《采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响食品科学工程毕业论文.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响食品科学工程毕业论文.doc（17页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、目录摘要1前言11 材料与方法21.1 材料21.2 方法21.2 .1 病原菌的分离、纯化和保存21.2.2 孢子悬浮液的制备21.2.3硅酸钠浸泡处理果实21.2.4损伤接种31.2.5取样方法31.2.6丙二醛(MDA)含量测定31.2.7 细胞膜完整率的测定31.2.8 细胞膜微膜囊提取、NADPH氧化酶和Ca2+-ATPase活性的测定41.2.9脂氧合酶（LOX）活性测定41.2.10 蛋白含量测定51.2.11 数据统计52 结果与分析52.1硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜完整率及MDA含量的影响52.2硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜NADPH氧化酶和Ca2+-ATPase活
2、性的影响62.3硅酸钠处理及挑战接种对果实脂氧合酶（LOX）活性的影响73 讨论7参考文献9致谢10采后硅酸钠处理对厚皮甜瓜细胞膜相关物质含量及酶活性的影响摘要：本文研究了100 mM硅酸钠采后处理和粉红单端孢（Trichothecium roseum）挑战接种对对“银帝”厚皮甜瓜果实细胞膜部分氧化还原体系的影响。结果表明：硅酸钠处理明显延缓了甜瓜果实细胞膜完整率的降低，处理后第4d高于同期对照20.7%；明显提高了果实细胞膜NADPH氧化酶，挑战处理后第10d高于同期对照82.4%；延缓了脂氧合酶（LOX）活性的升高，处理后第6d活性低于同期对照10.9%； 丙二醛（MDA）含量有所增加，处
3、理后第10d高于同期对照44.8%。关键词：硅酸钠 果实 细胞膜 前言 甘肃省是我国厚皮甜瓜的主要产区之一，甜瓜营养丰富、甘甜爽口、风味独特，深受大众喜爱。然而，由于其产期集中，且正值高温季节加之缺乏必要的冷链和有效的包装，采后腐烂颇为严重，造成厚皮甜瓜采后腐烂的主要病害包括黑斑病、白霉病、软腐病、粉霉病等1。果蔬采后病害发生的重要原因是受到病原物侵染时，细胞的膜结构和特性将发生改变，从而引起代谢失调，最终导致细胞死亡。质膜NADPH氧化酶是一种以胞质NADPH为电子供体，催化胞外O2生成超氧阴离子的氧化还原酶，通过催化产生AOS，细胞质内Ca2+增加会促进植物组织乙烯合成并加速这些组织的衰老
4、2-3。质膜和细胞器外膜的Ca2+-ATP酶能够把细胞质过多的Ca2+转运到细胞外或细胞器贮藏起来。另外LOX能催化多元不饱和脂肪酸发生过氧化作用，LOX及其氧化物可能直接参与了植物组织的衰老过程。有报道表明硅可以有效降低厚皮甜瓜的采后病害4-7。但是对其作用机理的探讨主要集中于硅酸钠处理对POD 、PAL和CHT活性的影响,但是对细胞膜相关物质含量(MDA)及酶（NADPH氧化酶、LOX和Ca2+-ATPase）活性的影响鲜有报道。本实验以厚皮甜瓜为试验材料，研究硅酸钠处理对细胞膜相关物质含量及酶活性的影响，探讨其降低采后病害的机理，以其为硅的进一步扩大使用提供理论依据。1 材料与方法1.1
5、 材料供试“银帝”甜瓜采自甘肃民勤县收成乡露天栽培大田中，花后45天采收。单果套发泡网袋后入标准包装箱（6个/箱）当天运抵实验室后在常温条件下（222；RH 55-60%）贮藏待用。硅酸钠由天津市科密欧化学试剂开发中心生产，分析纯。1.2 方法1.2 .1 病原菌的分离、纯化和保存参照方中达法（1998）。采集典型粉霉病（T. roseum）发病甜瓜果实，用70%酒精表面消毒后切取病健交界处组织，经表面消毒后移至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，于25保温培养。待菌落形成后采用稀释法进行单孢分离、纯化。纯化菌株经回接试验确定其致病力后于斜面PDA上4下保存待用。1.2.2 孢子悬浮液的制备参
6、照Bi et al.（2006）方法。取25下培养10天的带菌PDA平皿一个，加入含0.05% Tween20的无菌水约10mL，用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子，然后转入50mL三角瓶中，在WYX-A微型旋涡混合器上振荡15秒，再用双层纱布过滤，滤液用血球计数板计数算出孢子悬浮液的浓度后，最后稀释至所需浓度，1106 个/mL。1.2.3硅酸钠浸泡处理果实硅酸钠诱导处理：将表面用自来水冲净并晾干的果实浸入100 mM的硅酸钠溶液中(内含0.05%的Tween80)10 min，取出晾干后，单果套发泡网袋，入包装箱（6个/箱），于常温（222；RH55%-60%）下贮藏供接种之用。以清水（内含0
7、.05%的Tween80）处理作对照。1.2.4损伤接种参照毕阳和张维一（1993）方法并修改8。选取硅酸钠处理后常温贮藏48h的果实，经75%酒精表面消毒后，用灭菌铁钉（直径3mm）在果实表面等距离刺孔10个（深3mm）。分别取20L孢子悬浮液接入孔内。稍作晾干后入包装箱，上覆聚乙烯塑料薄膜（厚0.01mm）保湿，室温(222；RH85%-90%)条件下贮藏待取样用。每处理用果实12个，重复3次。1.2.5取样方法参照Bi et al.（2005）方法。分别于处理后0、2、4、6、8、10天用直径5mm打孔器打取皮下3-10mm处果肉组织3g。挑战接种样品则取T. roseum接种后2、4、
8、6、8天病斑以外皮下3-10mm处果肉组织3g。组织用锡箔纸包好，液氮冷冻，在-80超低温冰箱中保存待测。每个处理每次取样用果实6个。1.2.6丙二醛(MDA)含量测定 参照Hodges et al.（1999）方法并修改。取3 .0 g果肉组织，加入3 mL 10%三氯乙酸（TCA）溶液研磨成匀浆后，于4下12000g离心20 min。取1mL上清液，加入2 mL 0.6%的2-硫代巴比妥酸（TBA）溶液(用TCA配制)，混合后煮沸15 min，冷却后再离心一次。分别测定反应液在450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值。按下式计算反应混合物中MDA的浓度，然后计算出果实样品中MD
9、A含量（nmolg FW-1）。反应液中CMDA（mmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450MDA含量（nmolg FW-1）= CMDA（mmol/L）提取液体积（mL）/果肉组织鲜重（g）注：上式中6.45、0.56均为常数。1.2.7 细胞膜完整率的测定 参照Lester and Bruton（1986）方法并修改。直径5 mm打孔器打取赤道部位皮下2-8mm组织9片，挑战接种样品则取接种后2、4、6、8天病斑以外皮下2-8 mm处果肉组织（每次用果实3个，每个果实取样3次）。称重后，组织用无离子水充分冲洗3次后，置于滤纸上吸干多余水分，放入含40 mL无离子
10、水的烧杯中，用电导仪测3 h（25）后的电导率。然后将烧杯及组织在95下水浴30 min后测定最终的电导率。细胞膜完整率由下式计算：细胞膜完整率（%）=1-（3 h后电导率/最终电导率）1001.2.8 细胞膜微膜囊提取、NADPH氧化酶和Ca2+-ATPase活性的测定 参照Morre et al.(2000)方法提取细胞膜微膜囊。取果肉3g，用3mL提取液匀浆，然后用四层纱布过滤。滤出液7500 g离心15 min，上清液20000 g离心40min，保留沉淀。沉淀用1 mL悬浮液稀释，得到粗的细胞膜微膜囊提取液。 提取液含有：25 mmolL-1Tris-mes（pH 7.8）、0.25
11、 molL-1蔗糖、3 mmolL-1 EDTA、0.9% PVP、5mmolL-1 DTT（二硫苏糖醇）、1 mmolL-1 PMSF（苯甲基磺酰氟）；悬浮液含有：5 mmolL-1 Tris-Mes三羟甲基氨基甲烷-2-（N-吗啉）乙磺酸缓冲液，pH 7.8、0.25 molL-1蔗糖、5 mmolL-1 KCl、1 mmolL-1 DTT、1 mmolL-1 PMSF。NADPH氧化酶活性的测定：参照Sagi et al.( 2001)方法并修改，采用上述细胞膜微膜囊，通过NADPH氧化酶产生的活性氧氧化XTT2，3-Bis（2-methoxy-4-nitro-5-suLfophenyl
12、）-2H-Tetrazolium-5-carboxanilide inner salt的量来表示该酶活性。反应体系2mL包括50 mmolL -1 Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），0.5 mmolL -1 XTT，100 molL-1 NADPH和200L的细胞膜微膜囊，加入NADPH启动反应，XTT减少量可通过470 nm检测。酶活性以 OD470min-1g-1FW。Ca2+-ATPase活性的测定：参照李杨瑞（1987）和Robbins et al.（1999）方法，稍作修改。利用细胞膜微膜囊跟反应液产生的磷含量来表示该酶的活性。取400L反应液（25 mmolL-1 Tris-
13、mes，50 mmolL -1 KCl，10 mmolL-1 CaCl2，2 mmolL-1 Na+-ATP，pH 7.5），加入40 L 0.4% Triton-X-100，再加入40 L的微膜囊启动反应，置于37水浴锅中培养30 min。反应之后加入1mL反应终止液，置于37水浴锅中培养30 min，来终止反应，接着在紫外分光光度计上读取820 nm的OD值。终止液包括A：0.42%的钼酸铵0.5 mol H2SO4；B：10%抗坏血酸；C：0.3% SDS（十二烷基磺酸钠）。其中VAVBVC611。酶活性以OD820g-1FW表示。实验重复3次。1.2.9脂氧合酶（LOX）活性测定参照A
14、xelrod et al.（1981）的方法略加改进。底物制备。底物为10mmol /L 的亚油酸钠，即70mg 亚油酸钠、70L TritonX-100和4mL无氧水， 混匀后用NaOH滴定至澄清， 定容至25mL， 低温保存备用。粗酶液提取。取果肉3.0g， 冰浴研磨， 加入50mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.0) ， 4 下离心， 上清液用于酶活性测定。LOX 活性测定。3mL 反应体系中含底物25L，100mmol/L柠檬酸-磷酸缓冲液(pH值6.0) 2.775mL，30 温育， 加酶液后15 s开始计时， 记录234 nm处的吸光值变化， 酶活性以OD 234 / ( gmin)
15、 表示。实验重复3次。1.2.10 蛋白含量测定 参照Bradford(1976) 方法测定，以牛血清蛋白（BSA）为标准蛋白作标曲，计算蛋白含量。1.2.11 数据统计 全部试验数据用Microsoft Excel 2003进行标准偏差(SE) 计算。2 结果与分析2.1硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜完整率及MDA含量的影响 图1 100mM硅酸钠处理及T. roseum挑战对甜瓜果实细胞膜完整率(A)和丙二醛含量(B)的影响, 图中小垂线表示标准误（SE）。甜瓜果实采后细胞膜完整率总体呈下降趋势，而硅酸钠处理延缓了果实细胞膜完整率的降低（图1A）。硅酸钠处理者与对照在第4d细胞膜完整率差
16、异最大，处理者高于同期对照20.7%。T. roseum挑战接种可明显增大对照和处理者细胞膜完整率的降低速率，但在接种后的6d期间硅酸钠处理者细胞膜完整率明显高于对照。硅酸钠处理明显增加了果实的MDA含量（图1B），处理者MDA含量与对照的差异随着贮藏时间的延长逐渐增大，第10d达到最大，高于同期对照44.8%。T. roseum挑战接种可进一步提高处理者和对照的MDA含量，且挑战后处理者的MDA含量显著高于挑战后的对照，两者MDA含量的最大差异出现在第8d，含量高于同期对照1.8倍。2.2硅酸钠处理及挑战接种对果实细胞膜NADPH氧化酶和Ca2+-ATPase活性的影响图2 100mM硅酸钠
17、处理及T. roseum挑战对甜瓜果实NADPH氧化酶(A)和Ca2+-ATPase活性(B)的影响, 图中小垂线表示标准误（SE）。硅酸钠处理果实细胞膜NADPH氧化酶活性在贮藏期间逐渐增大，第6d之后高于对照，而对照果实细胞膜NADPH氧化酶活性变化不大（图2A）。T. roseum挑战接种明显提高了处理者和对照的NADPH氧化酶活性，两者在第8d达到最高峰，之后逐渐降低，而对照果实NADPH氧化酶活性在第10d下降到未接种对照水平，且挑战后处理者的NADPH氧化酶活性明显高于挑战后的对照，第10d差异达到最大，活性高于同期对照82.4%。与处理间相比，挑战后处理者和对照NADPH氧化酶活
18、性的增加分别可至少持续8d和6d。甜瓜果实采后细胞膜Ca2+-ATPase活性总体呈下降趋势，且硅酸钠处理果实Ca2+-ATPase活性的下降速率明显高于对照果实（图2B）。但T. roseum挑战接种明显延缓了处理者Ca2+-ATPase活性的下降，且在挑战后第4d开始活性高于挑战后对照，挑战后第6d达到未接种对照水平，而挑战后对照果实Ca2+-ATPase活性的下降速率增大。2.3硅酸钠处理及挑战接种对果实脂氧合酶（LOX）活性的影响图3 100mM硅酸钠处理及T. roseum挑战对甜瓜果实脂氧化酶的影响,图中小垂线表示标准误（SE）。甜瓜果实采后细胞膜LOX酶活性总体呈上升趋势，且硅酸
19、钠处理果实LOX酶活性的上升速率明显低于对照果实（图3）。但T. roseum挑战接种后甜瓜果实LOX酶活性明显高于未挑战对照，且在挑战后第4d开始活性高于挑战后对照，第6d挑战后处理者与对照差异达到最大，活性低于同期对照10.9%，之后LOX酶活性上升趋势减缓。3 讨论 MDA是细胞质膜和生物膜系统中脂质过氧化的主要产物，对病原菌具有直接毒性。本实验发现，硅酸钠处理甜瓜果实后果实组织中MDA迅速积累，这表明脂质过氧化也参与了硅酸钠诱导果实产生的抗病性。果实细胞膜完整率的降低速率在硅酸钠处理及T. roseum接种后明显抑制，细胞膜完整率的降低是病害发生中的常见现象，但是硅酸钠处理有效抑制了挑
20、战后细胞膜完整率的降低速率，表明硅酸钠在胁迫下启动了细胞的各种保护机制，在一定程度上维持了果实细胞膜的完整性。本研究还发现，硅酸钠处理经挑战接种诱导了甜瓜果实细胞膜NADPH氧化酶活性的升高，而且也诱导了Ca2+-ATPase活性的升高，说明在病原物胁迫下硅酸钠处理可能通过NADPH氧化酶催化形成的活性氧而激活钙信号，启动应答反应机制，提高果实抗病性，同时Ca2+-ATPase可以维持细胞质内Ca2+稳态，抑制了果实组织衰老。另外LOX能催化多元不饱和脂肪酸发生过氧化作用，LOX 及其氧化物可能直接参与了植物组织的衰老过程9。此外GbeL（2001）报道LOX可能在伤害及病虫害防御中扮演着重要
21、的角色，它本身可能是通过其作用的产物如茉莉酸的信号作用， 使植物体构建起防御体系10。硅酸钠处理经挑战接种抑制了甜瓜果实细胞膜LOX酶活性的升高，说明硅酸钠处理通过对LOX酶活性的抑制来提高果实的抗病性。待添加的隐藏文字内容2参考文献1 毕阳, 王春玲. 白兰瓜贮藏期的病害J. 中国果品研究. 1987, 1: 22-24.2 郝福顺, 陈珈. 植物细胞膜NADPH氧化酶的研究进展J. 植物学通报. 2005, 22: 1-10.3 关军锋. 钙与植物衰老M.北京:农业出版社, 2001. 271-298.4 郭玉蓉, 毕阳, 曹孜义. 硅处理对甜瓜红粉病的影响J. 园艺学报. 2003, 5
22、: 248-250.5 Bi Y, Tian S.P, Guo Y.R., et al. Sodium silicate reduces postharvest decay on Hami melons:Induced resistance and fungistatic effects J. Plant Disease, 2006, 90: 279283.6 盛占武, 毕阳, 鄯晋晓等. 采后硅酸钠处理对马铃薯干腐病的抑制J. 食品工业科技, 2007, 9: 190-1917 Li Y. C., Bi Y., Ge Y. H., et al. Antifungal activity of
23、sodium silicate on Fusarium sulphureum and its Effect on dry rot of potato tubersJ. Journal of Food Science, 2009, 5: 1334-1339.8 毕阳, 张维一. 杀菌剂和热水处理损伤接种果实控制哈密瓜的采后病害J. 植物保护学报, 1991, 23: 362-367.9 马崇山. 脂氧合酶在果实成熟衰老及抗伤病中的作用J. 广西科学, 2004, 11（4）:347-350.10 Gbel C G, Feussner I, Schmidt A , et al. Profiling
24、 reveals the pref-erential stimulation of the 9-lipoxygenase pathway in elicitor-treated potato cells J. Biology Chemistry, 2001, 9: 6267-6273.Effect of Postharvest Sodium Silicate Treatment on the Content of Related Substances and the Activity of Enzymes of Cell Membrane in Muskmelon Fruit He Shun-
25、long (College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou, 730070)Abstract: The effect was studied of sodium silicate dipping treatment at 100 mM and inoculation with Trichothecium roseum on oxide and deoxidize system of membrane in Muskmelon fruit (cv. Yindi) The results
26、 showed that sodium silicate treatment significantly delayed the decrease of cell membrane integrity, which was 20.7% higher than that of control after 4 days of treatment. Si treatment significantly increased the activity of NADPH oxidase, which was 82.4% higher than challenge control after 10 days
27、 of treatment. The lipoxygenase (LOX) activity in treated fruit was 10.9% lower than the control, after 8 days of treatment. Si treatment increased the content of MDA, which was 44.8% higher than control after 10 days of treatment. Key words: sodium silicate; fruit; cell membrane致 谢在整个实验过程中，首先要特别的感谢毕阳老师给予我的悉心指导和帮助。另外还有高晓辉师兄，从一开始的试验到后来论文的初稿写作以及最后的论文定稿，他们都付出了大量宝贵时间和心血，他们对我孜孜不倦的教诲以及做人做事的方法将对我以后从事任何工作都会产生深远的影响。此外还要感谢实验室的各位老师、高雄杰师兄、陈松江师兄、袁莉师姐、尹燕师姐、李颖超师姐、樊育林、范存斐等同学的鼎力帮助，是大家的共同努力才使得试验得以顺利的开展。本研究得到国家自然基金项目：采后可溶性硅处理对厚皮甜瓜果实抗病性的诱导机理研究（30671465）的全面资助
