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1、1,动物细胞工程,2,动物细胞工程常用的技术手段：,动物细胞培养技术、动物细胞核移植技术、动物细胞融合技术、生产单克隆抗体技术,提问：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。,3,动物细胞与组织培养,动物细胞融合,单克隆抗体制备,体细胞克隆,细胞核移植,动物细胞工程技术,动物细胞工程的基础,4,一、动物细胞培养,概念:就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞，然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。,植物组织培养,在无菌和人工控制的条件下,将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工控制的培养基上，
2、给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。,5,1、动物细胞培养的原理是什么？2、从动物机体中要取出哪些相关组织？并 解释原因。3、组织分散成单个细胞的方法是什么？其理论依据是什么？4、动物细胞体外培养需要满足哪些条件？,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。,细胞增殖,阅读课本P44，简述动物细胞培养的基本过程,6,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,10代细胞,部分细胞“癌变”，遗传物质改变，无限传代,动物细胞培养不能最终培养成动物体,50代细胞,原代培养,传代培养,细胞贴壁,
3、剥离、分瓶,细胞株,细胞,细胞系,动物细胞培养过程,7,动物细胞生长特性,细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,8,细胞贴壁过程,9,有关概念:,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代培养。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数
4、细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,10,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质改变,11,思考讨论,1.动物细胞培养取材时，一般是取胚胎组织或幼龄动物的组织或器官，请解释原因。,细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年
5、动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养。,肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞,拓展-动物组织或细胞培养的难易程度,幼体组织或细胞 老龄组织或细胞,分化程度低的组织或细胞 分化程度高的组织或细胞,12,2、人类一般保存的是哪类细胞呢？为什么？,保存10代以内的细胞，因为其生物学特性未发生大的变化，最接近于体内组织或细胞的生长特性，很适合用于药物测试、基因表达等实验研究。,3、在动物细胞培养过程中，为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？,胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞;成块的组织细胞靠在一起,
6、彼此限制了细胞的生长和增殖.,13,.植物组织培养过程将组织分散成单个细胞的吗？.胰蛋白酶的作用是什么呢？由此可说明细胞间的物质是什么成份？.细胞膜的主要成份是什么？胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？.既然胰蛋白酶能将细胞消化掉，那将动物组织分散成单个细胞要注意什么问题呢？能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？,进一步思考：,否,胰蛋白酶水解蛋白质,蛋白质,蛋白质和磷脂,能,注意时间的控制,不能，因为两者的最适PH不同，而正常组织细胞的生存环境与胰蛋白酶的最适PH较接近,14,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的知识，认为体外培养细胞应该模拟内环境的哪些内容呢？,15,动物细胞培养条件
7、：,1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）,2、必须的营养物质（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、核酸、嘌呤、嘧啶、激素、生长因子、动物血清等。）,保证细胞顺利的生长增殖,3、适宜的温度 36.5+（-）0.5度,4、充足的氧气和适宜的酸碱度 O2和CO2（95%空气和5%CO2）,16,问题：,1、培养基的类型,（1）天然培养基：营养价值高，成分复杂（2）合成培养基：成分明确，便于控制试验条件,2、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组织培养基有何独特之处？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,独特之处有：1、液体培养基（动物体细胞大都生活在液体的环境
8、）2、成分中有动物血清等,17,获得细胞,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,或细胞产物,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物组织和动物细胞培养的比较,18,动物细胞培养应用,大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据,19,小结,动物细胞和组织培养（原理、材料选择及原因、一般过程、培养条件、主要应用）,
9、注意：概念理解：原代培养、传代培养、细胞株、细胞系胰蛋白酶处理的原因、目的和注意事项动物细胞培养和植物组织培养的区别,20,思考与探究：如何用细胞培养技术，为烧伤病人植皮？,取该患者的皮肤进行细胞培养,获得足量的细胞后再移植,21,1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是（）A细胞系 B细胞株 C原代细胞 D传代细胞2、动物细胞工程技术的基础是（）A.动物细胞融合 B.单克隆抗体C.胚胎移植 D.动物细胞培养3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异 B具有更强的全能性C.取材十分方便 D分裂增殖的能
10、力强4、下列属于动物细胞工程中的工具是（）A限制性内切酶 BDNA连接酶C胰蛋白酶 D果胶酶,A,D,练习,D,C,22,5、在动物细胞培养的有关叙述中，正确的是（）A动物细胞培养的目的就是为了获得大量的细胞分泌蛋白B动物细胞培养前要用胰蛋白酶处理使细胞分散C细胞遗传物质的改变发生于原代培养过程中D培养至50代后继续传代的细胞是细胞株6、在动物细胞培养中有部分细胞可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称之为（）A原代培养 B传代培养 C细胞株 D细胞系7、动物细胞培养的正确过程是（）A.原代培养传代培养细胞株细胞系 B.原代培养传代培养细胞系细胞株C.传代培养细胞系原代培养细胞株 D.
11、原代培养细胞系传代培养细胞株8、下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（）A培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清B原代培养的细胞一般传至10代左右便会出现生长停滞C动物细胞培养一般能够传到4050代，但其遗传物质发生了改变D动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞,B,D,A,C,23,下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此图回答,(1)容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自_。(2)容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是_，然后用 酶处理，这是为了使细胞分散开来。这样做的目的是_ _.(3)培养首先在B瓶中进行。瓶中的培养基成分有_ _ 等。在此
12、瓶中培养一段时间后，一般传到第 代，有许多细胞衰老死亡，到这时的培养称为_.(4)为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用_ _处理，然后配置成_，再分装。(5)在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡。原因是_。,幼龄动物的器官或组织、动物胚胎,剪碎,胰蛋白,使每个细胞能与培养液接触,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清,10,原代培养,胰蛋白酶,细胞悬浮液,细胞没有发生瘤变,24,概念：将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物,核移植,（难度高）,受体细胞：M期的卵母
13、细胞,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,细胞分化程度低，恢复全能性容易,25,体细胞核移植的过程,卵母细胞去核,体细胞取核,电刺激使两细胞融合,重组细胞,重组胚胎,新个体,26,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,27,克隆羊培育过程,另一头绵羊的子宫,28,、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。,、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？,10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变,思考题,29,3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行
14、了100%的复制吗？为什么？,不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞,4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？,在1997年2月英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性,30,体细胞核移植技术的应用前景,
15、1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育,2、保护濒危物种，增加存活数量,3、克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白,4、可以作为异种移植的供体，可以用于组织器官的移植,31,体细胞核移植技术存在的问题：,许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。,在研究方面，克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。在应用上，生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,32,“番茄马铃薯”理想图,通过长期的实验，科学家们采用体细胞杂交技术获得了“番茄马铃薯”植株。,33,杂种植株
16、,筛选融合AB的原生质体,再生出细胞壁,脱分化,愈伤组织,再分化,植物细胞的融合,植物组织培养,植物细胞A,原生质体B,原生质体A,杂种细胞AB,去 壁,去 壁,人工诱导,方法？,促进融合的方法？,融合完成的标志,植物细胞B,植物体细胞杂交技术过程,原理？,原理？,34,成果和未解决的问题,成果：克服不同生物远缘杂交的障碍，出 现自然界没有的新品种。,未解决的问题：未能让杂种植物按照人们 的需要表现出亲代的优良。,35,如果将牛的细胞与植物细胞杂交，得到绿色的小奶牛，那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶啦！,动物细胞也能融合吗？,36,动物细胞融合与单克隆抗体,37,一、动物细胞融合,1、动物融
17、合的过程,请同学们阅读课本P52动物细胞融合内容问题：什么是动物细胞融合？它相当于植物体细胞杂交过程的哪一步？它们的过程、基本原理、诱导融合方法和意义是否相同？,38,不同DNA的两个细胞,灭活病毒诱导细胞融合,融合后的细胞进行有丝分裂,1、动物细胞融合过程,灭活丧失感染性,保留融合活性,39,动物细胞融合过程、原理与诱导方法,40,思考题?,1、植物体细胞杂交时首先应用什么方法去掉细胞壁？,酶解法，如纤维素酶或果胶酶,2、动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？,无需，因为动物细胞无细胞壁,3、植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？,离心、电激等物理方法；PEG等化学方法,4、动
18、物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？,能 还可以利用灭活的病毒进行诱导,5、植物体细胞杂交应先进行原生质体的融合再进行组织培养形成完整的杂种个体，动物细胞融合后能形成杂种动物个体吗？,不能,6、你能归纳出什么叫做动物细胞融合吗？,41,2、动物细胞融合的概念,动物细胞融合也称细胞杂交，是指在一定条件下将两个或多个动物细胞形成一个细胞的过程.,42,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振动、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱,导细胞融合,去除细胞壁后诱,导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜
19、的流动性、,植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物、动物细胞融合的比较,43,7、你推测一下动物细胞融合有哪些方面的应用吗？,思考题,利用动物细胞融合技术诱导形成杂交瘤细胞,8、在生产实际中杂交瘤细胞有怎样的应用？,生产单克隆抗体,44,1.抗体是由何种细胞产生的？、一个淋巴细胞(浆细胞)能分泌多种抗体吗？、一种抗原侵入机体之后，引起机体免疫反应产生的抗体只有一种吗？.简述获得抗体的传统途径？、这种方法获得的抗体有什么缺陷？,二、单克隆抗体,45,问题：抗体由什么细胞产生？其化学本质是什么？与抗原作用的特点？主要分布在哪里？,1抗体,46,一个天然抗原物质可有多种和
20、多个决定簇。教材中所说的抗原分子刺激淋巴细胞，说的也就是抗原决定簇刺激B淋巴细胞，使其分裂分化出特异性的效应B细胞，分泌特异性抗体。,47,抗体的传统生产方法,从血清中分离抗体,该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。,多种效应B细胞,动物体内,多种抗体,抗原,48,抗体不纯,特异性差、纯度低；,产量低、反应不够灵敏,传统血清抗体的制备,抗原不纯,每个淋巴细胞只能分泌一种抗体，由一个淋巴细胞增殖产生的细胞群分泌的抗体化学成份是单一的。,如何获得化学性质单一、特异性强的抗体？,体外培养淋巴细胞能无限增殖吗?,体外培养单个淋巴细胞，提取分泌的抗体,怎样解决这个问题？,49,
21、设计方案：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,杂种细胞,既能分泌一种特异性抗体又能无限增殖,50,2.制备过程：,诱导其融合的方法有哪些？,融合后培养液中有几种细胞,怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点,注射抗原的目的是什么,为何要进行克隆化培养和专一抗体检测，多次筛选,大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法,51,B BB B瘤 瘤瘤 瘤,细胞融合后培养液中有几种细胞？,已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两条DNA合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加PEG促
22、融，在筛选培养基上筛选获得杂种细胞。,52,效应B细胞,B淋巴细胞,注射抗原,骨髓瘤细胞,融合,B-B细胞,杂交瘤细胞,瘤-瘤细胞,选择性培养基 筛选1,多种杂交瘤细胞,符合要求的杂交瘤细胞,抗原-抗体杂交法,筛选2,克隆化,体外培养,小鼠腹腔内增殖,单克隆抗体,杂交瘤细胞特点：既可以产生特异性抗体，又可以大量增殖,53,单克隆抗体的突出优点：,特异性强、灵敏度高、纯度高、产量大容易标化生产,克隆单个杂交瘤细胞，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。,原理：细胞膜的流动性、细胞增殖,54,3.单克隆抗体的应用：,在基础理论研究中具有重要意义,在疾病诊断、治疗和预防方面，具有 特异性高、灵敏度高等优越性。,生物导弹,55,思考题,制备单克隆抗体时，为什么要选用B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞？,假如你掌握了动物细胞融合技术，你想用它来解决什么问题？,
