《DNA分子标记的种类有哪些,各有何特点？ .doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA分子标记的种类有哪些,各有何特点？ .doc（24页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、DNA分子标记的种类有哪些，各有何特点？分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括：（1）限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）；（2）DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）；（3）原位杂交（in situ hybridization）等；第二类是以PCR反应为核心的分子标记技术，包括：（1）随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）；（2）简单序列重复标记
2、（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）；（3）扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）；（4）序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）；（5）序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；第三类是一些新型的分子标记，如：（1）单核苷酸多态性（Single nuleotid
3、e polymorphism, 简称SNP标记）；（2）表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。比较RFLP、RAPD、AFLP、SSR的差异和优缺点。RFLP，（Restriction fragment length polymorphism, 限制性片段长度多态性）：特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切
4、位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。基本步骤：DNA提取用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。 RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。随机扩增多态
5、性DNA标记(RAPD)：RAPD标记技术就是用一个（有时用两个）随机引物（一般8-10个碱基）非定点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。 RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（
6、5）实验重复性较差，结果可靠性较低。 AFLP：扩增片段长度多态性，其特点是把RFLP和PCR结合了起来。其基本步骤是：把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测。简单序列重复标记，SSR：又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA)标记，引物是根据微卫星DNA重复序列两翼的特定短序列设计，用来扩增重复序列本身。由于重复
7、的长度变化极大，所以是检测多态性的一种有效方法。属高度重复序列，重复单元26 bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重复，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。SSR标记的主要特点：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。比较大肠杆菌DNA聚合酶 I、II、 III 的性质目前已知的 DNA 聚合酶（ DN
8、A polymerase ）有多种，它们的性状和在 DNA 合成中的功能均不相同。在大肠杆菌中发现有 3 种 DNA 聚合酶，分别称为 DNA 聚合酶、。 1 、 DNA 聚合酶 I ： 单链球状蛋白，含锌。有聚合酶活性和外切酶活性，其中 3-5 外切酶活性起校正作用， 5 -3 外切酶活性起修复和切除引物作用。 DNA 聚合酶 I 主要起损伤修复作用。每秒可聚合 10 个碱基。切除氨基端后，其具有 5 -3 外切酶活性，称为 Klenow fragment ，用于引物标记等。 2 、 DNA 聚合酶 II ： 单链，以切口双链 DNA 为模板，作用不清楚。 3 、 DNA 聚合酶 III ：
9、 起 DNA 复制作用，功能与聚合酶 I 相似。全酶共 10 种亚基，含锌。每秒可聚合 1000 个碱基。 病毒、原核、真核基因组的特点？答：1、病毒基因组的特点： 种类单一；单倍体基因组：每个基因组在病毒中只出现一次；形式多样；大小不一；基因重叠；动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；具有不规则的结构基因；基因编码区无间隔：通过宿主及病毒本身酶切；无帽状结构；结构基因没有翻译起始序列。2、原核基因组的特点：为一条环状双链DNA；只有一个复制起点；具有操纵子结构；绝大部分为单拷贝；可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒；基因一般是连续的，无内含子；重复序列很少。3、真核基因组的特点：真
10、核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；基因组DNA与蛋白质结合成染色体，储存于细胞核内；真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；基因组中非编码区多于编码区；真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；存在大量的重复序列；功能相关的基因构成各种基因家族；存在可移动的遗传因素；体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。乳糖操纵子的作用机制？答：1、乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖
11、存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。
12、4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。真核生物转录水平的调控机制？答：真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程。1、转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。转录起始复合物的形成过程为：TFD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFD-DNA复合物形成一个闭合的复合
13、物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物。在这个过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。2、反式作用因子：一般具有三个功能域（DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域）；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性调控作用。3、转录起始的调控：反式作用因子的活性调节：表达式调节反式作用因子合成出来就具有活性；共价修饰磷酸化和去磷酸化，糖基化；配体结合许多激素受体是反式作用因子；蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。反式作用因子与顺
14、式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。反式作用因子的作用方式成环、扭曲、滑动、Oozing。反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。真核生物转录后水平的调控机制？答：（1）、5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化的调控意义：5，端加帽和3，端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。（2）、mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用（3）、mRNA运输的控制受
15、体的特点？答：1、高度专一性；2、高度亲和性；3、可逆性；4、可饱和性；5、特定的作用模式分子克隆中常用的工具酶及良好载体的条件？答：（1）、常用的工具酶1、限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。2、DNA连接酶：将两段DNA分子拼接起来的酶。3、DNA聚合酶：催化单核苷酸链延伸。4、逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称互补DNA。5、末端脱氧核糖核酸转移酶：将脱氧核糖核酸加到DNA的3末端。6、碱性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基团。7、依赖DNA的RNA聚合酶：识别特异性启
16、动子，RNA转录。（2）、良好载体的条件1、必须有自身的复制子；2、载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点，即多克隆位点，以供外源DNA插入；3、载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；4、载体分子必须有足够的容量；5、可通过特定的方法导入细胞；6、对于表达载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导顺序、增强子、加尾信号等DNA调控元件。蓝-白筛选的原理？答：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基
17、因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。核酸分子杂交的原理？影响杂交的因素？答：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。影响杂交的因素：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复
18、性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度
19、绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。6、非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。探针的种类和优缺点？答：1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可
20、以得到RNA或反义RNA作为探针。探针的标记法？1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。2、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六
21、核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。3、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。4、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。PCR的基本原理？PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单
22、链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94。退火：引物单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 左右， Taq DNA聚合酶以种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物末端为起点的53DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成
23、的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。PCR引物设计的基本要求？1、引物长度一般为1530个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74,影响产物的生成。2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45 -55。3端和5端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm4(G+C)+ 2(A+T)；3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。4、两个引
24、物之间不应存在互补序列，尤其应避免3端的互补重叠。5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70，引物3末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。7、引物与模板结合时，引物的5端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。8、引物的5端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。PCR的反应条件？1、PCR反应的缓冲液：（1）Tris-HCl缓冲液；（2）KCl 促进引物
25、的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。（3）加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。（4）必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。 2、镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。 3、底物浓度 工作浓度20-200mol/L，dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度
26、下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。Taq DNA聚合酶 75-80时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。5、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80 范围较为理想。6、反应温度和循环次数影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？1、启动子的强弱；2、基因的剂量；3、影响RNA转录和翻译效率的因素：SD序列、mR
27、NA；4、外源基因密码子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？1、要求外源基因的编码区不能含有内含子；表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16S rRNA3，末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。DNA芯片的原理？制作流程及应用？答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其
28、方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。诱变剂的作用机制？答：1、碱基的类似物诱发突变；2、改变DNA的化学结构；3、结合到DNA分子上诱发移码突变；4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化突变类型及其遗传效应？答：1、突变类型：点突变：DNA大分子上一个碱基的变异。分为转换和颠换。 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入到DNA大分子中间。 倒位：DNA链内重组，使其中一段方向倒置。2、突变的遗传效应：遗传密码的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变； 对mRNA剪接的影响：一是使原来的剪接位点消失；二是产生
29、新的剪接位点。蛋白质肽链中的片段缺失：DNA双螺旋（double helix）结构模型，即B-DNA模型的结构特征？（1）两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴盘绕成右手双螺旋。（2）糖与磷酸在外侧形成螺旋的轨迹，彼此通过3,5- 磷酸二酯键相连。（3）碱基伸向内部，其平面与螺旋轴垂直。（4）两条核酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相连系而结合在一起，且总是A与T，G与C配对。（5）双螺旋的平均直径为2 nm ，每个螺旋圈上升10对核苷酸，螺距为3.4 nm 。（6）沿螺旋中心轴方向看去，双螺旋结构上有两个凹槽，一个较宽深，称大沟（major groove），另一个较浅小，称小沟（minor gr
30、oove）DNA双螺旋结构一般情况下比较稳定，维持其稳定的作用力主要有：两条多核苷酸链间的互补碱基对之间的氢键作用。螺旋中碱基对疏水的芳香环堆积所产生的疏水作用力和上下相邻的芳香环的p电子的相互作用即碱基堆积力。这是一种最主要的作用力。磷酸基团的氧原子带负电荷，与细胞中的碱性组蛋白、亚精胺以及Mg2+等阳离子化合物结合所形成的离子键，从而抵消负电荷之间的排斥作用。DNA分子形成超螺旋的生物学意义？一是超螺旋DNA具有更紧密的形状，因此在DNA 组装中具有重要作用。二是DNA的结构具有动态性，这有利于其功能的发挥，而DNA超螺旋程度的改变介导了这种结构的变化。B-DNA是一种热力学上的稳定结构，
31、超螺旋的引入就提高了它的能量水平。负超螺旋的存在会影响DNA结构变化的平衡，具超螺旋的DNA能实现松弛态DNA所不能实现的结构转化。影响解链温度（Tm）的因素？（1）DNA碱基组成。DNA的Tm值主要与组成DNA分子中的碱基对组分有关，G-C含量越高，Tm值就越高;A-T含量越多，Tm值就越低。这是因为G-C对中三个氢键，较A-T对中两个氢键牢固的原因。（2）DNA的均一性。DNA分子序列组成越均一，如多聚A-T或多聚G-C，其变性过程同步性越好,Tm范围较窄，表现为一条很陡的熔解曲线；反之，非均一性 DNA分子，则Tm范围较宽。（3）溶液的离子强度。DNA双链骨架上磷酸基因带有较多的负电荷，
32、它们之间的静电排斥作用是造成双链不稳定的因素之一。同一种 DNA分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同。在低离子强度中，Tm值较低，而且解链的温度范围较宽；在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。这是由于溶液中离子与DNA分子中磷酸基团形成离子键，即正离子可以封闭磷酸基团的负电性使DNA比较稳定，需更多能量才能使其变性，故Tm值亦升高。 （4）pH值。核酸溶液的pH在59范围内，Tm值变化不明显。当溶液pH小于4时，碱基A、G、C上的氮原子质子化；当pH值大于11时，碱基G和C上的氮原子去质子化，这些均不利于氢键的形成。拓扑异构酶的种类与特点？型拓扑异构酶的作用特点：仅切断双链DNA的
33、一条链，即催化瞬时的单链断裂和连接，不需要能量辅助因子如ATP和NAD等，因而不能催化需能的超螺旋化结构。型酶作用的共同特点是：同时切断、缝合DNA的两条链，不需要单链切口存在，因而每个反应后改变两个链环数；需要能量辅助因子。试比较切除修复和光复活机制是如何清除由紫外线诱导形成的嘧啶二聚体的？你可使用什么方法区分这两种机制？答：切出修复需要将嘧啶二聚体切除，换上正常的胸腺嘧啶核苷酸（2分），而光复活机制是通过光复活酶直接破坏嘧啶二聚体的环丁烷从而逆转为正常的胸腺嘧啶核苷酸（2分）。可使用3H标记胸腺嘧啶核苷追踪修复过程，如果3H出现在修复的DNA分子上，则修复的方式是切除修复，否则就是光复活机
34、制（2分）。试写出一个基因可产生不同的表达产物的所有可能机制。答：使用不同的启动子进行转录（1分）；前体mRNA的选择性加工（1分）；前体mRNA的选择性加尾（1分）；mRNA编辑（1分）；翻译后水平的选择性加工（2分）。尽管DNA聚合酶催化聚合反应既需要模板，又需要引物。但下面的单链DNA却可以直接作为DNA聚合酶的有效的底物。试解释其中的原因，并写出由DNA聚合酶催化而形成的终产物的结构。3OH-TGGCTCATAGCCGGAGCCCTAACCGTAGACCACGAATAGCATTAGGp 5 答：由于此链DNA特殊的碱基组成使得该DNA能够形成如图所示的茎环结构（2.5分）： GAGCC
35、CTAACCGTAGACCACGAATAGCATTAGGp 5 CTCGGT- OH3GCCGATADNA聚合酶能以该结构的3-OH为引物，以5-端的序列为模板催化聚合反应的进行，但对于DNA聚合酶来讲，在催化聚合反应之前，会通过其35的外切酶活性将末端错配的T水解掉而引入正确的G，然后再进行延伸反应，最终得到的产物是（3.5分）：GAGCCCTAACCGTAGACCACGAATAGCATTAGGp 5 CTCGGGATTGGCATCTGGT GCTTATCGTA ATCC- OH3GCCGATA当细胞内具有较高浓度的色氨酸时，色氨酸操纵元只能转录合成一段较短的前导转录本，而结构基因不被转录，
36、这是转录的弱化作用，是由前导序列中两个连续的色氨酸密码子介导的。如果色氨酸密码子UGG突变为终止密码子UAG，在色氨酸操存在或不存在两种情况下，将对色氨酸操纵元的调控机制产生怎样的影响，并加以解释。答：不管色氨酸存不存在，突变了的色氨酸操纵子都不会表现出衰减作用，结构基因在两种情况下都能被转录，参与色氨酸生物合成的酶系被合成。什么是RNA编辑？以RNA编辑的事实如何理解中心法则？答：RNA编辑是指由RNA水平的核苷酸改变所引起的密码子发生变化的一种预定修饰，一种RNA编辑是以另一RNA为模板来修饰mRNA前体（2分）。通过编辑，可以给mRNA前体添加新的遗传信息（1分）。mRNA 编辑较大程度
37、地改变了DNA的遗传信息，使该基因的DNA序列仅是一串简略意义模糊的序 列或称为隐秘基因、模糊基因（1.5分）。通过形成或删除AUG, UAA, UAG, UGA，改变codon信息；扩大编码的遗传信息量（1分），既对中心法则构成了挑战，也是对中心法则的发展（0.5分）。假定有一种大肠杆菌，其甲硫氨酸操纵元只由衰减子机制调控而没有阻遏蛋白。在这种操纵元模型中，甲硫氨酸衰减子同大肠杆菌的色氨酸衰减子机制十分类似，在mRNA链上衰减子的部分序列如下：5-AAAAUGAUGAUGAUGAUGAUGAUGAUGGACUAA- 3翻译的起点位于这一序列的上游，且给出的序列是一正确的阅读框。当mRNA发生
38、下列情况的突变时，大肠杆菌的甲硫氨酸操纵元的表达情况如何（组成型、野生型、或Met）？并请说明原因。（1）斜体的A缺失；（2）斜体A及带下划线的A都缺失；（3）序列中的前三个A都缺失。答：（1）组成型表达UGA：因为斜体A缺失后会引起移框突变，由原来的AUG AUG，等等变为UGA UGA等等。UGA是终止密码子，所以衰减子不能继续翻译，结构基因可继续转录（3分）。 （2）Met：当斜体A及带下划线的A都缺失后，同样会引起移框突变，由原来的AUG AUG，等等变为GAU GAU，等等，GAU是天冬氨酸密码子，这样，即使在培养基中甲硫氨酸的含量很低，衰减子序列的翻译也会继续下去，操纵元的结构基因
39、的转录就会终止（3分）。（3）野生型：当前三个A都缺失时，阅读框并不会发生改变（3分）。注：AAA：Lys（赖氨酸）；GAU：Arp（天冬氨酸）描述cDNA文库构建原理与方法：（1）cDNA获得方法，（2）克隆方法，（3）文库质量定义。答： cDNA：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA(complementary DNA，cDNA)，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受菌体，扩增为cDNA文库(cDNA library)，然后再采用适当方法从cDNA文库种筛选出目的cDNA。与基因组DNA文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包括了细胞全部mRNA信息，自然
40、也含有我们感兴趣的编码cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。（1） cDNA获得方法：Total RNA的提取；mRNA的分离；cDNA双链合成：Superscipt IIRT合成第一链，cDNA第二链的合成，双链cDNA末端补平，EcoR I adaptor 加接，双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切，胶回收cDNA。（2） 克隆方法：载体制备：pBlueScriptII的提取，pBlueScriptII的双酶切消化，载体去磷酸化，载体效率检测；cDNA双链和载体的连接：连接，检测（PCR方法）；电转化：电转化感受态细胞的制备，连接产物纯化，电转化；快速鉴定、菌落
41、PCRpBlueScript cDNA文库扩增。（3）文库质量定义：评价一个文库是否有实用价值主要在于文库的含量和插入片段的大小两个方面。所构建的文库中必须有足够多的克隆数, 这样才能确保基因组cDNA 中的每一个序列至少有一个拷贝存在于重组文库中, 为达到这一要求, 文库的容量应不小于1.7105 , 同时为保证cDNA片段的完整性, 插入片段的平均大小应不小于1kb。阐述基因突变的概念及引起突变的可能途径：（1）化学诱变，（2）物理诱变，（3）T-DNA插入，（4）缺失、插入，（5）无意突变概念，（6）碱基修复概念答：基因突变属于分子水平上的变异，是指染色体上个别基因所发生的分子结构的变化
42、，基因突变在自然界普遍存在。基因突变的方式很多，主要有：（1）化学诱变，基因突变可以由某些化学物质所引起，这些化学物质称为化学诱变剂。现已知很多的化学诱变剂，它们诱变的机制是不同的。在DNA复制过程由于碱基类似物的取代，碱基的化学修饰以及碱基的插入和缺失都会引起突变。（2）物理诱变，利用物理因素引起基因突变的称物理诱变，如X射线、紫外线、电离辐射等物理因素可造成 （3）T-DNA插入，改变读码或变成假基因。（4）移码突变：基因中插入或者缺失一个或几个碱基对，会使DNA的阅读框架（读码框）发生改变，导致插入或缺失部位之后的所有密码子都跟着发生变化，结果产生一种异常的多肽链。移码突变诱发的原因是一
43、些像吖啶类染料分子能插入DNA分子，使DNA复制时发生差错，导致移码突变。（5）无意突变，由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变。（6）碱基修复：DNA损伤的修复系统主要有以下几个：损伤碱基的直接修复；切除修复，包括碱基切除修复、核苷酸切除修复和DNA交链的切除修复；错配修复；重组修复，又称复制后修复；跨损伤DNA合成，这是一种利用损伤核苷酸为模板，通过DNA聚合酶I使碱基掺入到复制终止处进行DNA合成，从而延长DNA链的修复。基因突变的特点为：第一，基因突变在生物界中是普遍存在的。第二，基因突变是随机发生的。第三，在自然状态下，对一种生物来说，基因突
44、变的频率是很低的。第四，大多数基因突变对生物体是有害的，由于任何一种生物都是长期进化过程的产物，它们与环境条件已经取得了高度的协调。第五，基因突变是不定向的。阐述一条反向遗传克隆功能基因的途径。答：反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。比较典型的
45、反向遗传克隆功能基因的途径如RNAi。RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多组分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达(下略)。对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择，通常是抗生素基因。b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 c、缩短长度，切去不必要的片段，
46、提高导入效率，增加装载量。d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件举例说明差示筛选组织特异cDNA的方法？制备两种细胞群体，目的基因在其中一种细胞中表达或高表达，在另一种细胞中不表达或低表达，然后通过杂交对比找到目的基因。 例如：在肿瘤发生和发展过程中，肿瘤细胞会呈现与正常细胞表达水平不同的mRNA，因此，可以通过差示杂交筛选出与肿瘤相关的基因。也可利用诱导的方法，筛选出诱导表达的基因。激活蛋白（CAP）对转录的正调控作用？环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称
47、激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。当大肠杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶难以与其结合。 CAP的存在（功能）：能显著提高酶与启动子结合常数。主要表现以下二方面：CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向,以便与-10区结合，起到取代-35区功能的作用。CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。典型的DNA重组实验包含步骤?DNA重组技术也
48、称为基因克隆）或分子克隆。最终目的是把一个生物体中的遗传信息DNA转入另一个生物体。典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外源基因是否表达。基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选 或PCR筛选、差式筛选、DNA探针。多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素、四环素）。当质粒转入大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重组。 在含有两个抗性基因的载体中，如果外源DNA片段插入其中一个基因并导致该基因失活
