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1、第十章,凝胶层析法,第十章,凝胶层析法,第一节凝胶的条件和类型,第二节基本原理,第三节,凝胶层析的实验技术,第四节,凝胶层析的应用,第一节,凝胶的条件和类型,?,层析凝胶必须具备下列条件：,?,凝胶层析中常用凝胶类型,层析凝胶必须具备下列条件,1.,凝胶必须是化学惰性的,2.,凝胶的化学性质必须是稳定的,3.,凝胶上没有或只有极少量的离子基团,4.,凝胶必须具有足够的机械强度,凝胶层析中常用凝胶,葡聚糖凝胶,(,dextran gel,，,Sephadex,),聚丙烯酰胺凝胶,(,polyacrylamide gel,，,Bio-Gel P,),琼脂糖凝胶,(,agarose gel,，,Se
2、pharose,),琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶,(,Superdex,),葡聚糖凝胶部分结构,葡,聚,糖,凝,胶,部,分,结,构,(Sephadex,),聚丙烯酰胺凝胶,聚,丙,烯,酰,胺,凝,胶,的,部,分,结,构,(Bio-Gel P,),琼脂糖凝胶,(Sepharose),(Sepharose),琼脂糖凝胶的部分结构,第二节,基,本,原,理,一、凝胶的结构与分子筛效应,二、凝胶床总体积,三、分配系数（,Kd,）,四、有效分配系数（,Kav,）,五、分子量与,Ve,的关系,一、凝胶的结构与分子筛效应,动画演示,二、凝胶床总体积,Vt,：柱床,“总容积”，,Vo,：即存在于柱床内凝,胶颗粒
3、外面空隙之间的,水相容积,Vi,：即凝胶颗粒内部所,含水相的容积。,Vg,：凝胶本身的容积；,Vt,Vo,十,Vi,十,Vg,或,Vt-Vo=Vi,十,Vg,，,三、分配系数（,K,d,）,0,K,d,1,，,Ve,在,Vo,与,Vo,十,Vi,之间变化,Ve,：为实际测得的洗,脱容积，自样品加入,到组分最大浓度,(,峰,),出,现时所流出的容积；,Vi,Vo,Ve,Kd,),(,?,?,V,e,V,o,十,K,d,V,i,四、有效分配系数（,K,eff,）,）,（,）,（,0,0,V,V,V,V,K,t,e,eff,?,?,?,Vi,Vo,Ve,Kd,),(,?,?,将,Vt-Vo,代替,V
4、i,，则：,即：,Ve,Vo,十,K,eff,(Vt-Vo),实际上，,K,eff,是,将以水作为固定相,(Vi),改为水与凝胶颗粒,(Vt-Vo),作为固,定相，而洗脱剂,(Ve-Vo),为流动相。,Kav,与,Kd,对交联度小的凝胶差别较小，,而对交联度大的凝胶差别大。,在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过,Vt,体积后，,所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点，,五、,Ve,与相对分子量的关系,Ve=K,1,-K,2,lgM,K,1,、,K,2,为常数，,Ve,可用如下表达,式代替，,Ve-Vo,（分离体积），,Ve/Vo,（相对保留体积），,Ve/Vt,（简
5、化洗脱体积），,K,eff,（相对洗,脱体积）,在不同型号凝胶上蛋白质,的选择曲线的,差异,第三节,凝胶层析的操作技术,一、凝胶的选择与处理,二、凝胶装拄制备,三、样品上柱及洗脱,四、实验操作,五、凝胶柱的保养和凝胶的保存,一、凝胶的选择,?,排阻范围与粒度的选择,?,凝胶用量的计算,排阻范围的选择,粒度的选择,粒,度,的,选,择,凝胶用量的计算,干凝胶用量（,g,）：,r,2,h/,膨胀度,（膨胀度：,床体积,/,克干胶）,理论用量（,1+10%,）凝胶的处理,Sephadex,G-25,G-75,G100,G-150,G-200,（中）湿球粒度,m,100-,200,120-,200,20
6、-,200,120-,200,120-,200,吸水值,ml/g,干胶,2.5,0.,2,7.5,0.,5,10.0,1,.0,15.0,1.,5,20.0,2,.0,床体积,ml/g,干胶,4-6,12-15,15-20,20-30,30-40,球蛋白分离范围,KD,1-5,3-80,4-150,5-300,5-600,二、凝胶装拄制备,1.,柱结构（、,h,）的,选择,2.,装柱,3.,柱鉴定,柱结构（,、,h,）的选择,三、样品上柱及洗脱,?,加样量的控制,分析：,1-2ml/100ml,床体积,制备：,10-30ml/100ml,床体积,?,洗脱液的选择,控制凝胶收缩,?,影响洗脱的,
7、因素,流速对蛋白质分辨率的影响,操作压与流速的关系,流速对蛋白质分辨率的影响,黏度对分辨率的影响,黏,度,对,分,辨,率,的,影,响,凝胶柱层析操作压,操作压与流速的关系,加样量对分辨率的影响,I.,加养量少时，,A,、,B,二种物质充全,分开。,II.,加养量适当,时，,A,、,B,二种物,质刚刚分开。,III.,加养量太大,时，,A,、,B,二种物质,只能部分分开。,四、,凝胶层析的操作技术,1.,凝胶的,处理,2.,柱层析系统的,安装,3.,凝胶,装拄,4.,样品,上柱及洗脱,5.,Vo,、,Vi,、,Vt,的,测定,6.,标准曲线的制作及,Kd,和,Kav,的,计算,7.,凝胶柱的保养
8、和凝胶的,保存,1,、凝胶的处理,将称好的干粉倾人过量的洗,脱液中，室温下充分溶胀。,注意不,要过分搅拌，以防颗粒破碎。,为了,缩短溶胀时间，可在沸水浴中加热,溶胀,3-5,小时，这样还可以杀死细,菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。,为了保证流速稳定，获得较,好的实验结果，使用前用倾泻法倾,去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗,粒大小一致，。,2,、柱层析系统的组装,柱层析系统的安装,3,、凝胶装柱,。,将层析柱垂直装载支架上，,将下端输液管夹紧；,向柱中加入约,1/3,体积的,0.9,NaCl,溶液；,将一细玻棒伸入柱内，靠近,管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内,加入混匀的凝胶溶液；,凝胶加至层析柱顶端约,3
9、cm,时，打开柱下端输液开关，使流,速控制在,0.25-0.5ml/cm,2,nim。,连续而缓慢的加凝胶直到稳,定在离管口约,5cm,处。,（防止空气进入凝胶床）,4,、样品上柱及洗脱,加样量的控制,分析：,1-2ml/100ml,床体积，,制备：,10-30ml/100ml,床体积,洗脱液的选择：,洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶,液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而,影响分离效果。,凝胶层析加样,操作示意图,洗脱与自动收集,记录,凝胶柱层析,实物,连接,凝胶层析中的,分离行为,凝胶层析加样操作示意图,1,、平衡好的层析柱。,2,、沿管壁将样品溶液小心加,到凝胶床面上，应避免将床面凝
10、,胶冲起。,3-4,、打开下口夹子，使样品,溶液流入柱内，同时收集流出液，,5-7,、当样品溶液流至与胶面,相切时，夹紧下口夹子。按加样,操作，用,1mL,洗脱液冲洗管壁,2,次。,8-9,、最后加入,3,4mL,洗脱液,于凝胶上。,10,、连接柱层析系统，自动收,集记录。,洗脱与自动收集记录,凝胶柱层析实物连接,凝胶层析中的分离行为,蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾,(,黄色,),5,、,Vo,、,Vi,、,Vt,的测定,Vo,的测定,选,用分子量约,200,万的蓝色葡聚糖,-2000,（或一种不被,凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察,),，测定它的洗脱,曲线，洗脱峰峰顶洗出的
11、体积（,Veo,）就是该柱的,Vo,值。,Vi,的测定,选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出,其洗脱体积,Vei,，减去,Vo,就是该柱的,Vi,。常用铬酸钾,(,黄色,),或有,UV,吸收的物质如,N-,乙酰酪氨酸乙酯来测定,Vi,。,Vt,的测定,式中，为常数,3.14,，,D,为柱直径，,h,为凝胶床的高度。,h,D,Vt,?,?,2,2,）,（,?,6,、标准曲线的制作及,Kd,和,Kav,的计算,?,按操作技术,4,的方法，将,1mL,标准蛋白质混合液上柱，,然后用,0.025mol,L,氯化钾,-0.2mol,L,乙酸溶液洗脱。,流速,3mL,10min,，,3mL,管
12、。用核酸蛋白质检测仪,280nm,处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线，,或收集后用紫外分光光度计于,280nm,处测定每管光吸,收值。,?,以管号,(,或洗脱体积,),为横坐标，光吸收值为纵坐标作出,洗脱曲线。,?,根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积,(Ve),，以,蛋白质分子量的对数,1gMr,，为纵坐标，,Ve,为横坐标，,作出标准曲线。,?,根据已测出的,Vo,和,Vi,以及,Vt,，分别求出,Kd,和,Kav,7,、未知样品分子量的测定,完全按照标准曲线的条件操作。,根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗,脱体积，重复测定,1-2,次，取其平均值。,也可以计算出,Kav,分别由标准
13、曲线查得,样品的分子量。,8,、凝胶柱的保养和凝胶的保存,凝胶的保存可采用以下两种方法：,（,1,）经常使用的凝胶以湿态保存为宜，加入适,当的抑菌剂。常用的抑菌剂,:0.02,叠氮钠,(2),较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。,依次用,70,、,90,和,95,乙醇逐步脱水，,使,凝,胶,皱,缩,，,最,后,用,乙,醚,洗,涤,干,燥,或,在,60-,80,下烘干。,第五节,凝胶层析的应用,?,脱盐和浓缩,?,分离生命物质,?,测定分子量,思考题,凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为,8,万,和,10,万的蛋白质能否在,Sephadex G-75,柱中分开？为什,么？,概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？,在,4,60cm,和,1,60cm,；,1,40cm,和,1,80cm,两组交两,组交联葡聚糖,G-100,柱中，当每,cm2,截面积上流速和分级,收集体积一致时，问两组柱中那一种分辨率高？为什么？,在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为,140ml,其外水体积和总体积分别为,60,和,200ml,，求分配系数是多,少？,在,5.0,60cm,的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多,加样体积是多少毫升？,稍息,
