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1、成绩本科毕业论文（设计）题目：毒死蜱降解微生物的筛选及其生长条件的研究学生姓名 学 号 2006118149 指导教师 院 系 化工学院 专 业 生物工程 年 级 06级 教务处制二一年六月诚信声明本人郑重声明：本人所呈交的毕业论文（设计），是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。毕业论文（设计）中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或在网上发表的论文。特此声明。论文作者签名： 日 期： 年 月 日目 录摘 要IABSTRACTII第一章 文献综述11.1有机磷农药概述11.1.1发展简史11.1.2有
2、机磷农药的性质及分类21.1.3有机磷农药的危害31.1.4本文采用的有机磷农药毒死蜱41.2 环境中有机磷农药的降解方法51.2.1化学降解51.2.2 超声波诱导降解法51.2.3 光学降解61.2.4 生物降解61.3 有机磷农药的微生物降解61.3.1有机磷农药的微生物降解途径61.3.2 有机磷农药微生物降解的研究进展81.3.3降解有机磷农药的微生物种类9第二章 有机磷农药降解菌的筛选及生长条件的研究112.1试验材料112.1.1 培养基112.1.2样品及试剂112.1.3主要仪器及设备112.2 试验方法112.2.1菌种的分离及筛选112.2.2菌种的鉴定132.2.3生长
3、特性研究16第三章 结果与分析183.1.菌种的分离与鉴定183.1.1细菌分析结果183.1.2真菌分析结果193.2菌株生长特性203.2.1不同碳源对菌株生长的影响203.2.2最适碳源的不同浓度对菌株生长的影响213.2.3不同pH值对菌株生长的影响223.2.4不同温度对菌株生长的影响233.2.5不同农药浓度对菌株生长的影响23第四章 总结与展望254.1 总结254.2 展望25致 谢29摘 要本文的研究目的是筛选出对毒死蜱具有良好降解作用的菌株，并对其生长条件进行研究，为利用微生物进行有机磷农药土壤修复提供理论依据。采用富集分离法从农药厂附近收集的土壤中分离筛选出5株对毒死蜱具
4、有良好降解作用的菌株，其中包括3株细菌，2株真菌。改变培养基碳源及浓度、毒死蜱浓度、PH值、温度等单一条件，测定菌株在波长600nm的吸光度值，以此来研究菌株的生长状况，并确定此菌株生长的最适条件。经鉴定，3株细菌均为假单胞菌属(Pesudomonas)，2株真菌均为镰孢霉属( Fusarium LK. ex Fx)。葡萄糖促进细菌的生长,农药浓度不高时对细菌生长影响不大,细菌的最适pH 为7.08. 0 ，最适温度为37 ；真菌生长量随外加碳源浓度的增加而增加,在pH 6.08. 0时生长量较大,温度30 时其生长量最大，农药浓度不大时对菌株影响不大。在降解菌株中，真菌的生长条件适应范围比细
5、菌要广，应用前景更好。关键词:有机磷；降解；筛选；生长条件ABSTRACTThe study aimed to screen the strain that had good degradation on the chlorpyrifos and investigate the growth condition of degradation bacteria that degrades -dichlorvos ,to provided the theoretieal basis for the soil remediation on the organophosphorus pesticide
6、 by using microorganismWith the help of separation methodof enrichment, we can separate five strains which is favorable to the degradation of Chlorpyrifos from the soil collected near the mill of pesticide plant. Among these funguses, there is three bacterium and two funguses. With changes in cultur
7、e medium, carbon source, concentration, chlorpyrifos concentration, pH , temperature and some other single conditions an by the assay of strains absorbance value in 600nm wavelength, we can research the growing condition of strain and define the best condition for strains growth.Identified, three ba
8、cteria are Pseudomonas and two funguses are Fusarium LK. ex Fx. Glucose can promote the growth of bacteria. However, when the concentration of pesticide is not so high, Glucose has less influence to the growth of bacteria. The most suitable pH value for bacteria is from 7 to 8 and the optimal temper
9、ature is 37 ;Glucose can promote the growth of bacteria, pesticides are not high when the concentration of bacteria growth was not, bacteria optimum pH was 7.0 8.0, the optimal temperature was 37 ; Fungal growth will augment with the increase of carbon concentration. They can multiply more when the
10、pH value is from 6 to 8. And they will reach their maximum value as the temperature is 30 . When the pesticides concentration is not so high, it has little effect to strain. In the degradation of strain, the extent of fungus growth conditions is wider than that of bacteria, and fungus application pr
11、ospect is better.Keyword: Organophosphate ; Biodegradation；screening; growth condition第一章 文献综述1.1有机磷农药概述1.1.1发展简史回顾世界农药的发展史，有机磷农药可以说是最重要的一类农用化学品，它们在农业和商业上发挥了巨大的作用，但始终保持着相对低廉的价格1。在有机磷农药的历史发展中，以有机磷杀虫剂为代表的祥光有机磷酸酯类化学、生化、毒性研究的数以千计的专利、论文以及大量的杂志、评论、书籍不断发表，涉及了大量的化学家和生物化学家。在有机磷农药的发展历程中，不仅充分体现了它们具有经济和商业上的重要价值
12、，而且为有机磷农药化学带来了许多创新的机遇，同时随着研究的深入，也引发了许多科学上的争论。第一个有机磷化合物（organophosphorus compound，OP）的研究始于1820年，直到1937年，德国的施拉德第一次在Bayer实验室发现具有杀虫活性的有机磷化合物，1943年，施拉德的第一个有机磷杀虫剂进入德国市场，然后这一领域便有了突飞猛进的发展。至今为止，有机磷农药超过了300种。商品化有机磷杀虫剂开发的鼎盛时期是19501965年。19301985年有147个有机磷化合物被发现，并由29个公司开发，其中35%的化合物都由Bayer公司开发，前50个品种的开发的时间，每个约需23年
13、，成本也相当便宜，后来的每个品种开发的时间至少为6年，开发费不断上涨。有机磷农药的研究开发与推广应用在经历了极其辉煌的黄金时代之后，也面临了许多不能与人类与环境相容的安全性问题，从有机磷杀虫剂的研究开发策略而言，目前世界上一些农药公司主要是充分利用、开发现有的符合毒理学要求的一些有机磷杀虫剂，而对有机磷杀虫剂的创新性研究在1985年至20世纪90年代前后便已逐渐进入低潮期或终止。世界上大型的农药研究开发公司终止有机磷杀虫剂的创新性研究，一方面是由于一些高毒的有机磷杀虫剂在发展上受到生态环境的制约，但更重要的原因是由于有机磷杀虫剂开发的历史长、品种多，已形成一个比现在已发现的AChE任何一类杀虫
14、剂在数量上都庞大的多的结构类型，要成功开发一个比现有数量众多的有机磷杀虫剂活性更高，成本更低的新型杀虫剂的几率已很小，如果在效果相同即使成本也相同情况下一个有机磷酸酯类新品种要取代已有稳定市场的廉价的有机磷农药老品种，也需经过一个长期的艰难的时期。因此，如果继续开发这类有机磷杀虫剂，将会承受更大的风险。但从有机磷农药发展的整体趋势而言，有机磷仍是当今农药的主要类别之一，它几乎遍及农药的所有领域。目前世界上应用的有机磷农药商品仍达上百种，特别是在杀虫剂方面，有机磷类为三大支柱之一，并长年稳居首位，从销售额看，世界有机磷杀虫剂销售额1996年约为30亿美元，占杀虫剂37.8%；目前有机磷杀虫剂的销
15、售额逐渐下降至20亿美元，占30%左右，仍在杀虫剂中占首位。即有机磷杀虫剂占整个杀虫剂市场的三分之一以上。如果再加上有机磷除草剂（如草甘膦、草铵膦等），则更为引人注目，可见有机磷农药在世界农药市场中仍具有举足轻重的地位。1.1.2有机磷农药的性质及分类有机磷农药除少数品种为固体(如乐果、敌百虫)外，多数为油状液体，工业品呈淡黄色至棕色，具有大蒜样特殊臭味。一般难溶于水(乐果、敌百虫除外)，易溶于有机溶剂2。按其用途可分为杀虫剂、杀菌剂、除草剂、生长调节剂、诱杀剂、驱虫剂等6大类。按其化学基团可分为磷酸酯类、硫代磷酸酯类、类硫代磷酸酯类、硫代磷酸胺类等。有机磷农药结构通式为:式中，R1 、R2在
16、我国目前生产的品种中多为甲氧基(CH3O)或乙氧基(C2H5O)；X为氧(O)或硫(S)原子；Z为烷氧基、苯氧基或其他更为复杂的取代基团。由于取代基团不同，可产生多种多样的化合物。有机磷农药含有三个磷酯键，被称为磷酸三酯，根据P可与O或S形成双键，按化学键又可分为两种类型，一种是P通过双键与O结合，形成磷氧双键（P=O），此类农药有甲胺磷、氧化乐果、敌敌畏等;另一种是P通过双键与S结合，形成磷硫双键(P=S)，如对硫磷、甲基对硫磷、辛硫磷、毒死蜱等。1.1.3有机磷农药的危害农药环境污染造成的损失是多方面的。农药对大气、土壤和水体污染，对环境质量的影响与破坏是严重的3。1.严重污染环境所谓农药
17、环境污染，是由于人类活动直接或间接地向环境中排入了超过其自净能力的农药，使环境的质量降低，以致影响人类及其他环境生物的安全。有机磷农药污染环境的途径主要有三个:(l)田间的正常施用。研究表明有机磷农药在农田施用时，只有1%2%的农药作用于害虫或病菌，还有10%20%的农药附着在农作物的表面，其余的农药会直接进入环境，污染土壤、水和空气，同时破坏了整个生态平衡;(2)农药包装物和未使用农药的随意丢弃;(3)农药工业废水的排放和意外泄漏都会造成对环境的污染。2.破坏生态平衡有机磷农药施用，破坏了自然界天敌与害虫之间的生态平衡，导致天敌数量急剧下降及抗药性害虫数量增加，这样就得再次加量使用农药，造成
18、恶性循环。土壤中的农药残留导致土壤中的生物多样性相对降低，多种种类的生物减少，土质降低，生产能力下降。农药可进入水体，污染水源，在水生生物体内残留富集，严重时甚至引起水生生物的大面积死亡，严重破坏了自然界的生态平衡。3.造成人畜的中毒有机磷农药毒性很高，有机磷中毒在我国比较多见。该类农药化学结构的共性是均具有一个五价磷原子，中毒机理是磷原子与乙酰胆碱酯酶（AChE）共价结合形成磷酰化酶，从而阻断了乙酰胆碱的水解，乙酰胆碱在神经系统中的积累引起突触的过渡兴奋，抑制神经冲动传导，引起一系列神经综合症，因此对于人畜可造成极大危害。国内外文献显示，二十世纪八十年代以来，每年大约3107公斤的有机磷农药
19、被大量使用，导致每年有数千例农药中毒事件发生，直接死亡数为800余人。有机磷农药的中毒现象除了胆碱酯酶毒性效应(急性、慢性中毒)外，许多研究证明还有非胆碱酯酶毒性效应，如遗传毒性、生殖毒性、胚胎毒性或迟发性神经毒性以及对核酸代谢的影响等。1983年有机氯农药被禁止使用后，有机磷农药由于其半衰期一般在几周至几个月，被认为在环境中降解快、残留期短而发展很快。但后来的研究发现，这些所谓的非持久性农药在某些环境条件下也会有较长的残留期，并在动物体内产生蓄积作用。有机磷农药的毒性除受农药自身性质影响外，制剂中的某些毒性物质，代谢过程中的中间体及降解产物也会使农药的毒性大增。如乙基对硫磷属高毒化学农药，在
20、光照条件下易发生光氧化反应，生成毒性更大的对氧磷，在短期内使乙基对硫磷的毒性大大增加。低毒有机磷品种辛硫磷经光解也生成对哺乳动物毒性较大的硫代特普。还有些有机磷农药的某些降解产物具有潜在的致毒性，如敌敌畏水解生成二氯乙醛可能诱发突变。有机磷农药的这些特性无疑增加了人们的认识，对某些高毒性农药使用的限制已经日益法制化。但是，如果要完全停止化学农药的生产和使用是不切实际的。农药在治理病虫害，提高粮食产量方面发挥着不可低估的作用；每年的化学农药除了销售本身所得的效益外，通过防治病虫害为人类挽回了数以亿万斤计粮棉的间接效益，对世界农业生产的持续、稳定、高产起了关键的作用。于是，在合理使用化学农药的前提
21、下，如何减少，消除化学农药污染成为日益迫切的任务。而在污染治理的实践中，高效，无二次污染，以及低成本的生物降解越来越体现出了应用的优势。1.1.4本文采用的有机磷农药毒死蜱毒死蜱(chlorpyrifos)，又名乐斯本(陶氏益农)、白蚁清(陶氏益农)，化学名称O，O-二乙基-O-(3，5，6三氯-2-吡啶基)硫代磷酸酯，是美国陶氏化学公司(Dow Chemical Co)于1965年开发并研制出来的一种广谱性有机磷酸酯类杀虫剂，广泛应用于叶菜类和瓜果类蔬菜的病虫害防治，是目前全球使用最广泛的5种杀虫剂之一。1.2 环境中有机磷农药的降解方法环境中残留农药的消除方法主要有化学降解，光化学降解，超
22、声波，电离辐射，生物降解等3。 1.2.1化学降解 化学降解农药大多是通过氧化作用来进行，主要有臭氧法，过氧化氢法，超临界水氧化法等。下面主要介绍前两种方法。 臭氧法：1840年Schnbein发现了臭氧。其化学特性为强氧化性质，因此具有消毒，除臭，杀菌，等多种功效，特别是臭氧与蔬菜、水果中残留的有机磷或氨基甲酸脂类农药发生氧化还原反应，反应产物为其相应的酸、醇、胺或其氧化物等，这些反应产物大都是水溶性的物质，最后可以用水冲走一些有机磷农药，因此，农药残留通过臭氧降解是安全可行的。章维华等进行了通过臭氧来降解大白菜中残留的农药4。过氧化氢法：以过氧化氢为氧化剂来降解农药，其降解产物和通过臭氧方
23、法得到的反应产物一样。有机磷农药在经过氧化氢彻底降解后，变成磷酸，水，二氧化碳及一些矿物质等，这些降解产物基本上没有毒性，对环境和食品来说是比较安全的。1.2.2 超声波诱导降解法 超声诱导降解农药的原理：通过强氧化性的自由基(O，OH等)来降解农药的。这些氧化性较强的自由基是这样产生的：液体会在超声波的作用下产生数量较多的空化泡，当这些空化泡瞬间消失的时候，会在液体极小的空间产生1900-5200K的高温和超过5.065107的高压，此时的温度变化将达到109K/S。并伴有强烈的冲击波和时速高达400Km/h的射流，在这样的极端环境下，泡内气体和液体交界面的介质被加热，同时分解产生强氧化性的
24、自由基5。钟爱国进行了用超声波诱导来降解甲胺磷的实验6。1.2.3 光学降解 农药经过太阳光或者紫外线的照射后，那些比较脆弱的化学键发生断裂，因此，形成了特别活泼的中间产物(自由基)，随后，自由基和溶剂或者其它物质发生反应，便得到了光解产物。Alberto Marinas, Chantal Guillard等进行了用二氧化钛光催化降解杀虫脒的实验7。 1.2.4 生物降解生物降解就是通过生物(包括各种微生物、植物和动物)的作用将大分子分解成小分子化合物的过程1。一般，能够降解农药的微生物为细菌，真菌，放线菌及藻类等。与其它的微生物相比，细菌具有适应外界环境能力强和容易发生突变，因此，这些特点决
25、定了细菌在降解农药方面占有不可替代的位置。随着现代生物技术的发展，人类已经分离提取了某些有机磷降解菌的降解酶和降解酶的基因。1.3 有机磷农药的微生物降解微生物及其降解酶的降解作用是环境中有机磷农药分解与转化的重要途径，利用微生物及其产生的降解酶进行土壤和水体中化学农药的去毒与净化是治理化学农药污染的有效方法8，并已显示出良好的应用前景。1.3.1有机磷农药的微生物降解途径有机磷农药被微生物降解是它们在土壤中转化的重要途径，有机磷农药的微生物降解主要存在以下过程：一种是微生物本身含有可降解该农药的酶系基因，当有机磷农药进人土壤后，微生物马上能产生降解有机磷农药的降解酶，在这种情况下，降解菌的选
26、育较为容易；另一种是微生物本身并无可降解该有机磷农药的酶系，当农药进人环境以后，由于微生物生存的需要，微生物的基因发生重组或改变，产生新的降解酶系。YonezawwaY(1979)8等认为当微生物对有机化合物的降解作用是由其细胞内的酶引起时，微生物降解的整个过程可以分为三个步骤：首先是化合物在微生物细胞膜表面的吸附，这是一个动态平衡；其次是吸附在细胞膜表面的化合物进入细胞膜内，在生物量一定时，化合物对细胞膜的穿透率决定了化合物穿透细胞膜的量；最后是化合物进入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应，这是一个快速的过程。有机磷农药通常含有P=S键和P=O键，有些有机磷农药(如甲胺磷)还含有P-N键
27、。当有机磷农药进人土壤环境，土壤中的微生物产生相应的酶，在这些酶的作用下，上述化学键被打断，使有机磷农药被降解。Mageong(1994)8等报道大肠杆菌产生的磷酸三酯酶能打开甲胺磷的P-S键。Bello Ramirez A M(2000) 9等也证实氯代过氧化物酶可以切断有机磷农药中的P-S键。阮少江等(2000) 10推测甲胺磷的微生物降解是甲胺脱氢酶打断P-N键开始的。有机磷农药对土壤中的活性酶也存在抑制性，抑制程度的大小随着外界环境的变化而变化，而且不同种类的有机磷农药对酶的影响也是不同的，但反过来，有机磷农药对酶的活性也具有一定的刺激作用，朱南文等(1996) 11发现在施用甲胺磷1
28、-4d内，甲胺磷对土壤中酸性磷酸酶、中性磷酸酶和碱性磷酸酶呈一定的抑制作用，而在4d以后，对酶的抑制性消失，甚至出现了刺激效应。郭明等(2000) 12发现在7d以内，氧化乐果和久效磷对土壤中的脱氢酶产生抑制作用，在9d以后，对脱氢酶的抑制作用消失，反而有一定的激活作用。这可能是因为当有机磷农药开始加人土壤后，农药的浓度高对土壤中微生物生长和活动产生抑制作用，从而对微生物体内酶和土壤中的游离酶产生抑制作用，但有机磷农药能促进土壤中一些微生物(如细菌、真菌和放线菌等)的生长并抑制一些微生物(如固氮菌)的生长，所以随着细菌、真菌和放线菌数量的增多以及农药浓度的减少，酶的活性也就提高了。有机磷农药在
29、土壤中的微生物降解还受到农药浓度的影响，当农药浓度过高，对微生物的毒性越大，可使微生物的数量显著下降。而当农药浓度过低时，由于微生物生长的碳、氮源不足，抑制了微生物的生长，从而抑制有机磷农药的微生物降解，实验证实乐果浓度在0.2%时微生物降解的效果最好，而在0.1%和0.5%则呈下降趋势。王永杰等(1999) 13也推断在自然环境中，有机化合物的浓度极低可能是限制其生物降解的一个主要因素。一种有机磷农药可被多种微生物降解；同时，一种微生物也可对多种有机磷农药进行降解。因此，土壤中的微生物数量和种类对于有机磷农药的降解有着重要的作用。1.3.2 有机磷农药微生物降解的研究进展自上世纪70年代开始
30、，人们就发现有些土壤微生物对有机磷农药具有降解作用。到目前为止已发现的有机磷降解微生物包括细菌、真菌、放线菌和藻类。进一步研究发现这些微生物之所以能降解有机磷农药是因为它们能分泌一种能水解磷酸酯键的酶，即后来研究的有机磷农药降解酶。20世纪80年代，Munnecke等(1980)发现有机磷农药降解酶比产生这类酶本身，特别是对低浓度的农药。因此，人们的思路从应用微生物菌体净化农药污染转向利用有机磷农药降解酶。随着分子生物学的发展，对有机磷农药降解酶的研究目前已进入到分子水平，数种微生物来源的有机磷农药降解酶已得到分离纯化并进行了较深入的生理生化研究。其中两株对硫磷降解菌Flavobacteriu
31、m sp.ATCC27551(Walter W.Mulbry,1980)和Pesudomonas diminuta GM(C.Steven McDaniel,1988)的降解酶得到了深入细致的研究，分离得到了降解酶基因（opd），比较发现两者基因具有很强的同源性，并且这两株菌的降解酶基因都定位于细菌内的大质粒上。由于这两种酶本身就是同源性很高的酶，所以二者在空间结构上极其相似。通过底物类似物亲和晶体的x衍射的方法，国外的学者们研究了酶的三维构象，发现酶是同源二聚体，其催化中心具有2个Zn2+离子，它们为酶的几个重要的氨基酸残基（His55,His57,Lys169,Asp301,His201,
32、His230）所围绕，形成双核金属催化中心，在这里金属离子结合的羟离子可以亲核攻击底物的亲核性磷原子，促进水解反应的发生，从而使农药毒性降低。最近又有报道，Flavobacteriumsp.ATCC27551的opd基因两侧基因簇有转座子特性。Munnecke等分离到的有机磷农药降解酶对试验用的甲基对硫磷、对硫磷、二嗪农、毒死蜱等7种有机磷农药均能有效降解，在22时降解效率比化学降解快1000-2450倍，且该酶不为农药及农药制剂中溶剂所抑制，对环境条件有较宽的忍受范围。1991年，Defrank等从一株嗜盐细菌中纯化得到一种有机磷农药降解酶，分子量60KD，可被Mg2+和Co2+激活，对含磷
33、氟键的有机磷化合物作用较好，对含磷氧键的有机磷化合物作用不好。与OPH相比，OPDA降解二甲基底物的速度更快，但对于二乙基底物的水解速度无关。2004年，L.John R.Foster等(L.John R.Foster,2004)从澳大利亚分离到一株降解乙硫磷的微生物，分离提纯了降解酶，并对它的酶动力学进行了初步研究。这些研究使得关于有机磷农药降解酶的认识得到进一步深入，酶学机理得到进一步了解。我国关于有机磷农药降解酶的研究起步较晚，但近年也已取得了较大进步。李顺鹏等(2001) 13分离了多株有机磷降解菌，并对其进行了详细研究，分离获得了多种有机磷农药降解酶的基因，实现了融和表达，并对酶学性
34、质进行了分析。从菌株M6中分离提纯的有机磷农药降解酶经分析发现，其C末端含有6个寡聚组氨酸，水解甲基对硫磷时，最适pH8.6-8.8，最佳反应温度15；Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加1520，Ca2+、Mg2+微弱的促进酶的作用，Ni2+对酶活性几乎无影响；1mmol/LEDTA.Na2+几乎不影响酶的活性，而10mmol/L EDTA.Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。陈亚丽(2001)14等从一株假单胞杆菌WBC-3中分离到降解甲基对硫磷的有机磷农药降解酶，已进行X衍射分析其三维结构。从曲霉菌中分离纯化出有机磷降解酶，此酶对有机磷农药乐果具有很好的降解作用，它的最适反
35、应温度45，最适反应pH7.2，对热稳定，并能在pH6-10范围保持活性，重金属、Cu2+对该酶有明显的促进作用，而SDS对其具有抑制作用，这是首例来自真菌的磷酸三酯酶。应用有机磷农药降解酶就必须解决一个关键性的问题如何工业化、廉价、快速生产有机磷农药降解酶。有机磷农药降解酶在原始天然菌株中含量太低，难以进行大量生产，生产成本昂贵。这是目前世界上还未有商品化生产的有机磷农药降解酶产品以及在生产实践上推广应用的关键原因。近年来，随着分子生物学及基因工程的发展，有机磷降解酶的基因工程的研究也取得了一定发展，为其大规模廉价生产奠定了基础。1.3.3降解有机磷农药的微生物种类 综述有关文献发现18,1
36、9：(1)能够降解农药的有细菌，真菌，放线菌藻类，其中，细菌本身在生理生化具有多种适应能力以及容易诱发突变，因此，这使得细菌在降解农药中占主导地位。(2)同样的菌株能够降解不同的农药，一种农药同时可以被不同菌株降解。表1.1 20为部分菌种和其能够降解的农药。表1.1 部分菌种和其能够降解的农药Table 1.1 Some parts of pesticides degraded strains and species of pesticides 微生物的种类有机磷农药种类细菌芽孢杆菌属(Bacillus)甲胺磷、苯硫磷、氧乐果、对硫磷、敌敌畏、甲基对硫磷、节细菌属(Arthrobacter)
37、马拉硫磷、二嗪农假单胞菌属(Pseudomonas)马拉硫磷、甲拌磷、甲胺磷、敌敌畏、乐果、对硫磷、甲基对硫磷黄单胞杆菌属(Canthomonus)对硫磷、杀螟松、杀螟睛黄杆菌属(Flavobacterium)对硫磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、毒死媲短杆菌属(Brevibacterium)对硫磷、甲基对硫磷硫杆菌属(Ihiobacillus)甲拌磷极瘤细菌属(Rhizobium)马拉硫磷、对硫磷固氮极毛杆菌属(Azotomonus )对硫磷、毒死媲不动杆菌属(Acinetobacterium )甲胺磷动性球菌属(Planococcus)水胺硫磷真菌木霉属(Trichoderma)敌敌畏、对硫磷、马
38、拉硫磷根霉属(Rhizopus)地虫磷、溴硫磷曲霉属(Aspergillus)敌百虫、溴硫磷、地虫磷、乐果、甲胺磷青霉属(Pinicielium)地虫磷、敌百虫、对硫磷酵母属(Saccharomyccs)敌敌畏、对硫磷、马拉硫磷镰刀菌属(Fusarium)敌百虫藻类小球绿藻属(Chlorolla)甲拌磷、对硫磷放线菌链霉属(Streptomyces)二嗪农第二章 有机磷农药降解菌的筛选及生长条件的研究2.1试验材料2.1.1 培养基富集培养基：(1)细菌：牛肉膏3 g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15-20g，蒸馏水l000ml，pH值7.07.2。(2)真菌：马铃薯200g，葡萄糖20g
39、，琼脂15-20g，蒸馏水l000 ml，自然pH21。无机盐培养基: K2HPO4 0. 2g，KH2PO4 0. 8g ，MgSO47H2O 0. 2g ，CaSO42H2O 0. 1g ，Na2MoO42H2O 0.0033g ，FeSO47H2O 0. 005g ，(NH4)2SO4 1. 0g ，蒸馏水1000mL,调节pH7.0。选择培养基(琼脂平板)：在富集培养基的基础上加入100mg/L的毒死蜱。2.1.2样品及试剂土壤：土样取自蓝天实业辛硫磷车间附近。试剂如表2.12.1.3主要仪器及设备主要仪器及设备如表2.22.2 试验方法2.2.1菌种的分离及筛选采用固体培养基富集培养
40、法，称取土样1 g于5mL无菌水中振荡混匀制成菌液。将上述菌液分别均匀地涂布在细菌和真菌固体富集培养基上，培养基中毒死蜱的浓度为60mg/L，置于30恒温培养箱中培养。2天后，挑取有明显透明圈的菌落划线转移至农药浓度提高的新鲜富集培养基中，培养2天，连续5次转接直至富集培养基中农药浓度提高到480mg/L。最后，接种斜面，编号保存。表2.1 试剂Table 2.1 The reagents试剂名称生产厂家牛肉膏、蛋白胨梁山科泰生物制品有限公司葡萄糖、蔗糖广东汕头市西陇化工厂琼脂条福建省石狮市琼脂副食品加工厂对二甲氨基苯甲醛、FeSO4、对硝基苯酚天津市博迪化工有限公司KH2PO4 、Na2Mo
41、O4，CaSO42H2O西安化学试剂厂MgSO47H2O、(NH4)2SO4 、K2HPO4西安化学试剂厂NaCl、NaOH、HCl、95%乙醇西安化学试剂厂无水乙醇、甲醇、丙酮西安化学试剂厂毒死蜱美国陶氏益农公司30%H2O2天津市化学试剂六厂溴百里香酚蓝上海慨洋生物技术有限公司尿素、柠檬酸钠天津市瑞金特化学品有限公司明胶青岛化学试剂厂甲基红天津市东方卫生材料厂乙醚、硫代硫酸钠西安化学试剂厂半乳糖上海试剂二厂表2.2 仪器及设备Table 2.2 Instruments and equipment仪器名称及型号生产厂家SW-CJ-1G型单人净化工作台苏州净化设备有限公司LRH-250-生化培
42、养箱广东省医疗器械厂LDZX-75KB立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂HZQ-F全温振荡培养哈尔滨市东联电子技术开发有限公司实验室pH计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司722光栅分光光度计上海精密科学仪器有限公司XSZ-2GA光学显微镜重庆光电仪器有限公司2.2.2菌种的鉴定2221 形态特征1.细菌的鉴定（1）菌落特征 将菌接种于牛肉膏平板培养基上，32恒温培养48h，观察菌体和菌落21。（2）芽孢染色加孔雀绿染液2滴，使其与制成的菌悬液混合均匀，然后将试管置于沸水浴烧杯中，加热染色2 min，用接种环挑取试管底部菌液数于载渡片上，涂成薄膜，经过火焰3次温热固定，水洗至流出的水是无色，
43、用蕃红染液染色3 min，倒去残液用滤纸吸干，干燥后用油镜观察，芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。(3)荚膜染色挑取23环菌苔均匀涂于载波片上用蕃红染液染色3min。用水洗去多余染液。晾干后滴加黑色素l滴于载玻片一端，用另一边缘平整的载玻片将黑色素刮过涂片，使成一薄层，晾干后镜检，菌体红色。背景黑色，荚膜无色透明。2真菌的鉴定 将灭菌后盖玻片放在培养皿中的琼脂表面，在靠近盖玻片处接种待检菌，真菌可以直接生长到盖玻片上，在缺乏营养的盖玻片上菌丝稀疏，且易产生分生孢子，便于镜检23,24。培养数天后，将盖玻片取出倒放在加封片液的载玻片上镜检。2.2.2.2 生理生化特征测定(1)革兰氏染色先用初染
44、剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇脱色，最后用复染剂番红复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而是细菌染上复染剂的颜色红色，该菌属于革兰氏阴性菌。20(2) 过氧化氢酶 取一环生长旺盛的斜面培养物，涂抹在干净的玻片上加1滴10%过氧化氢 若有气泡(氧气)产生，则为接触酶阳性反应，无气泡参为阴性反应，斜面培养基不能含有血红素或红血球，在此种培养基上生长的产生假阳性。 (3) 明胶液化 每支试管装5mL明胶培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaCl 5g，明胶150g，蒸馏水1000mL，pH7.07.2)，灭菌15min。用穿刺法以无菌
45、操作技术将检验的微生物接种于试管明胶培养基中，并做两管不接种的作对照。将接种后的试管置于20下培养。培养至2，7，10，14或30天时，及时在20下观察微生物的生长和明胶液化的状况。如菌已生长，且明胶培养基凝块在20下已部分或全部变成可流动的液体，为明胶水解阳性若菌已长出，而明胶表面无凹陷为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。如果有菌生长，菌苔下的明胶表面也有凹陷，小窝(须与未接种的对照管比较，因明胶培养过久，水分的蒸发也会产生凹陷)为轻度水解，按阳性记录。如接种后不长茵，可作为不在明胶培养基上生长或是此种成分培养基不适宜生长。 (4) 淀粉水解试验 称取蛋白胨5g，NaCl 5g，牛肉膏3g，可溶性淀粉2g，琼脂15g，加入1000mL蒸馏水，调节pH值到7.2。用接种环挑少量的菌苔制成悬液，于已保温过夜的平板培养基上接种，适温下培养。培养1-7天后，
