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1、用于分析的芥菜型油菜总的快速提取 用于分析的芥菜型油菜总的快速提取是小柯论文网通过网络搜集，并由本站工作人员整理后发布的，用于分析的芥菜型油菜总的快速提取是篇质量较高的学术论文，供本站访问者学习和学术交流参考之用，不可用于其他商业目的，用于分析的芥菜型油菜总的快速提取的论文版权归原作者所有，因网络整理，有些文章作者不详，敬请谅解，如需转摘，请注明出处小柯论文网，如果此论文无法满足您的论文要求，您可以申请本站帮您代写论文，以下是正文。 摘要 通过对所提DNA质量、效率和PCR检测，建立和优化了可用于PCR分析的芥菜型油菜总DNA的提取方法，这一方法快速，所提的DNA质量好，可在芥菜型油菜生长发育
2、早期进行。关键词 芥菜型油菜；快速提取DNA；PCR分析中图分类号 Q523；S565.401文献标识码A文章编号1007-5739（2008）16-0172-02DNA的快速提取是分子标记技术广泛应用的基础。一般植物DNA提取技术大都采用CTAB法、SDS法。本研究在前人的基础上改进了DNA的提取方法，并根据油菜叶子蛋白多、脂类物质含量高、DNA难以提取的特点，选择了成苗时期叶片为材料，摸索可用于PCR分析的DNA快速提取方法，并优化了芥菜型油菜PCR反应体系。1材料与方法 1.1试验材料芥菜型地方品种为四川黄籽和紫叶芥的自交系。1.2方法提取液配方采用文献法1，分别配SDS和CTAB提取液
3、。1.2.1油菜总DNA提取步骤。在新配DNA提取液中加-巯基乙醇，每毫升提取液加4L -巯基乙醇备用。取0.5g幼嫩叶片，加液氮，研磨成粉末状。迅速加入2mL上述提取液，轻轻摇动研钵，使材料在提取液中分散均匀。静置10min，用剪口的1mL吸头吸取600L上清液匀速加入已编号的1.5mL灭菌eppendorf管中，每材料取2管（其中紫叶芥加适量的活性炭，吸附色素）。加入等体积的氯仿-异戊醇混合液（氯仿异戊醇=241）充分摇匀，63水浴25min。取出离心管迅速置于-20冰箱冷却35min，12 000rpm离心5min。小心取出离心管，用剪口的0.2mL吸头吸取上清液300L，合并2管上清液
4、。加入等体积的氯仿-异戊醇，充分混匀，12 000rpm离心4min。用剪口的0.2mL吸头吸取上清液400L转入1.5mL离心管中，加入3mol/L NaAC使其终浓度至0.3M（每100L上清液加11.11 L 3mol/L NaAC），混匀。加入2倍体积冰冷无水乙醇（预先在-20冷藏），温和倒转数次，置于-20冰箱中15min（使DNA充分沉淀析出）。倾斜离心管，用干净枪头带出絮状沉淀，转入加有0.5mL 70%乙醇的新灭菌离心管中，5 000 rpm离心3min。11倒去上清液，再加0.5mL 70%乙醇洗1次。再倒去上清液，瞬时离心，用20L吸头吸干残留液体后，离心管置于超净工作台上
5、吹干。12将粗提DNA溶在200L TE（10mmol/L Tris-Cl1mmol/L EDTA）溶液中。13加入等体积的氯仿-异戊醇混匀，12 000rpm离心5min。14转移上清液150L，加入2倍体积冰冷无水乙醇，混匀，置-20冰箱20min。1510 000rpm离心3min，倒去上清液，用70%乙醇洗涤23次。16瞬时离心，用20L吸取残留液体，置于超净工作台上吹干。17用灭菌超纯水或TE（10mmol/L Tris-Cl0.1mmol/L EDTA）100L溶解DNA。18用核酸蛋白质分析仪检测浓度，并结合琼脂糖凝胶电泳检测质量，后置于-70冰箱长期保存。1.2.2特异引物PC
6、R。引物1的上游引物为GTCAGAAAG AGACCGTNTGYGTNAC、下游引物为TTCCATTCACTG TCGGYTTDAT；引物2的上游引物为CATCTTGGCTAT TGGNACNGC、下游引物为CTTGACGGAAGGACGNAR NCC2；由上海生物工程技术服务有限公司合成。反应体系和扩增程序参照靶向新基因分子克隆策策略的方法进行优化3。反应体系总体积为25L，反应体系各成分见表1。引物1反应扩增程序为（T-gradient PCR热循环仪）：94预变性3min；93变性50s；55退火50s；72延长100s，循环39次，72延长5min。引物2反应扩增程序为：94预变性3m
7、in；93变性50s；57退火50s；72延长100s，循环39次，72延长5min。1.2.3随机引物PCR。随机引物、Taq酶、dNTP、10X Buffer、 Mg2+购自上海生物工程技术服务有限公司，反应体系总体积为25L，反应体系各成分见表1。94预变性3min；93变性50s；36.5退火50s；72延长100s，循环39次，72延长5min。1.2.4电泳检测。所提取的总DNA通过0.8%的琼脂糖凝胶（100mL中含10mg/mL EtBr溶液5L）电泳检测质量。电泳1h左右，在凝胶成像系统中拍照。PCR产物通过1.8%的琼脂糖凝胶（100mL中含10mg/mL EtBr溶液5L
8、）。电泳4h左右，在凝胶成像系统中拍照。2结果与分析2.1DNA质量检测及浓度测定采用Beckman D640核酸蛋白质分析仪进行检测，每个DNA样品分别读取230nm、 260nm 和280nm值，按公式“样品DNA浓度OD26050g/mL稀释倍数”计算，把样品稀释到200ng/L（见表2）。DNA质量检测在DYY-III型（北京六一仪器厂）水平电泳槽上进行。分别取上述DNA样品5L通过0.8%的琼脂糖凝胶（100mL中含10mg/mLEtBr溶液5L）电泳检测质量，以1TBE缓冲液，12V/cm稳压电泳进胶，8V/cm稳压电泳至指示剂溴酚兰距底端约1cm处结束。标准分子量为Lambda
9、DNA/EcoRI+HindIII，购自上海生物工程技术服务有限公司。结果表明，此方法所提DNA分子量大小约为22kb（见图1）。2.2特异引物扩增结果引物1、引物2用2种方法所提的DNA为模板都能扩增出清晰的带（见图2）。2.3随机引物扩增结果引物S362、S493、S1038、S1192、S1392、S2053用2种方法所提的DNA为模板都能扩增出清晰的带（见图3）。3讨论本试验在前人的基础上对SDS法、CTAB法进行改良4，5，使其更适合芥菜型油菜的DNA提取。从2种DNA提取方法的结果来看：CTAB法提取的总DNA比SDS法要纯；但在特异引物和随机引物扩增时，2种方法提取的模板DNA在
10、扩增产物中没有差别，都能对样品扩增出高质量的带，用这2种方法均可获得理想PCR反应的DNA模板，为PCR技术的规模化快速分析和应用奠定了基础。由于近年来所选品种的遗传范围越来越窄，利用常规手段，如形态标记、同工酶标记等已不能满足实际的需要，而以PCR为基础的分子标记技术在检测水平和范围上，不仅可以检测全基因组和无限性，而且比较快速、准确。我们在油菜DNA提取环节上成功的简化尝试，为以DNA为材料进行研究奠定了基础。4参考文献1 王关林，方宏筠.植物基因工程（第二版）M.北京：科学出版社，2002.2 FOURMANN M，BARRET P，FROGER N，et al.From Arabido
11、psis thaliana to Brassica napus：development of amplified consensus genetic markers（ACGM）for construction of a gene mapJ.Theor Appl genet，2002（105）：1196-1206.3 张学敏，王宜强.靶向新基因分子克隆策策略理论与方法M.北京：军事医学科学出版社，1999.4 李佳，沈斌章，韩继祥，等.一种有效提取油菜叶片总DNA的方法J.华中农业大学学报，1994，13（5）：521-523.5 EDWARDS K，JOHNSTONE C，THOMPSON C
12、. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysisJ.Nucleic Acids Rec，1991（19）：1349.其他参考文献Baker, Sheridan. The Practical Stylist. 6th ed. New York: Harper & Row, 1985.Flesch, Rudolf. The Art of Plain Talk. New York: Harper & Brothers, 1946.Gowers, Ernest. The Compl
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