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1、.,1,分 子 诊 断 与 临 床,.,2,主要内容,概述分子诊断的常用技术分子诊断在临床的应用分子诊断在应用中的问题及对策分子诊断的发展方向,.,3,检验医学,临床基础检验学临床生化检验学临床免疫检验学临床微生物检验学临床血液检验学临床寄生虫学临床分子诊断学(基因诊断=PCR?)科研平台？,.,4,分子诊断学,以分子生物学理论为基础利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白）和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据检验医学的分支学科之一,.,5,分子诊断学的研究对象,生物大分子核酸：DNA、RNA
2、蛋白大分子体系基因细胞组织,.,6,临床学诊断,不同诊断方法的研究对象,.,7,分子诊断的策略,遵循实验诊断学的基本原则不同疾病及病因采用不同方法根据检测目的开展不同层次的检测注重环境基因组学研究成果发挥在耐药性方面的潜在作用在疾病预测、健康检查、个体化治疗中的作用关注分子诊断中的医学论理和生物安全问题开发简便、快速、准确、特异、灵敏的方法,.,8,二、分子诊断的主要技术,低通量技术DNA分析：Southern blot、PCR、RFLP、ASO、SSCP、DGGE、DHPLC、DNA含量测定染色体分析：FISH、CGHRNA分析：ISH、Northern blot、RT-PCR蛋白质分析：I
3、HC、Western blot,.,9,高通量技术核酸测序技术基因诊断的金标准生物芯片(基因芯片)技术蛋白质组学技术 2-DE质谱技术：MALDI-TOF组织芯片蛋白质组信息学,.,10,RLFP原理,.,11,FISH NTERT-1与人着丝粒DNA片段杂交（绿），与人端粒DNA片段杂交（红）,.,12,二、几种常用的分子诊断技术,核酸扩增分子克隆核酸分子杂交DNA测序单核苷酸多态性分析技术生物芯片技术蛋白质组学技术生物信息学,.,13,1、PCR,体外核酸扩增生物技术领域最重要四项技术之一细胞整合技术分子克隆技术蛋白工程技术,.,14,模板DNA,94变性,55退火,72引物延伸,第二次循
4、环,模板变性退火,延伸,经25-30次循环，目的DNA增加106-7,PCR原理示意图,.,15,2、分子克隆,（基因克隆，基因重组）基本步骤分切接转筛,含重组子的阳性克隆,DNA重组体,分,切,筛,转,.,16,3、核酸分子杂交,定义不同来源的、具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下通过碱基配对原则形成双链的过程分子杂交技术的理论基础 DNA（RNA）的变性与复性,.,17,核酸分子杂交,基本类型Southern杂交-待测核酸是DNA片段Northern杂交-待测核酸是RNA片段衍生类型：斑点杂交、原位杂交 等,.,18,Southernblot操作流程,.,19,.,20,斑点杂交示意图,
5、.,21,4、DNA测序,已知序列的验证性测序策略 未知序列的从头测序策略 随机测序法（鸟枪法、人工转座子法）定向测序法（引物测序法、互套缺失法）全基因组测序策略,.,22,DNA测序常用技术,链末端终止法（Sanger法）化学降解法 测序新技术 MALDI-TOF MS杂交测序法焦磷酸测序技术 原子探针显微镜法单分子测序技术自动化测序-常规应用,.,23,链末端终止法测序原理,化学降解法测序原理,.,24,自动化测序,充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、安全、精确、并行和高效等特点目前，自动化测序已成为DNA序列分析的主流，几乎完全取代了手工测序类型：基于单一荧光染料标记的自动化测序系统
6、 基于多种荧光染料标记的自动化测序系统,.,25,单荧光,多荧光（四荧光）,.,26,377型DNA 全自动测序仪,.,27,5、单核苷酸多态性分析技术,SNP：第三代遗传标志，是决定人类疾病易感性和药物反应差异性的主要因素SNP检测技术基本步骤靶序列的扩增SNP特异位点的区分 方法：杂交、PCR、分子构象、酶法等数据的检测分析 方法：凝胶电泳、荧光检测、基因芯片、质谱分析 等,.,28,主要的SNP检测方法,凝胶电泳分析技术 SSCP、TTGE、TGGE、DGGE分子杂交技术 ASO、DASH、PNA杂交、LNA 杂交荧光共振能量转移 Taqman探针技术、分子信标技术、蝎状探针技术、替代探
7、针技术,.,29,PCR-SSCP,.,30,6、生物芯片技术,技术的核心：杂交技术实质：分子生物间特异性相互作用（互补配对）步骤：已知物质点样（阵列）加标记的待测样品，杂交检测数据分析、处理优点：高度并行性、多样化、自动化、微型化缺点：只能检测已知的大分子 不能发现未知的大分子,.,31,应用 核酸分析（基因表达分析、基因突变检测、基因测序、基因图谱制作、多态性分析）、药物研究、蛋白质组鉴定及微生物菌种鉴定主要类型基因（DNA）芯片RNA芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片芯片实验室(Lab-on-a-chip),.,32,6400点的基因芯片（面积 1214 mm),.,33,7、蛋白质组学,蛋
8、白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质功能与细胞生命活动规律的相互关系。研究对象的整体性研究目标的动态性体现生命的复杂性,.,34,蛋白质组学,研究范畴：蛋白质与蛋白质间的相互作用蛋白质与核酸间相互作用蛋白质及其组成质点的分离、分析与鉴定蛋白质结构分析生理与病理状态或不同发育阶段的蛋白质表达差异丰富与完善蛋白质信息库,.,35,蛋白质组学的常用分析技术,从技术层面来讲的，它是一门综合的分析技术，主要有3个方向为蛋白质组学研究提供技术平台。蛋白质组分
9、离技术：双向电泳（2-DE）蛋白质组鉴定技术：图像分析技术、微量测序、蛋白质质谱、氨基酸分析蛋白质组数据库的建立和生物信息学,.,36,2-DE,.,37,酵母双杂交技术的原理,.,38,8、生物信息学,概念：以数学、信息学、计算机学为主要手段，以计算机硬件、软件和网络为主要工具，对巨量的数量进行处理、存储、分配和解释，成为具有明确生物学意义的生物信息，并通过对生物信息的查询、搜索、比较和分析实现其研究目标（基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律律），解释生命的遗传语言，探索生命起源、生物进化的基本规律，探索细胞、器官和个体发生、发育、衰亡等生命科学中的重大问题。研究对象：生物学数据研究核
10、心：基因组信息学,.,39,生物信息学,广义：使用数学和信息学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物数据和资料的一门学科。狭义：主要指基因组信息学，即以计算机和互联网为主要手段，采用计算机学和数学处理DNA及其编码的大分子物质的信息，寻找其规律性。流程：建立数据库，将获得的物质信息进行比较,.,40,现有的数据库,基因组数据库人类基因组数据库：NCBI genome、GDB、Ensembl、Genatlas模式生物基因组数据库：SGD、MGI核酸序列数据库：GeneBank、EMBL-DNA、DDBJ、Unigene、HGMD蛋白质数据库：PIR、SWISS-PORT结
11、构数据库：PDB、SCOP、CATH、COG功能数据库：KEGG、DIP、TRRD、ASDB,.,41,中国生物信息数据库,中国国家生物医学数据库中国核酸序列数据库中国核酸序列数据库中国人核酸序列统计数据库,.,42,三、分子诊断在临床的应用,单基因疾病的分子诊断多基因疾病的分子诊断肿瘤的分子诊断与预测感染性疾病的分子诊断在耐药性研究中的价值在个体化治疗中的应用分子诊断在临床的其他应用,.,43,1、单基因疾病的分子诊断,血红蛋白病的分子诊断肌营养不良症的分子诊断血友病的分子诊断1抗胰蛋白酶缺乏症的分子诊断Lebers遗传性视神经病变的分子诊断其他单基因疾病的分子诊断,.,44,镰状红细胞贫血
12、患者基因组的限制性酶切分析,谷氨酸(GAN)缬氨酸(GUN)HbA HbS,.,45,镰状红细胞贫血基因组的PCR-RFLP电泳图,.,46,DMD基因缺失的多重PCR诊断。共采用9对引物，可见患者（P）有电泳带的缺失。,.,47,2、多基因疾病的分子诊断,糖尿病的分子诊断家族性高脂血症的分子诊断高血压的分子诊断支气管哮喘的分子诊断皮肤的复杂疾病,其他：冠心病、动脉粥样硬化、胃及十二指肠溃疡、精神分裂症、风湿病、癫痫、甲亢、唇裂、腭裂等。,.,48,遗传病的基因诊断方法选择原则,.,49,3、肿瘤的分子诊断与预测,肿瘤的分子分类与分期肿瘤的分子标志肿瘤的分子诊断肿瘤的分子预测,.,50,肿瘤的
13、分子标志,.,51,肿瘤基因的分子诊断,肿瘤的早期诊断和筛选肿瘤的疗效监测 肿瘤的预后判断 肿瘤微转移检测,主要方向,.,52,4、感染性疾病的分子诊断,诊断途径：感染性病原体的分子诊断感染性病原体的分型检测感染性病原体的耐药监测人感染性疾病的易感基因检测感染组学-对感染性疾病的总体性和综合性研究,.,53,感染性疾病的分子诊断,分子诊断方法核酸杂交技术核酸扩增技术基因定量诊断技术基因芯片技术蛋白质组学技术,.,54,感染性疾病的分子诊断,目前主要的应用病毒的分子检测细菌感染的分子检测衣原体的分子检测支原体的分子检测螺旋体的分子检测原虫的分子检测,.,55,5、分子诊断在耐药性研究中的应用,微
14、生物耐药性的研究耐药基因的检测与分析 PCR、PCR-SSCP、PCR-RFLP、核酸杂交、FQ-PCR、基因芯片等耐药菌株的鉴定与分析 质粒谱DNA指纹分析、DNA的特异性位点分析、全基因DNA指纹、基因芯片,.,56,分子诊断在耐药性研究中的应用,肿瘤的多药耐药基因的检测与分析主要的MDR基因mdr1-p-蛋白MRP-多药耐药相关蛋白LRP-肺耐药相关蛋白Topo-DNA拓扑异构酶同工酶GSTp1-谷胱甘胱S-转移酶P1-1同工酶,.,57,6、在个体化医疗中的应用,个体化医疗个体化医疗的前提药物基因组学与个体化用药肿瘤的个体化治疗,.,58,7、分子诊断的其他应用,在移植配型中的应用在法
15、医学中的应用在产前诊断中的应用在新生儿筛查中的应用在预防医学检验中的应用,.,59,RFLP在法医学中的应用,.,60,四、分子诊断在应用中的问题及对策,在感染性疾病检测中的问题与对策易感基因诊断中的问题与对策肿瘤的分子诊断和预测的问题与对策分子诊断中的伦理问题分子诊断中的质量问题与标准化,.,61,1.在感染性疾病检测中的问题与对策,问题：病原微生物日益复杂新病原体的出现耐药株的出现对策：开发快速、准确、特异、灵敏的新方法新方法与传统方法、实验室检查与临床表现结合多种方法联合应用开发新方法，加强耐药性检测利用人易感基因检测进行诊断（如SNP）,.,62,2、易感基因诊断中的问题与对策,问题：
16、遗传异质性多因素复杂性假阳性存在拟表型各种因素导致的误导,.,63,易感基因诊断中的问题与对策,对策提高关联性检测的可能性选择单体型作为标志利用LD、tagSNP和单体型进行关联研究采用大样本研究提高关联研究的效应同时检测多个遗传标志根据环境因素和多基因因素进行分析,.,64,利用易感基因进行健康预测的问题,单基因疾病：检测相关基因或染色体畸变做健康预测，或产前诊断-可信的易 感 基 因：只能作有限的参考 原因：易感基因的研究和检测技术正处发展过程中并非所有疾病都可以预测现阶段发现的部分疾病的易感基因还难以直接应用于临床治疗和预防,.,65,3、肿瘤分子诊断的问题与对策,癌基因的激活、抑癌基因
17、的失活（或缺失）原癌基因细胞癌基因病毒癌基因生长因子及受体、蛋白激酶、转录因子等肿瘤抑制基因肿瘤转移相关基因肿瘤耐药基因 等,.,66,癌基因或抑癌基因在正常细胞的基因组中 存在 表达/不表达状态 表达程度肿瘤标志的特异性易感基因的关联性,肿瘤分子诊断的问题与对策,.,67,4、分子诊断中的伦理问题,医学论理学的一般原则：有利、无害、公正、尊重遗传服务：一种面向社会的应用遗传技术的医学实践 需遵守医学伦理学 实施依赖于分子诊断技术 内 容：遗传咨询、遗传检查、遗传筛查、基因治疗、辅助生殖等 主要途径：基因检查、染色体检查个人遗传信息的不当使用 遗传歧视,.,68,5、分子诊断中的质量问题和标准化,分子诊断实验室的质量管理一般实验室的质量管理特殊性的质量管理高技术性高严谨性高污染性分子诊断实验的标准化,.,69,五、分子诊断的发展方向,DNA DNA及其表达产物（mRNA和蛋白）单一技术 多项技术的有机组合定性诊断 半定量和定量诊断治疗性诊断 疾病的预防、预测性分析诊断技术由常规方法 生物芯片和蛋白质组学范围由单基因疾病、感染性疾病 多基因疾病应用范围由疾病的诊断、治疗 生命科学、环境学等领域,
