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1、甜高粱秸秆纤维素降解研究摘 要伴随着经济的不断增长，化石能源在不断减少，而能源需求越来越多，使用化石能源还带来一系列的环境问题。人们在不断寻找新的清洁能源，以取代化石能源，其中由植物纤维素生产的燃料乙醇成为研究热点。本实验以甜高粱秸秆为原料，将其经氨水预处理之后，先后用木聚糖酶和纤维素酶处理，将秸秆中的半纤维素和纤维素转化为还原糖，在木聚糖酶和纤维素酶水解液分别接入红酵母和酿酒酵母，利用还原糖转化成所需产物。实验结果表明，木聚糖酶水解秸秆的最适反应条件为50 ，pH 5.0，添加量3000 U/g（酶/秸秆），反应12 h得到最高的还原糖含量；纤维素酶最适的反应条件为50 ，pH 4.5，添加
2、量540 U/g（酶/秸秆）的条件下反应36 h得到最高的还原糖含量。在两种酶的水解液中分别接入的红酵母和酿酒酵母都得到了较好的生长。关键词：木聚糖酶，纤维素酶，降解，秸秆 STUDY ON DEGRADATION OF SWEET SORGHUM STRAW CELLULOSEAbstract With the growing of economy, the fossil energy is shrinking, the demand for energy is more and more, the use of fossil energy has brought a series of e
3、nvironmental problems.People are looking for a new clean energy to replace fossil fuels, which produced by plant cellulose fuel ethanol become a research hotspot.This experiment take the sweet sorghum straw as the raw material, after ammonia pretreatment, successively treated with xylanase and cellu
4、lase, hemicellulose and cellulose of straw can be converted to reducing sugar, the xylanase and cellulase hydrolysate and respectively connected to the red yeast saccharomyces cerevisiae, make use of the reducing sugar into the required product.It showed that the xylanase hydrolysis of straw optimum
5、 reaction condition of 50 , pH 5.0, adding amount of 3000 U/g (enzyme/straw), 12 h to get the highest reducing sugar content in reaction;Cellulase optimum reaction condition of 50 , pH 4.5, adding amount of 540 U/g (enzyme/straw) under the condition of reaction 36 h to get the highest reducing sugar
6、 content.Respectively in the two kinds of enzymatic hydrolysate of access of red yeast saccharomyces cerevisiae and got a better growth.Key words: xylanase, cellulase, degradation, straw目 录第1章 文献综述-1 1.1 研究背景-1 1.2国内外秸秆的利用现状-1 1.2.1 国外秸秆利用发展概况-1 1.2.2 国内秸秆利用发展现状-2 1.3 秸秆的预处理方法-3 1.3.1 物理方法-3 1.3.2 化
7、学方法 -41.3.3 物理-化学法-4 1.3.4 生物预处理-5 1.4 还原糖的测定方法-5 1.5 本实验的研究意义及主要内容-61.5.1 研究意义-61.5.2 主要研究内容-6第2章 标准曲线的制作-9 2.1 主要试剂及仪器-9 2.2木糖标准曲线的制作-9 2.3葡萄糖标准曲线的制作-10 2.4讨论-10第3章 甜高粱秸秆的氨处理-11 3.1主要试剂与仪器-11 3.1.1主要试剂-11 3.1.2主要实验设备和仪器-11 3.2实验操作-113.2.1原料获得-113.2.2氨处理-11 3.3讨论-11第4章 甜高粱秸秆的木聚糖酶处理-12 4.1主要试剂与仪器-12
8、 4.1.1主要试剂-12 4.1.2主要实验仪器-12 4.1.3主要试剂的配制-12 4.2 实验操作-13 4.2.1 测定木聚糖酶最适反应温度-13 4.2.2测定木聚糖酶最适反应pH-13 4.2.3测定木聚糖酶最适反应时间和酶用量实验- -14 4.2.4木聚糖酶三因素正交优化试验-14 4.3实验结果与分析-14 4.3.1木聚糖酶最适反应温度测定结果-14 4.3.2木聚糖酶的最适pH测定结果-15 4.3.3木聚糖酶的最适反应时间和酶用量的测定结果-15 4.3.4木聚糖酶三因素正交试验测定结果-16 4.4讨论-17第5章 甜高粱秸秆的纤维素酶处理-18 5.1主要试剂与仪
9、器-18 5.1.1主要仪器-18 5.1.2主要试剂-18 5.1.3主要试剂的配制-18 5.2实验操作-19 5.2.1测定纤维素酶最适反应温度-195.2.2测定木聚糖酶最适反应pH-19 5.2.3测定最适反应时间和酶用量-19 5.2.4纤维素酶三因素正交优化试验-20 5.3实验结果与分析-20 5.3.1纤维素酶最适温度测定结果-20 5.3.2纤维素酶最适反应pH的测定结果-20 5.3.3纤维素酶最适酶量和反应时间的测定结果-215.3.4纤维素酶的正交优化试验测定结果-22 5.4讨论-22第6章 酶促反应水解液发酵试验-23 6.1木聚糖酶水解液接入红酵母-23 6.1
10、.1实验仪器、试剂及材料-23 6.1.2实验操作-23 6.1.3实验结果-24 6.2纤维素酶水解液接入酿酒酵母-24 6.2.1实验仪器、试剂及材料-246.2.2实验操作-25 6.2.3实验结果-25 6.4讨论-25第7章 结论-26致谢-27参考文献-28附录-30第1章 文献综述1.1 研究背景化石能源的大量持续使用给我们带来的能源供应危机以及大气环境污染、温室气体排放过量等问题日趋严重。生物质能源作为一种可再生的化石能源替代物，正受到全世界范围内越来越广泛的关注。木质纤维素生物质资源，是生产生物燃料的主要可再生生物质能源材料，以其为原料来生产燃料乙醇已经被认可。燃料乙醇作为化
11、石燃料的一种替代物，其生产量和使用量在不断增加，这不仅有利于缓解自然资源应用的局限性，同时也可降低环境污染1。我国每年会产生数亿吨农作物秸秆，农作物秸秆有价格低廉、分布广泛等优点，但是目前的利用率极低，绝大多数被就地焚烧，这不仅是对资源的巨大浪费，还会造成土壤板结、肥力降低，也是雾霾天气产生的一大原因，对生态环境造成严重破坏2。秸秆的主要结构由外到里依次是木质素、半纤维素和纤维素3 ，以其为原料，通过碱法或酸法预处理结合酶解法把纤维素、半纤维素降解成还原糖，利用红酵母、酿酒酵母发酵产生虾青素、乙醇等代谢产物，既可避免环境污染，实现生物质能源的高效利用，又可带来可观的经济和社会效益4。从2007
12、 年以来，我国以小麦、玉米等粮食为原料生产燃料乙醇已经叫停，非粮生物乙醇的生产得到了快速发展。中国主要非粮能源作物单位面积的生物乙醇生产量由大到小依次为甘蔗、甜菜、甘薯、甜高粱、菊芋、木薯；非粮作物生产乙醇的原料成本由低到高为甜高粱、木薯、甘薯、甘蔗、甜菜、菊芋5。甜高粱单位面积燃料乙醇产量尚优，生产成本低，是生产生物乙醇的良好选择。甜高粱系普通高粱的一个变种，是一种耐盐碱、耐旱、耐贫瘠的能源作物，它能够生长在比较边缘的土地上，具有“不与民争粮，不与粮争地”的优势，种植范围广，适宜栽培的地区是东北、华北、西北和黄淮地区， 而且只需较低的成本投入就可以获得很好的收成。甜高粱是最有前途的能源作物之
13、一，它不但能提供种子和糖类，而且能提供大量的木质纤维素原料，与其他木质纤维素生物质原料相比，在生产纤维素生物乙醇上，具有更强大的竞争力1。1.2国内外秸秆的利用现状 1.2.1 国外秸秆利用发展概况 国外秸秆有多种用途。在丹麦，秸秆多用来发电。一家电厂，15万t秸秆所产生的电能，可满足几十万用户的供热和用电需求，与煤、油、天然气比起来，秸秆发电不仅成本低而且污染物少，此外，秸秆燃烧后的草木灰还可以无偿地返还给农民作为肥料。在美国，秸秆的用处很多。做成工艺品、用作饲料、整捆挤压后填充新房墙壁等。但是新的发展方向是生产燃料乙醇6。如今美国已经是第一燃料乙醇生产大国，2013年产量达3 972万t，
14、占全球产量的56.77 %7。美国计划2020年使生物质能源和生物质基产品较2000 年增加20倍, 达到能源总消费量的25 %(2050年达到50 %), 每年减少碳排放量1亿t 8。巴西政府早在1970年就开始推行“生物乙醇计划”，经过几十年的发展，巴西有些企业已经基本掌握了生物乙醇生产的技术与方法，并不再依赖政府补贴，开始进行商业化生产9。 1.2.2 国内秸秆利用发展现状我国有很丰富的生物质资源，仅农作物皮壳和秸秆一项，每年就有7亿多吨的产量，包括35 %的玉米秸秆、21 %的小麦秸秆和19 %的稻草及其他的农作物10。目前，秸秆高效利用主的要途径有：( 1) 秸秆的能源化利用：秸秆发
15、电技术，每2t秸秆的热值相当于1t煤；秸秆沼气发酵，所产生沼气可满足农户日常生活能源需求，沼渣和沼液则可用作生物肥料资源得到高效利用，形成良好的循环；秸秆气化，产生的焦油用于化工原料，气化后的草灰可用于钾肥返还农田，而且集中供气价格明显低于液化气，清洁、方便，适应现代新农村的发展需要。 ( 2) 饲料化利用：秸秆是食草家畜的主要饲料来源，未经处理的秸秆消化率低、粗蛋白含量低，而且适口性差，经过青贮、氨化等科学方法的处理可以大大提高其营养价值，对于提高秸秆利用率有重要意义。 ( 3) 肥料化利用：经过粉碎等处理后还田；堆积腐熟后施入土壤；把秸秆给牲畜垫圈之后和牲畜排泄物一起发酵后成为农家肥，施用
16、。连续施用三年农家肥可增产5 %到15 %。 ( 4) 工业化利用：秸秆是天然纤维，生物降解性好。目前，主要用于板材加工、造纸、编制、化工等领域。 （5）基料化利用：秸秆中纤维素和木质素等丰富的有机物是栽培食用菌的最佳培养基材料。栽培食用菌后的培养基既可用来生产菌体蛋白饲料，又可作为优质有机肥，形成一条有机生态产业链，促进生态农业发展 11。 同时，我国现在是生物乙醇第三生产大国，2013年产量达208万t，占全球产量的2.97 % 7。1.3 秸秆的预处理方法木质纤维素生物质原料主要通过四步实现向燃料乙醇的生物化学转化，分别是原料预处理、纤维素水解糖化、糖类发酵和产物的分离纯化，前2个过程是
17、木质纤维素有效转化的决定性步骤。其中，预处理的目的是打破木质素对纤维素的密封、预水解半纤维素、破坏纤维素的晶体结构。纤维素水解糖化主要是指纤维素和半纤维素中的葡聚糖、木聚糖等经过纤维素酶类催化作用，水解成为葡萄糖、木糖等单糖。预处理的方法通常包括物理法、化学法、 物理-化学法以及生物法4种类型1。1.3.1 物理方法表1.1 秸秆物理法预处理方法及简介方法简介机械粉碎法 通过破碎、研磨等机械手段将生物质变成 10 30 mm 的切片或0. 2 2 mm 的颗粒，从而降低纤维素的结晶度。其中，相对于其他研磨机效率较高的是震动球式研磨机 12，伴随效率高的缺点就是能耗大。液态热水法 将秸秆置于处于
18、高压状态的热水中，可使物料的40 %60 %溶解，包括4 %22 %的纤维素，35 %60 %木质素以及所有的半纤维素，物料在蒸煮时，颗粒会破裂，不仅对物料粉碎处理效果好，而且能耗较少，半纤维素的水解率与回收率高，并且水解产物中中性残余物数量少13。高能辐射 高能辐射（r射线、电子辐射等）使纤维素物质的聚合度降低、结晶性减少、吸湿性增加，这些都有利于纤维素的酶水解。但是辐射处理的成本高，目前还很难用于大规模生产14。微波处理 用频率从300 MHz300109 MHz的电磁波，其大小和方向随时间做周期性变化，是种具有穿透特性的电磁波，具有反应速度快、成本低、产率高和对环境友好的特点。但目前用微
19、波处理物料仅停留在实验室阶段。挤压膨化 将物料粉碎后调解至一定水分，放入挤压机内，螺杆的旋转推动物料向前运动，同时秸秆被剪切、挤压，并且在摩擦生热与外加热源的共同作用下升温至140 左右。此时处于高温高压状态下的物料，机头喷出时，压力降低，物料体积迅速膨胀，纤维素结晶体结构被破坏，易于受纤维素酶的酶解处理13。 1.3.2 化学方法 化学方法主要是指以酸、碱及有机溶剂等作为物料的预处理剂，达到破坏纤维素的结晶结构、打破木质素与纤维素连接的目的，与此同时促进半纤维素溶解19。 表1.2 秸秆化学法预处理方法及简介方法简介酸法 酸法预处理时可采用硝酸、硫酸、盐酸等强酸，也可以采用弱酸磷酸。其中应用
20、广泛、效果较好的是稀硫酸16、17。稀硫酸法预处理是在温和条件下进行，不仅可以使木质素、半纤维素水解，同时破坏纤维素的结晶结构，把原料结构变得更加疏松，从而提高了纤维素的降解率14、18。除此之外，浓酸水解法适应性强，应用广，糖化率高达90 %，但对反应器的腐蚀十分严重，而且成本高，需要回收重复再用，所以难以进行工业化推广。碱法 碱法预处理的原理是通过破坏木质素和碳水化合物之间的化学键，打破木质素结构，从而除去木质素来实现的，使半纤维素和纤维素失去了木质素的保护，半纤维素和纤维素暴露在外，结晶度和聚合度下降，提高了木聚糖酶和纤维素酶的可及性13、15。其优势在于反应器的成本低，但是容易造成环境
21、污染，污水处理和残余物处理成本高。碱法处理主要是用氢氧化钠、氢氧化钾、石灰、氨水、氢氧化钙等。本实验采用的是用14 %的氨水处理。有机溶剂法 有机溶剂法是以有机溶剂或有机溶剂的水溶液与无机酸催化剂（HCl或H2SO4）的混合物预处理木质纤维原料，脱除木质素和半纤维素，分离出活性纤维。也可以用有机酸（草酸、水杨酸）作为催化剂，两个催化效果基本相同13。其优点是酶的可及度高，不需后处理；纤维素的水解效率高；回收的半纤维素和木质素纯度高、活性好；有利于副产品开发；有机溶剂易于回收；成本低；对环境无污染。常用的有机溶剂有：低沸点的甲醇、乙醇和高沸点的乙二醇、丙酮、四氢化糠醇等。 1.3.3 物理-化学
22、法物理-化学法是结合化学、物理以及机械的作用将原料的细胞壁破坏，提高纤维素的可及性。其主要有蒸汽爆破、氨纤维爆破和CO2 爆破等。（1）蒸汽爆破预处理蒸汽爆破主要是利用高温高压水蒸气处理原料，并通过瞬间减小压力使细胞壁结构破碎的方法。影响蒸汽膨爆的因素有保留时间、温度、材料颗粒大小和水分含量19。蒸汽爆破过程中可以降低分子物质溶出，降低纤维素的聚合度，使原料内的氢键被破坏，纤维素的结构变得有序化，从而降低后续处理难度。但是处理过程中会使木糖发生降解，使得糖率变低且抑制后续处理及发酵，对设备要求比较高。（2）氨纤维爆破预处理氨纤维爆破是将原料浸于液氨中，再用高温高压处理，一段时间后使压力缓慢降低
23、。氨纤维爆破可以显著提高原料的酶解糖化性能，不产生对后续发酵有抑制作用的物质，但是该法不能将半纤维素有效的去除，对于木材类的预处理效果一般。（3）CO2爆破预处理CO2爆破是以CO2 作为介质得对原料进行爆破处理的过程。CO2爆破不产生对后续发酵的抑制物，且相对于氨纤维爆破更具有经济上的优势，但是其预处理效果及对原料的适应性尚需改进。1.3.4 生物预处理 在生物方法上采用棕、白和软腐真菌降解木质素和纤维素。棕腐真菌主要用来降解纤维素， 而白腐真菌不仅可以讲解纤维素还可以降解木质素， 其中白腐真菌的降解效果最为明显。白腐真菌在二级代谢过程中受碳和氮的限制，因此会产生能够降解木质素的木质素过氧化
24、物酶和好锰过氧化物酶 20。多酚氧化酶、漆酶、去醌酶和双氧水生酶都可以降解木质素21 。其优点是对环境友好、能耗小，不足之处在于降解速度慢。1.4 还原糖的测定方法在秸秆水解过程中，半纤维素被降解为多种单糖，主要有木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖等，纤维素被降解为葡萄糖，这些单糖为还原糖，测定其含量可以确定甜高粱秸秆的水解程度。还原糖的测定方法有直接滴定法（GB法）、高锰酸钾滴定法、萨氏（Somogyi）法、甘油铜法16、3-甲基-2-本病噻唑腙（MBTH）法、铁氰化钾法16、手工费林滴定法17、还原糖测定仪法17、21、DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）23、 24，测定秸秆水解液中还
25、原糖含量的主要方法有还原糖测定仪法和DNS法（3，5-二硝基水杨酸法）。本实验采用的是DNS法24。3，5-二硝基水杨酸在碱性条件下，与还原糖一起加热后被还原成棕红色的氨基化合物 3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内，反应液的颜色与还原糖的量呈正比关系。利用分光光度计，在 540 nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。1.5 本实验的研究意义及主要内容1.5.1 研究意义伴随着经济的不断增长，能源需求越来越多，而化石能源在不断减少，使用化石能源还带来一系列的环境问题，人们在不断寻找新的清洁能源，以取代化石能源，其中由植物纤维素生产的燃料乙醇以其可再生性、无
26、污染性和提高汽车的防爆性能等特点而被公认为是最有工业应用前景的可再生能源之一25。我国秸秆资源丰富，除少数得到利用，大多数秸秆被堆放或直接焚烧，不仅造成资源的巨大浪费，也带来严重的环境污染26。目前，秸秆的降解处理方式主要有酸法、碱法、氧化法、有机溶剂法、生物法等，这些方法在工业推广中都存在一些不足，因此，人们希望能探索出一种反应条件温和，时间适中，污染相对较少且便于工业推广的秸秆降解处理方法。本实验利用氨水对小麦秸秆进行初步水解，打开其致密的空间结构，然后用木聚糖酶、纤维素酶先后对其进行处理，进一步对秸秆水解，以期获得较多的还原糖，并找出其反应的最佳条件。1.5.2 主要研究内容（1） 还原
27、糖标准曲线的制作半纤维素的主要水解产物是木糖，纤维素的水解产物是葡萄糖。本实验采用DNS法对还原糖进行测定。首先，配置葡萄糖标准溶液、木糖标准溶液、DNS溶液，按照所设梯度分别在试管中加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、葡萄糖标准溶液或木糖标准溶液、DNS，摇匀后沸水浴5 min，然后立即用冷水冷却，然后在540 nm下测定吸光度，以吸光度为横坐标，还原糖含量为纵坐标制作标准曲线。（2） 甜高粱秸秆的粉碎从宁夏银川田间获取甜高粱秸秆，除去杂草，烘干，用粉碎机对小麦秸秆进行粉碎。（3） 甜高粱秸秆的氨水预处理 称干重35 g甜高粱秸秆粉末于500 ml试剂瓶中，加入350 ml浓度位14 %的氨水，置
28、于60 水浴锅中处理16 h，后用纱布真空抽滤，并用自来水将秸秆清洗至滤出液pH接近中性，将处理后的秸秆于105 烘箱烘干，备用。（4）甜高粱秸秆的酶处理木聚糖酶反应条件及用量的确定确定木聚糖酶最适反应温度，将450 l 2%的木聚糖溶液和450 l 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH值6.0）混匀，再加入100 l稀释6倍的原酶液，分别在不同温度（30 、40 、45 、50 、55 、60 、70 ）反应5 min，测吸光度，确定还原糖含量，确定最适反应温度。确定木聚糖酶最适反应pH，将450 l 2 %的木聚糖溶液和450 l 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液混匀，缓冲液的pH采用不同梯度（4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6，7.0、7.6、8.0），再加入100 l稀释6倍的原酶液，采用上述实验得出的最适温度进行反应，测定吸光度，确定其还原糖的含量，确定其最适反应pH。确定最适反应时间和酶用量，称
