量PPLPs的是54.18和接近该预测值。结果表明实验值和预测值之间没有差异显著并确认响应模型准确和充分的PPLPs的提取。3.4多糖
19、的分离与纯化PPLPs分别在最佳条件下制备，用乙醇沉淀，脱蛋白，并冻干。将粗多糖，褐色的粉末，呈现负碘 - 碘化钾反应，这表明不存在淀粉型多糖。PPLPs经DEAE-纤维素DE52柱色谱纯化。如图3，主峰洗脱用0.3摩尔/升的NaCl溶液。主要部分（PPLP）收集，浓缩，透析，冻干的抗氧化活性进一步研究。PPLP出现，为浅黄色粉末，并表现出对茚三酮试验否定响应。UV光谱在260和280nm处检测到没有吸收的事实，暗示PPLP不含有核酸和蛋白质。3.5抗氧化活性的研究3.5.1对DPPH自由基清除活性DPPH自由基是稳定的自由基，多糖已被广泛用于评估天然化合物的自由基清除活性。DPPH的乙醇溶液
20、在517纳米处具有特征吸收的最大值。当DPPH乙醇溶液降低，吸光度降低，并且从紫色溶液变为浅黄色。清除DPPH自由基的机制的原理是以DPPH引起的天然化合物可以传输电子或氢原子16。基于这一原理，进行PPLP对DPPH自由基清除活性进行测定，结果如图4（a)所示。的PPLP的清除能力呈剂量依赖性。PPLP的清除效果从7.62提高到84.73时的PPLP的浓度分别为0.05毫克/毫升增加到0.9毫克/毫升。PPLP和抗坏血酸清除DPPH自由基半数抑制效果（IE50）值分别为0.25和0.06毫克/毫升。PPLP的清除活性比抗坏血酸低，而类似的结果已经表明在其他植物多糖中17。3.5.2羟基自由基
21、清除活性在活性氧反应中，羟基自由基被认为是一个可以很容易地穿过细胞膜的生物大分子，是最容易最有效的氧化剂，如碳水化合物，蛋白质，脂类，和DNA。羟基自由基可以引起相邻的生物分子严重损害或细胞死亡18。因此，清除羟基自由基对生物系统的保护极为重要。基于Fenton反应的原理，确定PPLP对羟基自由基的清除作用，结果显示在图4（b）。PPLP羟自由基的清除作用随浓度的升高而增强。在1毫克/毫升的浓度下，测定多糖对羟自由基和抗坏血酸的清除作用，清除率结果分别是79.04%和91.98%，PPLP和抗坏血酸为清除羟自由E50值分别为0.31和0.25毫克/毫升。结果表明，PPLP有很强的清除羟基自由基
22、的作用，且接近抗坏血酸的能力。可能的机制可涉及的任一个电子或氢原子由多糖的供应，它可以与羟基自由基相结合而形成稳定的化合物，以终止自由基链反应。另一种抗氧化剂机制可能是由于供给任一个电子或氢原子由多糖，其可以结合与自由基离子如Fe2+和Cu2+的。这些机制暗示的PPLP可以充当电子或氢供体，以清除羟自由基19。3.5.3超氧阴离子自由基清除活性超氧阴离子自由基被认为是作为一个初始自由基和由线粒体的电子传递体系形成。它除了直接攻击一些生物分子外，超氧阴离子自由基还可降解来创建其它基团，如羟基，单线态氧，和过氧化氢，这可以触发脂质过氧化作用和诱导病理事件，如关节炎和阿尔茨海默氏病20。因此，清除超
23、氧阴离子自由基的研究是必要的。超氧阴离子自由基由PMS/ NADM系统测定在NBT的还原产生离子。PPLP对超氧阴离子自由基的清除效果图4（c）。PPLP的清除活性，随后的PPLP清除活性呈剂量依赖的方式在所有测试的浓度。在浓度为1.0毫克/毫升时，PPLP和抗坏血酸对超氧阴离子自由基的清除作用分别为76.09和94.78，此外，PPLP和抗坏血酸清除超氧阴离子的IE50值分别为0.35和0.17毫克/毫升。结果表明，PPLP有明显的超氧自由基清除活性。然而，PPLP对超氧阴离子自由基的清除作用比抗坏血酸低。4. 结论RSM被证实为对于PPLPs的优化的最有用工具之一。最佳变量如下：萃取的温度
24、为90.8；水与原料的比例为21.3：1；提取时间为4.8小时。在这些条件下，实验的产率是54.18，这与预测值对应良好。此外，PPLP是经DEAE纤维素-52阴离子交换层析得到的浅黄色粉末。PPLP有很强的体外抗氧化活性。因此，PPLP作为一种新的潜在的抗氧化剂有一定的探索价值，并且进一步的研究，以评估在体内抗氧化活动，并阐明其抗氧化机制至关重要。5.参考文献1 Chen, R., Liu, Z., Zhao, J., Chen, R., Meng, F., Zhang, M., et al. (2011). Antioxidant andimmunobiological activity
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