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1、红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化 1绪论1.1引言肿瘤的治疗在很大程度上依赖于抗肿瘤药物，抗肿瘤药物研究方兴未艾。紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)是从红豆杉树皮中分离提纯得到的植物抗肿瘤药，已有40余年的研究历史。由于其具有良好的抗癌活性和独特的抗癌机理，因而被认为是抗癌药物的“明星”。自1992年以来，紫杉醇已在许多国家成为治疗卵巢癌和乳腺癌的重要药物1张亚妮，董兆麟. 一株产紫杉醇真菌发酵条件的研究，西北大学学报，2003，623(3)：310311。由于紫杉醇的药源植物红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量很低 (低于为树皮干重的0.015%)，而现有的资源又有限，因而紫
2、杉醇的供应一开始就受到人们的关注。多年来人们一直在寻找能替代直接从植物中提取紫杉醇的方法2王淑月译 紫杉醇类似物，药学进展，1995，19（3）：159163、3王建锋，吕华鹰，苏文金. 植物内生真菌产紫杉醇的研究，微生物学通报，2000，27（1）：5860。紫杉醇的化学全合成虽已完成，但路线复杂，目前无商业价值；紫杉醇的半合成在一定程度上为缓解紫杉醇的供求矛盾；近年来分别从红豆杉属（Taxus）中的短叶红豆杉（T. brevifolia Nutt.）、云南红豆杉（T. yunnanensis）、西藏红豆杉（T. wallichinana）等树皮中分离中得到能产生紫杉醇的内共生真菌，这无疑为
3、解决紫杉醇药源危机提供了一种新的途径。1.2内共生真菌内共生真菌(endophytic fungus)是一大类尚未被充分认识的真菌，它泛指那些生活在健康植株中而不引起任何明显病害症状的所有真菌。在整个真菌发展史上，内共生真菌的研究历史并不长4郭良栋 内共生真菌研究进展 菌物系统 2001，20(1)：148152。1924年，Lewis首次报道禾本科植物叶片中存在内共生真菌，但此后的研究工作一直很少，直到近30年，对于植物内共生真菌的研究才趋于活跃。自从A. Stierle证明Taxus brenifolia nutt中的内共生真菌axomyces andreanae可以产生紫杉醇，对于植物内
4、共生真菌的研究更加引人瞩目5孙剑秋 朱红标 周东坡等 东北红豆杉内共生真菌分离方法的研究 齐齐哈尔大学学报1999，15(3)：1316。目前为止，内共生真菌生产紫杉醇产量也极低，这就需要进行多方面的研究。本课题是以不同的碳源种类和配比对红豆杉内共生真菌发酵培养条件优化的研究。1.3本论文研究的内容碳源在微生物中是用于合成菌体的含碳物质及其骨架，并为微生物代谢提供能量。除自养菌能以CO2作为唯一碳源外，大多数微生物是以有机含碳的化合物做为碳源和能源。红豆杉内共真菌发酵培养选用的碳源一般有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖等。糖类的种类和浓度对细胞生长的影响很大，本试验运用正交试验设计对发酵培养基的碳源
5、进行优化。2.材料和方法2.1.材料2.1.1试剂葡萄糖AR中国医药集团上海化学试剂公司麦芽糖BA上海生物化学试剂公司蔗糖AR上海化学试剂有限公司花生饼粉无锡第一制药有限公司提供豆饼粉无锡第一制药有限公司提供NH4NO3AR宜兴市第二化学试剂厂琼脂BA中国医药集团上海化学试剂公司蛋白胨BA中国医药集团上海化学试剂公司酵母浸膏BA中国医药集团上海化学试剂公司MgSO4AR中国竟山区塔美化工厂KH2PO4AR无锡市民丰试剂厂 CHCl3AR宜兴市展望化学试剂厂CH3OHHPLC上海陆都化学试剂厂精密试纸pH 5.47.0上海三爱思试剂有限公司2.1.2培养基沙氏培养基：葡萄糖20g，麦芽糖5g，蛋
6、白胨10g，酵母浸膏5g，琼脂1520g，配成1000ml，pH自然，0.1Mpa（121）灭菌20分钟，即得。种子培养基：葡萄糖20g，花生饼粉3g，MgSO43g，KH2PO43g，NH4NO33g，配成1000ml。50ml/300ml瓶，0.1MPa（121）灭菌20分钟即得。发酵基础培养基：葡萄糖20g，花生饼粉10g，豆饼粉10g，MgSO43g，KH2PO43g，NH4NO33g，配成1000ml。60ml/300ml瓶，0.1Mpa（121）灭菌20分钟，即得。2.1.3仪器MJ-2501AT型霉菌培养箱上海一恒科技有限公司MGC-300H型智能型人工气候箱上海一恒科技有限公司
7、LDZX-40型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂超净台无锡市空气净化设备厂TDL-5-A冷冻离心机上海东亭科学仪器厂自动高速组织匀浆机江阴市科研器械厂旋转蒸发仪星海生化设备有限公司2.1.4实验材料菌种：Y1117，本实验室保藏（未鉴定）标准品：Paclitaxel，购自Sigma公司3.实验方法3.1发酵提取工艺流程图沉淀HPLC/MS检测CHCl3萃取三次CH3OH溶解 发酵提取工艺流程图沉淀(弃去)合并上清液待测液旋转蒸发至干脂相浓缩液浓缩至原体积的1/3上清液离心20min加蒸馏水20000r/min匀浆沉淀合并沉淀(弃去)上清液CH3OH溶解旋转蒸发至干脂相CHCl3萃取三次浓缩
8、液浓缩至原体积的1/3上清液离心20min发酵培养基 (120r/min 23恒温振荡培养11天)转接种子培养基 (120r/min23恒温振荡培养3天)转接斜面沙氏培养基HPLC/MS加蒸馏水20000r/min匀浆20min3.2优化指标对发酵基础培养基碳源优化，其它成分不变如花生饼粉10g、豆饼粉10g、MgSO43g、KH2PO43g、NH4NO33g，配成1000ml。培养基碳源的优化考虑四个因素：葡萄糖和蔗糖的总浓度（其中以葡萄糖为主），葡萄糖和蔗糖占总糖浓度的比例，是否添加麦芽糖及其浓度，pH(消前，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调整pH)。根据所选用的是四因素三
9、水平正交试验6费荣昌 试剂设计与数据处理 无锡轻工大学 1997，把各因素、水平列成表表 因素的水平 因素水平葡萄糖和蔗糖的总浓度（g/l）比例麦芽糖的浓度（g/l）pH120100:005.6(自然)23080:2025.434050:5055.8根据上表的因素和水平列成试验标表 L9（34）实验号列号12341111121222313334212352231623127313283223933113.3培养条件种子培养50ml/300ml瓶，放入摇床，100120转/分，控温在2025。发酵培养选取同一组种子液中生长较好的一份用移液枪移入发酵液中，60ml/300ml瓶，放入摇床，1001
10、20转/分，控温在2025。4.结果4.1产量用HPLC/MS检测产物产量（委托江南大学分析测试中心测定）图1 ：HPLC/MS图 4.2计算结果试验号总糖浓度A比例B麦芽糖浓度CpHD产量120100:005.6(自然)10022080:2025.418032050:5055.8177430100:025.816653080:2055.6(自然)28563050:5005.4292740100:055.412184080:2005.812594050:5025.6(自然)60K同一因素的同一水平的提取率之和k平均提取率 k=K/3R极差 R=max（k1，k2，k3）-min(k1，k2，k
11、3)k值ABCDK1457387517445K2743590406593K3306529583468k1152129172148k2248197135198k3102176194156R1466859504.3以因素的水平为横坐标，产量为纵坐标做出因素和试验指示的关系图4.3.1总糖浓度对产量的影响图 2: 总糖浓度对产量的影响，其中，总糖浓度：1为20g/L，2为30g/L，3为40g/L由图可知，总糖浓度从20g/L40g/L的过程中先提高后下降，当总糖为30g/l时得到最高的产量。4.3.2葡萄糖和蔗糖占总糖浓度的比例对产量的影响图3:葡萄糖和蔗糖在总糖浓度占的比例的影响，其中，葡萄糖和
12、蔗糖在总糖浓度占的比例：1为100:0，2为80:20，3为50:50由图可知，比例从100:050:50的过程中收率先提高后下降，当比例为80：20时对产量影响最大。4.3.3：麦芽糖的浓度对产量的影响图4:麦芽糖的浓度的影响，其中，麦芽糖的浓度：1为0g/L，2为2g/L，3为5g/L由图可知，麦芽糖的浓度从0g/L5g/L的过程中先是下降后上升，所以不添加麦芽糖和麦芽糖添加5g/L时的产量最大。4.3.4 pH对产量的影响图5: pH对产量的影响，其中，pH，1为5.4，2为5.6，3为5.8由上图可知，pH为自然5.45.8过程中收率先上升后下降再稍上升，当pH为5.4时得到的效果最好
13、。4.讨论4.1比较四个因素的极差，总糖浓度极差最大，pH极差最小，极差越大说明该因素的水平变动时对试验指示的影响越大，可从极差的大小决定因素的主次顺序。主 次A B C D总糖浓度是主要因素，其中A2产量最高；比例在第二位，其B2产量最高；其次为麦芽糖的浓度，其中C3产量最高；pH为次要因素，其中D2产量最高。取产量最高的水平组成较优的工艺条件A2B2C3D24.2优化趋势总糖浓度：由4.3.1的图看到产量随总糖浓度的增加先上升达到最高值后下降。当总糖浓度为20g/L时可能是糖的总量不够而产量不高；当总糖浓度为40g/可能出现了底物抑制使产量下降；而当总糖浓度为30g/L时产量是最高，所以我
14、们可以在30g/L左右的区域再进行下一步的优化。葡萄糖和蔗糖占总糖浓度的比例：由4.3.2的图可知产量随着葡萄糖在总糖浓度的比例缩小先上升后下降；由此可知在比例为100:0时可能是葡萄糖的量太多出现底物抑制使产量不是很好，在比例为50:50时产量仅次于比例为80:20所以可以这两个比例左右的区域再做进一步的优化。麦芽糖的浓度：由4.3.3的图看到当麦芽糖的浓度为5g/L时的产量达到最高点，而不添加麦芽糖时的产量从平均产量的数值上看也是相差不大，但在麦芽糖浓度为2g/L时产量不高可能是麦芽糖的量不够，不能满足微生物的生长而起到一个反作用，限制了产量。所以我们可以在0g/L和5g/L的左右区域再做
15、进一步的优化。pH：由4.3.4的图看出pH为5.4时得到最高产量，而pH为5.6和5.8时的平均产量从数值上看也相差不多。从另一角度也说明真菌在偏酸性条件下比较利于生长，而参考文献7唐珊熙主编，微生物学，第一版，中国医药科技出版社，2000年1月也说明最适宜真菌生长的pH为46。所以我们可以在pH小于5.4的区域做进一步的优化。5.致谢本课题是在程龙高级讲师的精心指导和严格要求下完成的。从实验开始到结束，程老师给予我热情的指导和建议，在此，向程老师表示我最诚挚的谢意。 特别衷心感谢实验室的技术员杨静，江南大学的硕士研究生徐峰和郭立佳在我实习期间和论文写作期间对我的热心的指导和帮助。 非常感谢无锡山禾药业股份有限公司给我提供实验条件，顺利完成论文实验阶段工作。 向长期以来给予我关心的老师、同学表示我深深的谢意 参考文献
