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1、 毕业设计（论文） 题 目 红掌组培过程中污染分析 指导教师 系 部 生化工程系 专 业 生物技术及应用 姓 名 学 号 2012年06月25日 保存期限：三年 保存部门：专业教研室红掌组培过程中污染分析摘要：红掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum），亦叫安祖花，红鹤芋等， 天南星科火烛属。其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名 的切花和盆栽花卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。红 掌的繁殖方法通常采用分株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。但分株繁殖、 扦插繁殖很难满足当前市场的需求，组织培养是红掌快速繁殖的有效途径。 由于组织培养中经常出现不同
2、程度的污染问题，造成很大的损失，因此控制 污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。本文从灭菌方法、内 源性污染、继代培养中污染防治等方面，进行了红掌组培快繁过程中污染原 因的分析及对策的探讨。 关键词：红掌，组织培养，灭菌，污染，防治 Tissue cultureprocess ofpollution analysis ABSTRACT： Anthurium, also called Andrew Flower, lines such as flamingo, a Fire Araceae. Its bright colors, tall and straight stem, gree
3、n leaf-type appearance, are well-known in todays world of cut and potted flowers, one large market potential, with high ornamental value and economic value. Flower andraeanum breeding methods commonly used ramets propagation, cutting propagation and tissue cultur e propagation. However, ramets propa
4、gation, cutting propagation is difficult to meet current market demand, tissue culture andraeanum Flower Express are an effective way of breeding. Tissue culture because of the frequent occurrence of various degrees of pollution, resulting in great loss, so control of pollution are industrial plant
5、tissue culture vaccine production technology in the important aspect. This article from the sterilization method, endogenous pollution subculture in such areas as pollution prevention, to discuss how to minimize the emergence of tissue in the pollution problems. KEY WORDS: Anthurium， tissue culture，
6、 sterilization， pollution， prevention and treatment目录前言 1第 1 章 培养基的灭菌 21.1 一般培养基的灭菌 21.2 不耐热物质的灭菌 2 第 2 章 外植体材料的消毒与灭菌 4 2.1 外植体的消毒与灭菌 4 第 3 章 接种前的准备工作 5 3.1 器皿、工具的灭菌 5 3.1.1 器皿与金属器械的灭菌 5 3.1.2 布质制品的灭菌 5 3.2 培养室的灭菌 5 3.3 无菌操作和无菌操作技术 5 第 4 章 红掌诱导与继代培养过程中的污染 7 第 5 章 污染的原因和预防措施 8 5.1 通常污染 8 5.2 内源性污染 8
7、5.3 污染原因判断及污染苗抢救 8 5.4 预防方法和措施 9 5.4.1 基本方法 9 5.4.2 经常检查消毒锅的灭菌质量 9 5.4.3 检查培养容器是否存在问题 10 5.4.4 继代培养中污染的控制 10 5.4.5 减少培养基中的有机成分 10 结论 11 参考文献 12谢辞 13 前 言红掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum），天南星科火烛属，原产地 哥伦比亚。其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名的切花 和盆栽花卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。其繁殖方 法通常采用分株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很
8、难满足当前市场的需求，组织培养是安祖花快速繁殖的有效途径。 植物组织培养中经常会出现不同程度的污染问题，污染是在组织培养 过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。它是影响植物 组织培养的一个重要因素，它通常会导致培养失败造成很大的损失。植物 组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，但在 组织培养中通常会出现不同程度的污染，因此预防和控制污染是植物组织 培养苗工厂化生产中重要的技术环节。在植物组织培养过程中，存在两种 类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和 培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而 导致的污染；另一
9、类是内源菌污染，内源菌包括真菌和细菌，内源污染一 般是指内源细菌所致的污染。 本文从一般的污染的控制、内源性污染的控制、继代培养中污染防治、 减少培养基中的有机成分等方面， 讨论了怎样减少组培中出现的污染问题， 如：对于一般的污染来说，主要从操作环境、操作人员、仪器；对于内源 性污染主要是从外植体预处理到外植体灭菌方法；对于继代培养污染的控 制主要是从对无菌外植体进行检验和反复进行茎尖培养或分生组织培养； 至于对培养基有机成分的减少措施主要是减去培养基中的 VB 1 、VB 6 或除去 培养基中的蔗糖这几方面加以论述。第 1 章 培养基的灭菌1.1 一般培养基的灭菌培养基是在有菌的环境中配制的
10、，在该过程中会使培养基带有各种杂 菌，因此，每次培养基配制完毕和分装后应尽快灭菌，否则培养基中就会滋 生各种杂菌，改变培养基的营养成分和pH值，影响培养效果。常用灭菌方法 是用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，将培养基置于高压灭菌锅中，从达到要求温 度的时刻 算起，在0.105Mpa的压力 下（121 。 C）灭菌15-40min。灭菌的 时间 取决于温度，而不是直接取决于压力。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不 ，对经过高压灭菌后不会变质的物品， 同时，所需灭菌时间也不同 1 如无菌水、培养皿、器械等，可延长灭菌时间和增加压力。培养基灭菌时间 不能过长，否则容易引起培养基中营养成分的损失，并且琼脂也会随
11、灭菌时 间的延长，凝固能力下降，甚至不能凝固。因此，所需的灭菌时间应随着要 进行灭菌的物体体积而变化。当灭菌锅里的热溶液冷却时，必须十分小心，如果压力下降过急，超过 了温度下降的速率，就会使液体滚沸，从培养容器之中溢出。另外，只有当 高压锅的压力表指针回到零时，才能打开灭菌锅。1.2 不耐热物质的灭菌某些生长调节物质（GA 3 、Zt、IAA、IBA） 、尿素以及某些维生素等不耐 热的物质遇热易分解，不能进行高压蒸汽灭菌处理，通常只能采用单独液体过滤灭菌方法。热分解化合物溶液的灭菌是通过过滤膜进行过滤灭菌的，然 后将其加入经过高压灭菌过的并未凝固的培养基中。 如果是制备固态培养基，方法是先将没
12、有不耐热物质而包含其他化合物 的培养基倒入培养瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌后置于超净工作台上冷却。 当其冷却至45 。 C左右（即琼脂凝固温度） ，琼脂将要凝固之前，加入经过滤 灭菌的各项不耐热成分的溶液，然后混匀放置，待冷凉凝固后备用，但不能 在琼脂培养基温度较高时加入，以防止不耐热物质的分解 2。第 2 章 外植体材料的消毒与灭菌2.1 外植体的消毒与灭菌用红掌茎尖作外植体时，要尽量选取带菌少的材料，如果室外栽培 的材料污染太严重，可先将植物样本挖出，改为室内盆栽，喷布杀虫剂和 杀菌剂，不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再行采样接种。 2、对污染严重的外植体，可以在培养基中加入杀菌剂。
13、也可在菌类长 入组织内部时，除去韧皮组织，只接种内部的分生组织可防止材料带菌。 3、外植体消毒常用药剂有：70%75%的酒精，0.3%0.6%的次氯酸钠 溶液和 0.1%的升汞溶液等。选用何种灭菌剂和灭菌时间根据不同情况及操 作者的经验来掌握，既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可 能少伤害外植体组织和表层细胞。先用 75%的酒精棉花擦拭外植体材料再 使用消毒药剂常能取得较好的消毒效果 3。第 3 章 接种前的准备工作3.1 器皿、工具的灭菌3.1.1 器皿与金属器械的灭菌 1、玻璃器皿的灭菌 可采用湿热灭菌法，即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌器中进行高温 高压灭菌，灭菌时间可长到 25
14、30min。也可采用干热灭菌法，即将玻璃 器皿置入电热烘箱中进行灭菌；还可以把玻璃器皿放入水中煮沸灭菌4 。2、金属器械的灭菌 一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在 95%的酒精中浸一下，然后放 在火焰上灼烧灭菌。这一步在无菌操作中有要反复进行。3.1.2 布质制品的灭菌 工作人员使用的工作服、帽子、口罩等，要经常保持干净，并定期进 行消毒。采用湿热灭菌法，即将洗净晾干的布质品放人高压灭菌器中在压 力 0.110.12Mpa，温度 121下灭菌 2030min5。3.2 培养室的灭菌每次接种前应 对接种 室的地面进行 清洁卫 生工作，并用75%的 酒精喷雾 使空气中的灰尘 沉降 ，并用紫外灯照
15、射2030min。接种前工 作台面要用新 洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但 它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。 培养室的相对湿度应 控制在70%左右，相 对湿度太高可以用抽 湿机除湿。接 种结束后，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定 期用甲醛熏蒸接种室。3.3 无菌操作和无菌操作技术植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌，而且要求工作人 员在操作过程中要遵守无菌操作的规程，如少有疏忽，都会造成无法挽回 的后果，使工作前功尽弃。污染中特
16、别注意一种呈乳白色的细菌污染，这 种细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜， 耐高温，一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播；也可出现 在培养基表面，或呈滴形云雾状存在培养基内，若出现时应严格灭菌，清 洗和消毒用具，并更换消毒酒精 。 操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间， 减少污染。因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查 均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时 间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是 绝对无菌的。所以工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点： 1、入无菌室前
17、，要洗手，去掉指甲中的污物。 2、入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。 3、操作前要用 70% 的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精 擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养 基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。 4、必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前 应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上6。第 4 章 红掌诱导与继代培养过程中的污染初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染，这一方 面是由于操作不慎的原因，另外即是由于初代培养中使用了营养相对简单 的培养基有可能使污染不易表现出来，有
18、时继代材料在培养室则可能被螨 传播的真菌污染。 对已污染的红掌组培苗，有时因植物材料难得或重新发生要花费很多 时间，也可切取较大的植株重新消毒接种。李春燕等用 400 或 600 万单位 /L 的青霉素无菌水溶液分别浸泡红掌组培细菌污染苗 60min 或 40min，可 有效防治组培中的细菌污染。经处理过的苗继代培养时，不再重复出现细 菌污染现象，且苗分化能力强，生根培养时，根系发达，移栽成活率高7 。李颖等的实验研究证明，如果继代培养中只有真菌污染，采用 3%的多菌灵 无菌液浸泡 0.5h 以上即可， 用无菌水冲洗后接种或不用无菌水冲洗直接接 种都可消除真菌污染。如果在细菌污染和细菌、真菌同
19、时污染的情况下， 可采用 HgCl 2 消毒法，把污染的红掌培养苗切割成较长的茎段作外植体， 用自来水冲洗 0.5h，再在超净工作台上用乙醇和 HgCl 2 进行短时间的处理 即可再度建立无菌苗培养体系 8。第 5 章 污染的原因和预防措施5.1 通常污染在培养过程中，培养材料附近经常出现黏液或混浊的水迹，并有发酵 状泡沫。这大多是细菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及操作 者呼吸时排出的细菌所引起的，或是操作人员的手接触了材料或器皿边缘 所致；有时培养基上还会出现黄、白、黑等不同颜色的霉菌，这是真菌性 污染，主要是由于接种室空气污染造成的9 。5.2 内源性污染在红掌组织培养中，由于材
20、料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方 法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性 污染。主要有以下几类：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆 菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。真菌主要有霉菌。 在红掌初代培养中， 表面细菌引起的污染通常在 23 天就能在外植体 周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、 乳白等颜色的菌落。而在外植体培养后 35 天内并未发现细菌污染，以后 则不段出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染10。在红掌初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”“晕状物”
21、，不易被肉眼发现的，对 红掌中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消灭。有 时在外植体的初级培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易 被发现，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表 现出来。对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它11。5.3 污染原因判断及污染苗抢救1、若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染， 比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低； 接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太 多；若污染菌类是从材料
22、周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能 是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗， 接种过程交叉感染；若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不 是从培养基先长起，且发生在 5 天以后，则说明是材料带的内生菌。若从 培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切 口引起的污染， 原因有是灭完菌后， 未剪去两个切口或虽剪但器具带菌12。2、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅 形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。但若使 细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及 时发现，将材料上部未
23、感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。 3、用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种 抗生素能够对各种菌都有效， 并且常常也会影响红掌材料的正常生长分化。 另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用13。5.4 预防方法和措施5.4.1 基本方法 1、通风：经常开窗，保持室内空气流通可以使室内真菌数量减少。 通风方法简便易行，应多使用。 2、去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真 菌生长繁殖。 3、光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发现下午一时是大气 细菌粒子沉降的一个低谷，说明太阳辐射对空气微生物有明显的杀 灭作用。因此，保持室内较好
24、采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒， 对减少室内真菌污染大有好处14。 4、防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。5.4.2 经常检查消毒锅的灭菌质量 消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该 现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。如果出现培养基造成的污染，要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。5.4.3 检查培养容器是否存在问题 培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老 化，密封性差，也会造成污染。同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶 内瓶外） ，灭好菌的培养瓶
25、不要放在空气中太久，一般出锅后 12 天内接 完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染15。5.4.4 继代培养中污染的控制 这类污染可以从以下 2 个方面进行防止。(1)扩大繁殖时应有合理程 序。在获得的无菌培养物之后，应将其中一部分作为“原种”保存起来， 分批繁殖和复检后再大规模生产。 （2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防 止。多菌灵用于红掌组织培养的抑菌促生长，培养物不受微生物污染，灭 菌率为 98%以上，无白化苗，生长健壮，不过这种方法不能广泛使用，因 为有些植物在抑菌素会受到毒害，如叶片变小、变黄和不能分化等。还有 使用时要调到适合的浓度16 。5.4.5 减少培养基中的有机成分
26、 培养基中 有机 成分的 存在是污 染产 生的重 要原因,去除 有机物 是减少 污染的一条途径。在红掌的组织培养中，除去培养基中的 VB 1 、VB 6 、烟酸 等（保留肌醇）有机成分，经 23 代培养后，能抑制细菌生长，对丛生芽 生长增殖没有影响。原因是这些都是某些细菌生长的必须物质，去除这些 有机成分后，细菌无法生长发育而慢慢死亡或减少。由日本的古在丰树教 授首创的无糖组织快繁技术则全部除去培养基中的有机成分，输入可控制 量的 CO 2 气体作为碳源，并通过控制环境因子，促进植株光合作用速率， 使之由异养型转变成自养型，因而植物长势良好，污染率明显降低 17。结论污染问题，是红掌组织培养过
27、程中难以杜绝的现象。污染造成的后果 是严重的，它会增加接种源及污染的几率，对花卉造成伤害，耗工耗时， 提高生产成本。对于如何控制污染，以建立一个洁净、良好的工作与培养 环境和无菌的植株系统为组培业所要努力的方向。 目前组培苗污染实验所遇到的问题为不易建立植株的干净度，因此无 法确定真正的污染源来自何处，无法对症下药。而且对于菌种的鉴定有很 大的困难，因为一般有关植物或是植物病原菌，其背景资料较少，对于鉴 定而言，便较棘手。在红掌组织培养中，一般的污染较容易控制，要达到 接种的无菌环境条件，无菌操作要求和无菌操作水平。而内源菌则较难控 制，要求全部杀死植物表面和组织中的微生物，一般的消毒方法是不
28、能完 成的。通过先对外植体植物进行预栽管理、外植体的预处理，并在这基础 上，改进消毒方法， （如真空减压法、酸化培养基、灼烧法等） ，也可除去 培养基中的有机成分，这些措施都能降低由内源菌引起的污染。当然，在 植物组织培养中，控制污染的方法是可灵活多变的，只要能减少污染，不 会发生培养物的遗传变异，实现工厂化快繁，降低成本，能在市场竞争中 占有一席之地即可。待添加的隐藏文字内容3参考文献1李 云 .林 果 花 菜 组 织 培 养 快 速 育 苗 技 术 ， 中 国 林 业 出 版 社 ， 2003， 1 （2）:23-252王青连.植物组织培养M，中国农业出版社，2002：23-24. 3周俊
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