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1、 学科代码： 学 号： 2009407056 本科毕业论文（设计）题目：黔莓I号快繁外植体的筛选学 院：凯里学院专 业：生物科学班 级：09生物科学学生姓名：指导教师：2013年 3 月 12 日目录摘要：II关键词：IIAbstract:IIKeywords:II1.前言11.1 草莓的简介11.2研究和发展前景11.3 研究的目的和意义22 实验器材33 黔莓I号不同外植体的组织培养33.1 组培对象33.2 培养基的配制33.3 培养基的灭菌53.4 外植体的消毒和接种53.5 外植体的组织培养53.6 培养结果和数据统计（见表二）54 分析和结论74.1 污染和褐化问题的分析74.2
2、试验结果的分析74.3 结论8参考文献:9致谢！9黔莓I号快繁外植体的筛选余磊（凯里学院 环境与生命科学学院 09生物科学）摘要：草莓是一种种植广泛的经济类植物，其果实鲜美，内含丰富的维生素C，是一种营养价值极高的水果。为扩大生产和改良品种，研究草莓的快速繁殖技术，利用植物组织培养来选育适合的外植体，为良种的选育提供参考。关键词：草莓；植物组织培养；外植体Abstract: Strawberry is a widely cultivated economic plants, the fruit is delicious, contains rich vitamin C, is a very h
3、igh nutritional value of fruit. To expand the production and variety improvement, rapid propagation technology of strawberry, the use of plant tissue culture were selected for the body to provide reference for breeding, breeding.Keywords: strawberry; plant tissue culture; explants1.前言1.1 草莓的简介 草莓又叫红
4、莓、洋莓、地莓等，它的拉丁语学名：Fragaria ananassa Duchesne；属蔷薇科蔷薇目双子叶植物纲；是一种红色的水果，具有一定的食用和药用作用，种植广泛。草莓是蔷薇科草莓属多年生草本果树, 果实具有较高的营养价值和经济价值1，外观呈心形，鲜美红嫩，果肉多汁，含丰富维生素C ，有帮助消化的功效，含有特殊的浓郁水果芳香，与此同时，草莓还可以巩固齿龈，清新口气，润泽喉部。 草莓有许多品种，在适合在贵州栽培的较少，而黔莓I号以其优异的特性渐渐取代了原来的退化的品种。黔莓I号品种来源：黔莓I号草莓是由章姬与法兰帝杂交选育而成的新品种2。具有如下特征特性：属早熟品种。生长势强，分蘖性中等，
5、匍匐茎发生容易。叶大近圆形，绿色，托叶浅红，无叶耳。花序连续抽生性好，粗壮，梗长，花朵大，白色，两性花，花数812枚，雄蕊1922枚，花萼双层，宿萼绿色，主萼平离副萼反卷，萼心凹陷，除萼容易。果实圆锥形，红色，光泽好，果肉橙红色，髓心白色、小，果实完熟后髓心略有空洞，果尖着色易，萼下着色较慢，种子黄绿色，凹陷。果肉质地韧，味清香，风味酸甜适口。单果重26.4克，单株产量290.4克。耐寒性、耐热性及耐旱性较强。品质：可溶性固形物含量9.9%，糖含量7.78%，可滴定酸0.45%，Vc含量92.34mg/100g，果实硬度较好，储运性较好。栽种也是较为简单方便，技术难度不大，都适用于农田和大棚栽
6、种，所以推广起来也较为容易,因此在贵州得到较大发展。1.2研究和发展前景植物组织培养是本世纪初开始, 以植物生理学为基础并在德国植物学家G.Haherlarld 提出的“植物细胞具有全能性(1904年)”的设想指导下,经许多学者努力开拓而逐步发展起来的一项生物技术3。根据细胞理论，提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞的植物细胞全能性的理论。我国兴起相对较晚，于70年代的育种才掀起高潮。但不可否认，自诞生以来, 植物组织培养技术在应用研究中已显示出很好的潜力和效果4。随着科学技术的不断发展, 研究领域的不断拓展与深入, 植物组织培养技术的应用也越发的广泛5。草莓组织培养以往的研究
7、主要局限于去病毒、快速繁殖和种质冷藏等方面，植物脱毒和离体快速繁殖也是目前应用最多、最有效的一项组培技术6。国内对草莓离体培养与再生研究已有许多报道，但其胚性愈伤组织诱导率及植株再生率都较低，影响了草莓体细胞胚状体的应用。近年来，一些学者对影响草莓体细胞胚状体诱导及再生的因素进行了研究，主要集中在外植体的选择、培养基、培养方式与环境等方面；比较突出的是无糖组织培养，由日本千叶大学古在丰树教授研究开发的一种新的植物组培技术7。我国现阶段的理论研究与生产技术相对落后，组织培养技术用于商品开发起步较晚，设备落后，理论研究不够透彻，研发项目不多，技术应用更少。在推广应用环节存在普及深度不够的问题，如目
8、前组织培养的研究只局限于较大的科研单位，与新品种选育结合得不紧密，而许多较大的苗木公司及个体经营者又没有真正认识到组织培养的意义。未来组培技术的发展，可能会随着社会的发展带来的问题展开，在保护物种方面，改进优良品种体系方面将会有广泛应用，如我国苹果属植物组织培养快速繁殖技术8的开发；因此植物组织培养技术的发展空间，技术改进等方面都将会有突破性的进展。1.3 研究的目的和意义外植体是指植物组织培养中的各种接种材料，从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同，其培
9、养的微环境9也有所要求。为保证植物组织培养更容易获得成功，所以选择合适的外植体是非常重要的。草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物, 因其在种苗繁育上长期采用营养繁殖致使病毒不断累积而导致草莓产量降低、品质变劣等退化现象, 且一旦感染病毒便会代代相传。因此, 培育和应用脱毒苗是改善草莓品质、提高产量的有效途径10。此次研究的目的就是要找出草莓植物组织培养，快速繁殖中几种常用的外植体，那一种更容易培养，存活率最高。近年来，贵州的草莓生产逐步扩大，而在我们当地种植最广泛的，在下司的花桥等地11种植的圣峰，因为多年种植，已经慢慢退化，所以需要获得一个适合贵州地区的草莓品种。而黔莓I号就是经育种而成的一个新
10、品种，因为要大面积推广种植，所以必须找到一个快速繁殖的办法。现阶段的开放式组织培养12研究还在处于初探阶段，所以以传统方式的组培找出适合的方式，就可以得到不改变原有的优良性状且抗性强的种苗。本次试验只进行初步的组织培养，不对培养中的常见问题13深入研究，但对其研究也有一定的参考价值。2 实验器材药品：NH4NO3 、 KNO3 、CaCl22H2O 、 0.1%升汞等器材：冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、无菌操作台、光照培养箱、电磁炉、分析天平、烧杯、容量瓶、培养皿、培养瓶、解剖刀、枪形镊、脱脂棉、滤纸等。材料：草莓种苗（黔莓I号）3 黔莓I号不同外植体的组织培养3.1 组培对象 本次试验用草莓的作
11、为试验材料，选择适合在贵州种植，方便取材的黔莓I号作为研究对象，取它的不同部分，分别以茎节，叶和芽作为不同外植体进行植物组织培养。3.2 培养基的配制 本次试验所用的基本培养基都是一样的，选用MS培养基（配方见表一），使用的生长调节剂也都是6-BA（萘乙酸）和NAA（6-苄基嘌呤），培养基的PH值为5.8。配制培养基时，采用先配制母液的办法配制大量元素（10倍）、微量元素（100倍）、铁盐（10倍）和有机成分（10倍）四种母液，其中大量元素中的CaCl22H2O（10倍）可以单独配制母液，这样效果更好，以解决大量元素浑浊的问题；植物生长调节剂也分别配制成母液(0.1 mg/mL)，其配制方法是
12、：分别称取这种物质10 mg，将NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期、每升移取量等，保存在冰箱的冷藏室中，妥善保管14。然后在根据倍数分别取量母液来配制培养基，配制好的溶液需要定容和测量PH值，再加入碳源（蔗糖）和琼脂，加热使琼脂充分溶解，需注意加热时烧杯炸裂和造成烫伤，搅拌均匀后趁热快速分装到培养瓶中，每次实验需制备3L培养基，每种外植体需制备30瓶
13、，将培养平均倒入培养瓶中，每瓶约30毫升。表一 MS培养基用量一览表原配方中的量（mg/mL）理论称量（g）实际称量（g）大量元素（10100 mL）NH4NO3 KNO3 CaCl22H2O MgSO47H2O KH2PO4 微量元素(100100 mL)KI H3BO3 MnSO4H2O ZnSO47H2O Na2MoO42H2O CuSO45H2O CoCl26H2O 铁盐(母液)（10100 mL）Na2-EDTA2H2OFeSO47H2O 有机成分(母液)（10100 mL）甘氨酸 盐酸硫胺素(VB1)盐酸吡哆醇(VB6)烟酸肌醇琼脂蔗糖PH165019004403701700.83
14、6.216.98.60.250.0250.02537.327.82.00.40.50.51006g30g5.816.5194.43.71.70.0830.621.690.860.0250.00250.00250.3730.2780.020.0040.0050.00516g30g5.816.500519.00064.40263.70091.70030.08380.62011.69050.86090.02540.00270.00250.37310.27800.02000.00410.00520.00501.00076.0005g30.0002g5.83.3 培养基的灭菌将已经分装好MS培养基的培养
15、瓶和其他需要灭菌的物品，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口)，用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等都用报纸包裹好，然后一起放入灭菌锅内，也可以把所需的无菌水一起灭菌，码放完毕后盖紧锅盖进行灭菌，在101kPa、121下，灭菌20 min，灭菌后取出培养瓶让其自然冷却，最好放置一天后在使用。3.4 外植体的消毒和接种将采集来的外植体首先要去除不用的部分，然后用清水洗净，视情况可以适当用软毛刷和加入洗涤剂洗，以便去除外植体上的污染物；再洗之前可以先开启紫外灯进行无菌操作台的灭菌，超净工作台起码要照射20分钟以上才可以进行外植体表面的灭菌
16、；外植体的表面灭菌是在超净工作台上进行的，消毒时可以先70%的酒精来消毒10-30秒，用清水洗2-3次后，再用次氯酸钠泡10至15分钟，然后用无菌水清洗35次，再用0.1%升汞浸洗10分钟左右，用清水冲洗5-7次。将消毒好的外植体取出，用吸水纸吸干，在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；接种时叶片要切得小块，大约0.5cm平方的小块，茎切成含有一个节的小段，叶片每瓶放入3-4块，茎节和芽每瓶放入2棵，芽要剥去剥去残留的部分，露出新鲜的芽，如果遇到大小不一的或损伤的部分，可以适当切除掉然后，用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上，注意放置外植体时形态学上端向上，打开或关闭
17、瓶口时都要过下火焰数秒钟。接种时，芽、叶和茎节分类接种，在接种完毕后要及时的贴上标签才放入光照培养箱培养。3.5 外植体的组织培养 接种好后，把培养瓶放在恒温培养箱里进行初代培养，参照光对植物组培的影响15，培养温度一般设在25左右，每天光照8-12小时，初期可以光照时间长一些。第三天观察细菌污染，一周观察霉菌污染及褐化情况。15天左右，记录外植体的萌发情况，前期每天观察一次，中后期就2-3天一次，观察内生菌污染、玻璃化情况，及时的把他取出来放在一边单独培养观察，做好各项记录。3.6 培养结果和数据统计（见表二）以上实验重复三次，均按照相同的方法处理得到数据，统计如下表二所示。已进行培养的黔莓
18、I号的芽、叶和茎节3种不同外植体中，经过初代培养后，叶获得少许愈伤组织，芽逐渐长成新叶，茎节从节处长出新芽。芽的成活率和污染率都相对较高，只有叶在培养过程中产生了一些愈伤组织，而茎节虽然能够存活，但存活率较低。在统计的时候发现有污染和存活交汇的情况，也有死亡而非是褐化造成的情况，培养基也会有松散，但是极少出现。表二 黔莓I号不同外植体培养数据统计芽平均值存活数（棵）死亡数（棵）褐化数（棵）污染数（瓶）存活率死亡率褐化率污染率培养基松散（瓶）5466990%10%10%30%1481211680%20%18.33%20%049119881.67%18.33%15%26.67%150.339.67
19、8.677.6783.89%16.11%14.44%25.56%0.67叶平均值存活数（瓶）死亡数（瓶）褐化数（瓶）污染数（瓶）存活率死亡率褐化率污染率培养基松散（瓶）201010266.6%33.3%33.3%6.67%12377276.67%23.33%23.33%6.67%22198170%30%26.67%3.33%021.338.678.331.6771.11%28.89%27.78%5.56%1茎平均值存活数（棵）死亡数（棵）褐化数（棵）污染数（瓶）存活率死亡率褐化率污染率培养基松散（瓶）144645123.33%76.67%75%3.330174343028.33%71.67%7
20、1.67%01204039233.33%66.67%65%6.67%2174342.33128.33%71.67%70.56%3.33%14 分析和结论4.1 污染和褐化问题的分析在本次试验没有出现玻璃化的问题16，主要有其他两个大问题对试验影响较大。首先是污染问题17，造成污染的原因很多，主要原因可以归纳为两类问题。首先细菌，霉菌的污染，可能是由于接种时接种环境的消毒没有做好、接种时操作失误造成污染或者人为原因造成的灭菌效果不佳导致的污染，另外消毒剂的时间没有控制好，达不到原有消毒效果也可能造成污染；二是外植体的内生菌造成的污染，这种污染一般不会造成大面积污染，在外植体上或者周围。其次就是褐
21、化问题，褐化问题17-18是比较突出的问题，在植物组培中也常常遇到，究其原因有很多，分析本次试验褐化的原因，主要是在接种时切割外植体对其造成的巨大损伤导致的褐化，取材和时间也对其褐化造成影响。因为是同一种植物，相同处理条件，基因型、环境、培养基成分等问题不是造成本次实验褐化的主要原因。针对褐化问题可以采取在培养基成分上多添加琼脂，培养初期增加光照，切割时尽量避免人为的损伤等，以减少外植体的褐化。4.2 试验结果的分析本次试验中用芽作外植体的存活率较高，因为芽是被包裹着进行表面消毒的，起到一定的保护作用，在取芽尖时也只切一头，所以损伤也比较低，也就不容易褐化。而污染率相对较高不是由于霉菌和细菌等
22、的污染，其中多是小面积，生在芽周围的内生菌造成的污染；对于大面积污染的另一个原因有可能是瓶中积水造成的，积水把外植体带的内生菌扩散开来造成较大面积污染，所以其中存在外植体存活的也有被污染的，而有些褐化死亡的却没有被污染的情况。用叶作为外植体，由于叶片较薄，方便切割成小块，一刀就可以切下来，相比切茎节损伤较小，所以存活数相对较多，褐化也不算严重，但是切割会对其造成机械损伤，褐化也在所难免。有少部分污染，由于霉菌和细菌等污染造成的，其中叶片的诱导率并不高，其原因可能是激素的比例问题。用茎节作为外植体时，使用升汞作为消毒剂，杀菌效果较好，几乎没有造成污染；但死亡率和褐化问题严重，死亡的原因也是因为褐
23、化问题。分析原因，接种的时，茎节需要两面切割才能接种，所以损伤最大，褐化就比较多；但是表面消毒和灭菌效果也是当中最好的。如要使用它作为外植体，需要改进操作，避免切割造成的损伤，降低褐化率。4.3 结论在植物组织培养中，选择不同的外植体来进行组织培养效果是不一样的，这不仅是每种植物间的差距，植物的不同部分作为外植体也有一定的差距，根据差异就可以选着适合的部分作为外植体。从本次试验可以可以得出，选择芽作为外植体，由于存活率较高，可以得到较多幼苗；选择叶作为外植体，加以适当的激素可以产生较多愈伤组织；用茎作为外植体就需要注意解决褐化问题带来的影响，找出一个损伤较小的办法，使得存活率能进一步提高。选择
24、叶作为外植体进行植物组织培养，不仅可以获得大量愈伤组织，还有获得无病毒植株，所以筛选黔莓I号的叶作为外植体合适一些。参考文献:1 郭延平. 草莓离体试管苗光合作用的研究 J . 果树科学, 2000, 17（3）2 乔荣,钟霈霖,杨仕品,王天文.草莓新品种黔莓1号.果农之友.2011年11期3 张淑红.植物组织培养及其发展方向.辽宁省盐碱地利用研究所.2003年第6期4 伊华林.我国经济植物组织培养概况.湖北农学院学报,第21卷第3期.20015 张东旭,周增产,卜云龙,张洁,张晓文,张成波.植物组织培养技术应用研究进展.北方园艺2011(06):209 2136 肖哲丽,柳金凤.植物组织培养
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