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1、本科毕业论文（设计）论文题目：泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶基因的克隆和分析所在学院 生物与环境学院 专业班级 生物工程063 学生姓名 学号 指导教师 职称 讲师 指导教师 职称 高级工程师 完成日期 2010 年 4 月 20 日 摘 要本实验通过RACE法获得泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase）基因cDNA全长序列并对其进行生物信息学分析。发现，泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶不含硒，称为过氧化物酶6（TgPrx6）。泥蚶过氧化物酶6基因的全长cDNA为1937个碱基，其中开放阅读框为672个碱基，编码224个氨基酸。其次，用RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒从泥
2、蚶血液和其它组织中提取RNA，逆转录成cDNA。最后，采用PCR方法分析TgPrx6基因在不同组织中的表达情况，结果表明TgPrx6基因的组织表达有所差异。TgPrx6基因在内脏团中表达水平最高，其次是鳃和外套膜，在血液中的表达水平最低。关键词：泥蚶；谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）基因；过氧化物酶6；组织表达ABSTRACTA whole length cDNA of glutathione peroxidase in Tegillarca granosa was got by RACE and the sequenced of bioinformatics was analysed. The
3、glutathione peroxidase of Tegillarca granosa did not contain Se, which was called peroxidase 6（TgPrx6）.The whole length cDNA of TgPrx6 in Tegillarca granosa was 1937 bp, and the open reading frame was 672bp which could translate 224 amino acids. RNA was got by RNAfast200 Kit from blood and other tis
4、sues of Tegillarca granosa, then RNA was reversed transcriptase to cDNA. Finally, the gene of TgPrx6 was analysed to explore how the gene of TgPrx6 expressed in different tissues, and the result was that there were differences between tissues. The highest level of TgPrx6 expression was detected in v
5、iscera, and then gills and mantle. The lowest level was detected in blood .Key words：Tegillarca granosa; glutathione peroxidase gene; peroxidase 6; tissue expression目 录1 前言11.1 泥蚶的介绍11.2 谷胱甘肽过氧化物酶的介绍11.3 谷胱甘肽过氧化物酶的作用21.3.1 清除脂类氢过氧化物21.3.2 清除H2O221.3.3 减轻有机氢过氧化物对机体的损伤21.3.4 参与前列腺素合成的调节31.3.5 其他作用31.4
6、 泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶基因的研究意义32 实验材料和方法32.1 实验材料与试剂32.1.1 材料32.1.2 试剂32.1.3 仪器42.1.4 实验用品的预处理42.1.5 电泳缓冲液和琼脂糖凝胶的制备42.1.6 实验所用引物42.2 实验方法52.2.1 SMART技术构建全长cDNA文库52.2.2 血液中总RNA提取52.2.3 组织中总RNA的提取62.2.4 cDNA第一链合成62.2.5 cDNA检测72.2.6 所设计引物的筛选72.2.7 泥蚶Prx6基因组织特异性表达72.2.8 目的基因的生物信息学分析82.2.9 PCR产物的回收纯化83 实验结果83.1 血液和
7、组织的RNA提取83.2 设计引物的筛选93.3 泥蚶Prx6 cDNA序列分析和推导的氨基酸序列93.4 泥蚶Prx6基因与其它物种Prx6基因的系统进化树分析123.5 泥蚶Prx6基因组织特异性表达134 讨论134.1 cDNA文库134.2 泥蚶Prx6全长cDNA克隆及组织表达分析14参考文献16致 谢19附录1文献综述20附录2外文翻译251 前言1.1 泥蚶的介绍泥蚶(Tegillarca granosa)，俗称花蚶、血蚶、银蚶、蚶子等，隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(Lamellibranchia)、列齿目(Taxodonta)、蚶科(Arcidae)、泥蚶属(
8、Tegillarca)，是一种栖息于沿海滩涂的广温性双壳贝类，主要分布于西太平洋、印度洋和大西洋海域的中国、韩国、泰国、菲律宾以及马来西亚等国家，在我国分布于山东半岛以南沿海,是山东、浙江、福建和广东等省重要的养殖经济贝类1。泥蚶富含特有的血红蛋白和维生素B12，有补血、温中、健胃的功效。蚶壳可做药，有消血块、化痰之功效；根据本草经疏记载：蚶味甘，性温，无毒；有补血、健胃功效；主治血虚痿痹，胃痛，消化不良，下痢脓血等，亦用于滋补强壮,病后体虚2。另外，泥蚶还含有多种无机元素。目前，虽然对泥蚶的研究已经有许多报道，但对基因方面的研究较少。所以，通过构建cDNA文库、测序，从而克隆功能基因，对开发
9、利用泥蚶的基因资源具有重要意义。1.2 谷胱甘肽过氧化物酶的介绍谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。硒是GPX酶系的组成成分，它能催化GSH变为GSSG，使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，同时促进H2O2的分解，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。GPX酶系主要包括4种不同的GPX，分别为胞浆GPX、血浆GPX、磷脂氢过氧化物GPX及胃肠道专属性GPX。胞浆GPX由4个相同的分子量大小为22kDa的亚基构成四聚体，每个亚基含有1个分子硒半胱氨酸，广泛存在于机体内各个组织，以肝脏红细胞为最多。它的生理功能主要是催化GSH参与过氧化反应，清
10、除在细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用。血浆GPX的构成与胞浆GPX相同，主要分布于血浆中，其功能目前还不是很清楚，但已经证实与清除细胞外的过氧化氢和参与GSH的运输有关。磷脂过氧化氢GPX是分子量为20kDa的单体，含有1个分子硒半胱氨酸。最初从猪的心脏和肝脏中分离得到，主要存在于睾丸中，其它组织中也有少量分布。其生物学功能是可抑制膜磷脂过氧化。胃肠道专属性GPX是由4个分子量为22kDa的亚基构成的四聚体，只存在于啮齿类动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害。1957年，Mills最初发现了具有抗氧化作用的GPX，其功能
11、被认为防御红血球氧化而引起的溶血，命名为谷胱甘肽过氧化物酶3。这是过去一直认为经典的GPX，而现在把具有这种功能的酶命名为GPX-1。在1973年，Rotruck等研究表明硒是抗氧化酶GPX催化活性中心的一个重要组分4。后来Flohe研究小组纯化了该酶，并进一步分析了分布在细胞中并作用于各种有机过氧化物和H2O2的GPX, 是由4个各含1个硒半胱氨酸的蛋白质亚基构成的四聚体，并以离子化硒醇(selenol)形式形成酶的氧化还原活性中心5。目前, 根据GPX包含的半胱氨酸残基不同，可简单分为含硒和不含硒两大类6。本实验中所研究的泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶就是不含硒的谷胱甘肽过氧化物酶，而不含硒的谷胱
12、甘肽过氧化物酶又被称为过氧化物酶67。GPX的催化基团Sec由终止密码子UGA编码，对它的研究拓展了人们对遗传密码的认识，Sec也因此被人们称作第二十一种氨基酸8。Sec在原核和真核生物中的表达略有不同，但是它们的表达都依赖于mRNA中特殊的二级结构9。1.3 谷胱甘肽过氧化物酶的作用1.3.1 清除脂类氢过氧化物GPX的主要作用是清除脂类氢过氧化物，并在过氧化氢酶含量很少或H2O2产量很低的组织中，可代替过氧化氢酶清除H2O2，其清除脂类氢过氧化物的速度决定于GPX的浓度，而与GSH的浓度无关。1.3.2 清除H2O2脑与精子中几乎不含过氧化氢酶，而含较多的GPX，代谢中产生的H2O2可以被
13、GPX清除。即使含过氧化氢酶较多的组织，仍需GPX清除H2O2，因为在细胞中过氧化氢酶多存在于微体，而在胞浆和线粒体中却很少，组织中较多的GPX可及时清除H2O2。如有的病人缺乏产生过氧化氢酶的基因，但GPX可清除H2O2，故H2O2损伤组织不明显。1.3.3 减轻有机氢过氧化物对机体的损伤在病理生理情况下，活性氧如XOOH可能诱发脂类过氧化，除了直接造成生物膜损伤外，还可以通过脂类氢过氧化物与蛋白质、核酸反应，使机体发生广泛性的损伤。如果GPX清除脂类氢过氧化物能力不受影响，机体的损伤就可减轻。除了脂类氢过氧化物外，还可能出现其他有机氢过氧化物，如核酸氢过氧化物、胸腺嘧啶氢过氧化物，这两者属
14、于致突变剂，GPX清除有机氢过氧化物的作用可降低致突发生率。脂类过氧化也是细胞老化的原因之一，预防脂类过氧化可延缓细胞老化，所以GPX在预防衰老方面起到重要作用10。1.3.4 参与前列腺素合成的调节前列腺素在体内分布较广，其合成原料为花生四烯酸。但在环氧酶与脂氧合酶的作用下，花生四烯酸尚可氧化成某些氢过氧化物(XOOH)。这些氢过氧化物能显著干扰前列腺素的生物合成。但在GPX的作用下，XOOH可转变为无活性物质(XOH)，故GPX对前列腺素的生物合成起到调节作用。1.3.5 其他作用硒和GSH系统在氧化防御反应中起着关键作用。此外，GSH 在代谢、细胞信号传导和蛋白质相互作用中也具有辅助性功
15、能，还可以调节机体防御反应。其他含硒蛋白也有抗氧化特性。硒蛋白和有机硒复合物可以催化过亚硝酸盐反应生成NO2，在预防过亚硝酸盐的生成中也起着重要作用，可以保护细胞免受过亚硝酸盐的损害11。1.4 泥蚶谷胱甘肽过氧化物酶基因的研究意义泥蚶是我国重要的水产经济动物之一，但近年来疾病的频发给养殖业带来了巨大的经济损失。由于免疫学方面的基础研究太少，面对日益严重的病害问题以及病因的多样性，目前尚无有效的疾病防治措施来保证泥蚶健康养殖和可持续发展。研究表明，生物体内的抗氧化酶在机体的免疫防御、抵抗不同外界条件干扰、维持机体自身生长发育、新陈代谢、延缓衰老等方面都发挥着重要的作用。本实验对泥蚶的1-Cys
16、型Prx基因进行研究，以期阐明这种抗氧化蛋白在泥蚶免疫系统中的作用机制，为泥蚶的抗病力提供更多的理论依据，同时也为贝类动物的深入研究做出贡献，对开发利用贝类动物的基因资源具有重要意义。2 实验材料和方法2.1 实验材料与试剂2.1.1 材料本实验中所使用的泥蚶采自宁波象山养殖滩涂。2.1.2试剂总RNA提取采用上海飞捷生物技术有限公司生产的RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒，cDNA文库构建采用Smart cDNA Library Construction Kit，超纯水，琼脂糖（Agurose M），TAE缓冲液。2.1.3仪器Eppendorf公司生产的冷冻高速离心机（Centri
17、fuge 5417R）及PCR仪（Mastercycler pro S），ABI 3730测序仪，电泳槽，凝胶成胶系统，微波炉，高压灭菌锅，普通电冰箱，超低温冰箱，电热恒温干燥箱。2.1.4实验用品的预处理塑料制品：使用一次性无RNase的塑料制品。对国产塑料制品，用0.1%的DEPC水浸泡处理过夜，高压蒸汽灭菌30 min。将灭菌的塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。玻璃器皿：用铝箔包裹后180烘烤4 h备用。2.1.5 电泳缓冲液和琼脂糖凝胶的制备0.5mol/L的EDTA溶液的配制：将37.2g EDTA-Na加入160mL蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液pH值至8.0。用
18、蒸馏水定容至200mL。后送至高压灭菌。室温保存。50TAE溶液的配制：在400mL蒸馏水中溶解121g Tris，加入28.5mL冰乙酸和50mL 0.5mL/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500mL，室温保存。1TAE溶液的配制：50TAE溶液取10mL，加蒸馏水定容至500mL。琼脂糖胶的制备：取50mL 1TAE溶液溶解1.5g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，重复2-3次，直到溶液澄清为止。当溶液冷却至60左右时，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置10-15min后就可以进行电泳。2.1.6 实验所用引物所有引物都有上海生物工程公司合成，见表1。表 1 泥蚶Prx6 cDN
19、A克隆及相关实验所用引物序列引物序列（5- 3）Tg-18S rRNA-FCTTTCAAATGTCTGCCCTATCAACTTg-18S rRNA-RTCCCGTATTGTTATTTTTCGTCACTGPX-Real-F1GCCGTCTTGGTGGTAAATGCGPX-Real-R1TACTGCCTCGTAGCGCCTCAGPX-Real-F2GCCGTCTTGGTGGTAAATGCGPX-Real-R2ACCTGACCCGTGAACTGTGAT3AATTAACCCTCACTAAAGGGT7GTAATACGACTCACTATAGGGC2.2 实验方法2.2.1 SMART技术构建全长cDNA文
20、库SMART技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5end of the RNA Transcript(SMART)。本实验中泥蚶的cDNA文库的建立是用SMART cDNA Library Construction Kit构建的。这个试剂盒的SMART引物和CDS引物与其它的试剂盒略有不同，分别带有一个不完全相同的SfiI酶切位点。SfiI是一个在真核生物中极为稀少的酶，出现的频率要远远小于NotI、EcoRI等识别6个碱基位点的酶。SfiI识别序列为GGCCNNNNNGGCC，中间的5个碱基为任意序列。因而两个引物分别带有一个不完全相同的SfiI
21、位点就是说两个位点的中间5个碱基不同。这样经过SMART技术合成两端分别带有SMART引物和CDS引物的cDNA经过扩增后用SfiI单酶切，得到的是两端的粘端不同的cDNA，这样就可以定向插入特定的载体中，不会浪费50%的信息。这个试剂盒提供的载体也很有特色：lambdaTriplex2载体有特别设计，可以用3个不同的表达框架分别同时表达一段插入的DNA。这样就保证插入的片断的正确的表达产物能被筛选出来而不会漏掉。2.2.2 血液中总RNA提取抽取泥蚶血液，按照RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒的步骤提取总RNA。提取步骤如下：(1) 用注射器从泥蚶中抽取1-1.5mL血液加入EP管中
22、；(2) 在冷冻高速离心机中离心，转速4000r/min，离心2min，倒去上清，加入100L超纯水，用移液枪吹打至没有细胞块；(3) 加入500L RA2液，充分颠倒混匀（1min）；(4) 将样本裂解液吸入内套管中，在冷冻高速离心机中离心2min，转速13000 r/min；(5) 倒去外套管中的液体，向内套管中加入500L洗液（wash Buffer），在冷冻高速离心机中离心2min，转速13000 r/min，重复1次；(6) 倒去外套管中液体，将内套管放回，不加洗液，在冷冻高速离心机中离心2min，转速13000 r/min；(7) 将内套管移入新的EP管中，在膜中央滴加30L洗脱液
23、（Elute buffer），室温静置2min，在冷冻高速离心机中离心2min，转速13000 r/min，获得总RNA；2.2.3 组织中总RNA的提取取泥蚶外套膜、内脏团和鳃组织，按照RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒的步骤提取总RNA。(1)将组织块剪切成小块后放入平皿内钢丝网上，加入1000L超纯水，研磨后，取100L放入EP管中；(2)加入500L RA2液，充分颠倒混匀（1min）；(3)将样本裂解液吸入内套管中，在冷冻高速离心机中离心2min，转速13000 r/min；(4)倒去外套管中的液体，向内套管中加入500L洗液（wash Buffer），在冷冻高速离心机中离心
24、2min，转速13000 r/min，重复1次；(5)倒去外套管冲液体，将内套管放回，不加洗液，在冷冻高速离心机中离心2min，转速13000 r/min；(6)将内套管移入新的EP管中，在膜中央滴加30L洗脱液，室温静置2min，在冷冻高速离心机中离心2min，转速13000 r/min，获得总RNA；2.2.4 cDNA第一链合成cDNA第一链合成步骤：(1) RNA变性，在PCR管中依次加入： 总RNA 2L Oligo dT 4L 超纯水 6L 在PCR仪上，70热变性10分钟，冰浴2min，稍离心。(2)反转录变性RNA，在已经完成变性反应的PCR管中依次加入： 5M-MLV反应缓冲
25、液 4L dNTP 1L RNase Inhibitor 1L RTase M-MLV反转录酶 1L 超纯水 1L 轻弹混匀后，稍离心。PCR仪上42反转录1h，70变性15min，冰浴2min。2.2.5 cDNA检测用18S rRNA基因来检测有无cDNA及其纯度。模板为上述逆转录的cDNA，PCR反应体系为25L：超纯水 19L10PCR buffer 2.5LdNTP MiX 1LTg-18S rRNA-F 1LTg-18S rRNA-R 1LTaq DNA Polymerase 0.25LcDNA 1L扩增片段所用的PCR反应程序：94变性3min；94变性50s，56退火50s，7
26、2延伸50s，35个循环；72延伸5min；4保存。然后进行琼脂糖凝胶电泳，检测cDNA。2.2.6 所设计引物的筛选通过分析EST数据库信息，发现泥蚶cDNA文库中含有一条和Prx6同源的序列，根据这条序列，利用Primer premier 5软件设计两对引物GPX-Real-F1、R1和GPX-Real-F2、R2（见表1），用于检测TgPrx6基因的组织表达。引物筛选所用模板为血液cDNA。扩增基因片段的Touchdown PCR反应程序：94变性3min，1个循环；94变性50s，62-57退火50s（每个循环温度-0.5），72延伸50s，10个循环；94变性50s，57退火50s，
27、72延伸50s，25个循环；72延伸5min；4保存。然后进行琼脂糖凝胶电泳。2.2.7 泥蚶Prx6基因组织特异性表达以血液和组织中提取的RNA逆转录后的cDNA为模板，用上述筛选的特定引物GPX-Real-F2、R2进行基因片段的组织特异性表达情况检测，PCR程序同上，然后进行琼脂糖凝胶电泳。EB染色后，在紫外光下观察，条带越亮就表示该组织中Prx6基因表达量越丰富；反之亦然。2.2.8 目的基因的生物信息学分析5端用引物GPX-Real-R1和载体通用引物T7扩增得到，3端用引物GPX-Real-F1和通用引物T3扩增得到两条序列，并将获得的两条序列进行拼接，得到泥蚶Prx6基因的cDN
28、A全长序列，并进行测序，再将所测得序列到NCBI网站（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov）上的BLAST工具进行数据库基因序列的相似性及同源性查找，并利用这些序列进行不同物种之间基因同源性的比较。用DNAMAN软件进行cDNA的全长开放阅读框（ORF）分析。根据所测得的cDNA序列推到其氨基酸序列，用MEGA3.1软件的Neighbor-joining的方法构建Prx6基因的进化树。2.2.9 PCR产物的回收纯化(1)PCR反应结束后，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，在紫外灯下将目的DNA片段切下，放入离心管中，称重；(2)每100 mg凝胶加入300L溶液I，65水
29、浴10 min，使凝胶完全溶化；(3)将上述溶液转入收集管吸附柱内，室温放置2 min后10 000 g离心1 min；(4)倒掉收集管中废液，在吸附柱内加入500L溶液II，于10 000 g离心1 min；(5)重复上一步，将吸附柱放入同一个收集管中，空柱12 000 g离心2min；(6)将吸附柱放入1.5 mL离心管中，在吸附柱中央加入30L洗脱缓冲液进行洗脱，室温放置2 min，12 000 g离心1 min回收纯化的DNA。3 实验结果3.1 血液和组织的RNA提取图1 血液和组织总RNA提取的电泳图 注：1-4分别代表血液、鳃、内脏团和外套膜RNA的电泳条带。由图1可知，血液、鳃
30、、内脏团和外套膜的RNA提取结果较为理想，所提取RNA可用于后续逆转录实验。血液总RNA有3条带，分别是28S、18S和5.8S。而鳃、内脏团、外套膜内缺少5.8S带，可能是提取过程中降解所致。3.2 设计引物的筛选注：1条带是由引物GPX-Real-F2进行PCR扩增所得的产物，2条带是由引物GPX-Real-F1进行PCR扩增所得的产物。由图2估算两种产物的大小与设计引物时设定的产物大小基本一致，经测序验证，图2中的两条条带是所要扩增的Prx6基因片段，也就是说，所设计的两对引物都是成功的。3.3 泥蚶Prx6 cDNA序列分析和推导的氨基酸序列Prx6的全长cDNA为1937个碱基，其中
31、开放阅读框为672个碱基，能编码224个氨基酸；cDNA全长还包含5非编码区（5-UTR）的67个碱基和一个含有1198个碱基的3非编码区（3-UTR）包含终止密码子TAA和加尾信号AATAAA以及多聚A尾巴。没有糖基结合位点和信号肽，推导分子量为25.11kDa（http:/www.bio-Prx6的氨基酸序列与NCBI上选取的Prx6序列进行比对，从图4中发现，Prx6与其它物种Prx6的同源性比较高。与长牡蛎（Crassostrea gigas）的同源性为72.04%，与斑马鱼的同源性为67.53%，与非洲爪蟾的同源性为66.82%，与盘鲍的同源性为69.75%，与海参的同源性为66.3
32、5%，与人类的同源性也高达64.29%。多序列比对发现，Cys44在所有的Prx6里都是保守的，还有一个保守的过氧化物酶催化中心“PVCTTE”（如图4所示）。泥蚶Prx6含有一个典型的Prx结构域（Leu4-Pro218）和一个AhpC结构域（Leu4-Ser140）。注：方框里的是起始密码子ATG，终止密码子TAA和加尾信号AATAAA。GPX的催化反应中心 （PVCTTE）用暗影指出，两个保守的带正电荷的残基His36和Arg127用红色字体标记。注：Prx6氨基酸序列对比结果，一致的序列用暗色背景，相似序列用灰色背景，保守的活动中心“PVCTTE”用红色方框标示。3.4 泥蚶Prx6基
33、因与其它物种Prx6基因的系统进化树分析 通过BLAST比对，从不同物种中挑选Prx6序列，使用Mega3.1软件中的Neighbor-joining方法构建Prx6的系统进化树（图5）。从图中可以看出泥蚶Prx6与海绵、中华螯蟹、长牡蛎和盘鲍的Prx6亲缘性最近，与海参、非洲爪蟾、鲑鱼、虹鳟和斑马鱼的Prx6亲缘性较远，与人类、黄牛、野猪、小家鼠、红原鸡、致倦库蚊、黑脚硬蜱和南极贝帽的Prx6遗传性最远。表2 Prx6系统进化树构建所用序列GenBank 登录号物种名中文名CAC38779Suberites domuncula海绵ACF35639Eriocheir sinensis中华螯蟹C
34、AK2382Crassostrea gigas长牡蛎ABO26614Haliotis discus discus盘鲍AAM44290Aplysia californica海参AAK97814Lxodes scapularis黑脚硬蜱ACE76885Laternula elliptica南极贝帽NP-004896Homo sapiens人类ACI67008Salmo salur鲑鱼NP-957099Danio rerio斑马鱼NP-777068Bos Taurus黄牛NP-999573Sus scrofa野猪NP-031479Mus musculus小家鼠NP-001011325Xenopus
35、tropicalis非洲爪蟾NP-001158604Oncorhynchus mykiss虹鳟XP-001849994Culex quinquefasciatus致倦库蚊NP-001034418Gallus gullus红原鸡3.5 泥蚶Prx6基因组织特异性表达采用PCR技术，检测了泥蚶不同组织中Prx6 基因的表达情况（图6）。结果发现，Prx6 在血液、内脏团、鳃和外套膜中都有表达，在内脏团中的表达量最高，其次是鳃和外套膜，在血液中的表达量最低。注：1-4分别是血液、外套膜、内脏团及鳃的表达情况。4 讨论4.1 cDNA文库1976年，Hofstetter等成功构建了第一个cDNA文库，
36、以后构建cDNA文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程12。cDNA文库筛选是获取基因全长cDNA的基本方法之一，基因全长cDNA的获取是研究酶结构与功能关系、基因表达和调控、基因工程应用的重要前提13-16。构建cDNA文库的其它方法：经典cDNA文库、标准化cDNA文库、染色体区域特异性cDNA文库、PCR cDNA文库与RACEcDNA文库、固相cDNA文库等17。cDNA仅占基因组DNA的3%左右，都是性状表达的主要序列。因此，在基因工程研究中,真核细胞的cDNA文库往往比基因组文库更为有用。本实验中采用了SMART技术构建泥蚶cDNA文库，通过随机测序获得一系列基因序列，尤其是免
37、疫相关基因的获得对泥蚶抗病性的研究有极为重要的意义。目前，我国的贝类免疫学研究相对于养殖业还处于严重滞后状态，对泥蚶相关抗性基因序列的获得，如热休克蛋白、SOD、铁结合蛋白等，对这些基因表达的研究有助于进一步了解泥蚶免疫相关知识，对邻近物种的研究也有帮助，可促进贝类免疫学的发展。另外，一些信号转导类基因、结构基因、代谢相关基因等序列的获得都可为对泥蚶的深入研究做铺垫。4.2 泥蚶Prx6全长cDNA克隆及组织表达分析泥蚶过氧化物酶（TgPrx6）基因的cDNA全长为1937个碱基，5非编码区（5-UTR）为67个碱基，3非编码区（3-UTR）为1198碱基，编码224个氨基酸。此外，His36
38、和Arg127在Prx6中都是高度保守的，这两个氨基酸在空间与活性中心接近，能降低Cys44的硫醇基团的pKa值18。泥蚶Prx6与海绵、中华螯蟹、长牡蛎和盘鲍的Prx6亲缘性最近，与海参、非洲爪蟾、鲑鱼、虹鳟和斑马鱼的Prx6亲缘性较远，与人类、黄牛、野猪、小家鼠、红原鸡、致倦库蚊、黑脚硬蜱和南极贝帽的Prx6遗传性最远。分析表明，TgPrx6与其它物种的1-Cys型Prx6聚在一起。与其它物种Prx618,19-23一样，TgPrx6只含有一个N-端的过氧化半胱氨酸残基（Cys44）而没有溶解性半胱氨酸，这是区别于其他2-Cys型Prx的典型特征24。典型的Prx结构域、AhpC结构域和过
39、氧化物酶催化中心“PVCTTE”的存在也表明了TgPrx6是属于1-Cys型过氧化物还原酶家族。催化活性中心“PVCTTE”与2-Cys过氧化物酶中的催化活性中心“FVCPTE”是同源的，它是Prx6特有的结构20。Prx具有抗氧化性，在保护细胞不受氧化损伤中起重要作用。例如， Prx缺陷型的酵母对氧化和亚硝酸盐敏感性增强25，果蝇的Prx在DTT存在时能还原H2O226。在老鼠上的研究表明，2-Cys型Prx能反向调节由LPS引起的炎症，能防止宿主对微生物成分有过度的反应 27。在甲壳动物中，对虾的一种2-Cys型Prx能阻止ROS的毒性，其表达能被肽聚糖抑制28，表明Prx在对微生物成分的
40、免疫应答中具有很重要的作用。重组纯化的蟋蟀Prx6在DTT存在时能还原H2O2 29，研究认为血蜱的Prx6是体内一种很重要的解毒酶21。在哺乳类中的大量研究证明，Prx6与一些些疾病相关。如，易患动脉硬化症的试验老鼠，Prx6的表达下降30，而帕金森症和痴呆病人的大脑中31，恶性间皮瘤病人的肺32，克-雅氏病病人的大脑33，匹克病病人前大脑皮层34中的Prx6的表达均有所升高。Prx6 在血液、内脏团、鳃和外套膜中都有表达，在内脏团中的表达量最高，其次是鳃和外套膜，在血液中的表达量最低。内脏团中有很多泥蚶的主要功能器官，它们是泥蚶抗氧化代谢的中心，所以内脏团中Prx6的表达量最高。同时，Pr
41、x6在不同组织中的普遍表达说明，Prx6在泥蚶的基础代谢中可能起着重要的抗氧化作用。目前关于泥蚶及其邻近物种在分子生物学方面的研究比较少，有些关于鲍、扇贝等的研究也只是局限于一些较为基本的抗性基因，如热休克蛋白、SOD等，这对泥蚶的序列分析带来了一定的困难。对泥蚶Prx6基因从基因组水平，蛋白表达水平等相关方面进行分析和研究。以期阐明Prx6基因在泥蚶抗病原体免疫系统中的作用机制，为增强泥蚶的免疫能力，提高其抵抗力提供理论依据，同时也为深入了解贝类的抗氧化和相关免疫机制做出贡献。对免疫相关的分子标记辅助育种也能提供一定的参考价值。另外，通过对泥蚶和其它物种Prx6基因的比较研究，有助于了解Pr
42、x6基因的系统演化。随着人们对抗氧化系统的重视，GPX基因在更多的物种被克隆出来，同时随着生物技术的不断进步，特别是基因芯片、基因敲除和RNAi技术的日渐成熟，GPX基因的结构和功能及其相互关系将会被全面认识，这将为认识抗氧化系统的分子机制奠定基础。参考文献1王日昕,李太武,吕振明等.泥蚶(Tegillarca granosa)不同地理居群同工酶变异及遗传分化的研究J.海洋与湖沼,2005,36(3):227-234.2贾玉海.中国海洋湖沼药物学M.北京:学苑出版社,1996,128.3Mills G C.Hemoglobin catabolism I.glutathione peroxida
43、se,an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxida-tive breakdownJ.J Biol Chem,1957,229:189-197.4Rotruck JT,Pope AL,Ganther HE,et al.Selenium:biochemical role as a component of glutathione peroxidaseJ.Science,1973,179:588-590.5Flohe L,Genzler WA,Schock HH.Glutathione peroxidase:a selenoen
44、zymeJ.FEBS lett,1973,32:132-134.6苗雨晨,白玲,苗琛等.植物谷胱甘肽过氧化物酶研究进展J.植物学通报,2005,22(3):350-356.7David E,Tanguy A,Moraga D.Peroxiredoxin 6 gene:A new physiological and genetic indicator of multiple environmental stress response in Pacific oyster Crassostrea gigasJ.Aquatic Toxicology,2007,84:389-398. 8Stadtman TC,eleno
