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1、学校编码：10384 分类号 密级 学号：B200426027 UDC 博 士 学 位 论 文 大肠杆菌来源的HPV6 L1重组蛋白的基础及应用研究Basic and Application Studies on E. coli Derived HPV6 L1 Recombinant Protein潘晖榕指导教师姓名：夏宁邵 教授专 业 名 称：生物化学与分子生物学论文提交日期：2008年11月论文答辩时间：200年12月学位授予日期： 答辩委员会主席：田德英 评 阅 人： 2008年 11 月目录目录I摘要1Abstract3缩略词5前言71.HPV研究回顾72.HPV的结构72.1.HPV
2、基因组结构72.2.HPV的早期蛋白82.3.HPV晚期蛋白与病毒结构102.4.二硫键与HPV 颗粒结构132.5.L1蛋白的自组装142.7.L2蛋白153.HPV的分型164.HPV的感染以及致病机制175.HPV的免疫195.1.抗HPV的天然免疫205.2.抗HPV的特异性免疫205.3.HPV免疫低反应性以及免疫逃逸的机制226.HPV感染的诊断236.1.HPV DNA检测236.2.HPV抗体检测247.HPV流行情况以及所致疾病247.1.高危型与低危型HPV247.2.HPV感染的传播257.3.HPV感染的流行情况257.4.高危型HPV感染所致疾病297.5.低危型HP
3、V感染所致疾病298.HPV疫苗研究现状328.1.HPV疫苗的基本要求328.2.现有的HPV疫苗339.蛋白质结构研究及预测389.1.蛋白质结构研究的实验方法389.2.蛋白质结构研究的预测方法399.3.蛋白结构预测在抗体模拟上的应用459.4.抗体模拟技术的应用前景：4610.B细胞抗原表位定位的研究方法4710.1.B细胞表位的预测法4710.2.B细胞表位定位的实验方法4911.本文研究的思路，目的和意义51材料与方法531.材料531.1.主要设备531.2.菌株、质粒、实验动物541.3.工作站、软件及其使用模块551.4.酶和单抗552.方法552.1常用溶液及培养基配制5
4、52.2常规分子生物学实验方法572.3HPV6 L1相关的克隆构建，表达纯化以及检测方法622.4疫苗原液及成品检定方法662.5分析型超速离心机相关操作672.6蛋白质晶体培养692.7圆二色光谱测定702.8抗HPV6标准血清的制备702.9HPV6单抗的制备,鉴定与CDR区测序712.10分子模拟与分子对接77结果与分析81第一部分HPV6 VLP疫苗的研究811.HPV6 VLP小量制备方法的建立811.1.大肠杆菌重组表达质粒pTO-T7-6N5C的构建811.2.HPV6N5-Ll在大肠杆菌中的可溶性表达821.3.重组蛋白HPV6N5-Ll的色谱纯化841.4.HPV6VLP组
5、装条件的摸索871.5.小结902.HPV6 VLP疫苗的中试研究902.1.HPV6N5C-L1的高密度发酵表达902.2.HPV6N5C-L1的中试规模粗纯902.3.HPV6N5C-L1的中试规模色谱纯化912.4.HPV6 VLP的大量组装922.5.HPV6 VLP疫苗中试工艺的评价932.6.小结953.HPV6 VLP疫苗免疫原性的考察964.HPV6 VLP疫苗原液稳定性的考察985.第一部分小结103第二部分HPV6 VLP疫苗的结构分析及表位定位1031.HPV6 VLP疫苗的结构分析1031.1.HPV6N5C-L1一级结构的研究：1031.2.HPV6N5C-L1二级结
6、构的研究1051.3.HPV6N5C-L1 五聚体结构的研究1051.4.HPV6N5C-L1 VLP结构的研究1131.5.小结1152.HPV6 VLP疫苗表位的定位1152.1.HPV6单抗的筛选以及鉴定1162.2.利用分子对接技术预测HPV6 VLP疫苗的优势表位1212.3.利用同源扫描法进行HPV6 VLP疫苗优势中和表位的定位1282.4.预测表位与实验确定表位的比较1312.5.小结1323.第二部分小结133讨论1341.大肠杆菌表达系统在HPV VLP疫苗研究中的应用1342.HPV抗体的检测1363.HPV疫苗的发展趋势139小结与展望143参考文献144致谢153在校
7、期间发表论文及申请专利154大肠杆菌来源的HPV6 L1重组蛋白的基础及应用研究摘要人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus HPV）能够引起肛生殖器部位的多种良性及恶性病变。在HPV感染所致疾病中，尖锐湿疣是一种相当常见的性传播疾病。虽然该疾病为良性病变，但是具有反复发作，不易痊愈的特点，往往会给患者带来沉重的心理压力及经济负担。尖锐湿疣主要由HPV6及HPV11感染所引起，其中由HPV6感染所引起的占到了70%。因此，一种有效的HPV6疫苗能够显著减少尖锐湿疣的发生和传播。研究表明HPV L1蛋白在体外组装而成的类病毒颗粒(Virus-Like Particle VLP)是一
8、种良好的HPV疫苗形式，可以诱导高滴度的抗HPV中和抗体。目前，已有两种HPV VLP疫苗上市，其安全性及有效性也得到了充份的证实。但是上述两种疫苗均采用真核表达系统，生产成本高，产品价格昂贵，难以在发展中国家推广。而大肠杆菌表达系统具有培养条件简单，生产成本低廉的突出优点。若将其应用于HPV6 VLP疫苗的研究中将能够降低疫苗成本，促进该疫苗在发展中国家的推广。本研究尝试利用大肠杆菌表达系统制备具有良好免疫原性及稳定的HPV疫苗，并对该疫苗的结构及表位进行分析。在本研究中并未以包涵体的形式在大肠杆菌中表达重组蛋白HPV6N5C-L1，而是将目的蛋白以非融合的形式可溶地表达于大肠杆菌中。所表达
9、的HPV6N5C-L1蛋白在经过盐析沉淀，复溶，阳离子交换色谱，疏水相互作用色谱这一系列纯化步骤之后，其纯度能够达到96%以上。经纯化的HPV6N5C-L1很好的保持了其天然构象，可以在缓冲液(10mmol/L PB pH6.0，150mmol/L NaCl)中组装为半径约为25nm左右的空心颗粒，具有典型的HPV6 VLP的形态结构。在上述HPV6 VLP小量制备方法基础上，本研究进一步进行了HPV6 VLP疫苗的中试研究，以便建立高效，稳定的HPV6 VLP中试工艺。研究结果显示，该工艺不但具有25%左右的较高得率，而且对于目的蛋白具有良好的纯化效果。经过纯化，目的蛋白的纯度能够达到96%
10、以上，而内毒素，外源DNA含量均能够符合药典要求。此外，通过对三批次中试的观察，证实了该工艺同时具有良好的稳定性。中试研究所制备的HPV6 VLP疫苗需要进一步进行免疫原性及稳定性考察。实验结果显示，本研究制备的HPV6 VLP疫苗的ED50为0.009g，低于对照组中Merck HPV疫苗Gardasil的0.016g。在稳定性研究中，HPV6 VLP疫苗原液在25放置7Day后，其平均水化半径，HPLC保留时间，沉降系数，体外相对抗原含量均未发生明显变化。在37放置7天后，HPV6 VLP的平均水化半径有略微增大，而其余检测指标也未见明显变化。上述研究结果证实了本研究所制备的HPV6 VL
11、P具有良好的免疫原性及稳定性。由于HPV VLP具有复杂的空间构象，而且HPV疫苗的效果也严格依赖于其正确的空间构象的形成。因此本研究在成功制备HPV6 VLP疫苗的基础上进一步对该疫苗的结构及抗原表位进行研究，以阐明HPV6 VLP的结构及表位特征，为建立全面的疫苗质控体系及进行疫苗设计奠定基础。结构分析显示，组成大肠杆菌来源HPV6 VLP的五聚体在大小，分子量上均与理论值吻合，并且在一定条件下能够形成晶体，具有正确的构象。而HPV6 VLP为空心圆形颗粒，平均约半径为25nm，表面可见壳粒，具有典型的HPV VLP的特征，与真核来源的HPV VLP无异。通过对多个中试批次样品进行分析，可
12、以发现所制备的HPV6 VLP在颗粒半径，保留时间，沉降系数等指标上具有高度的一致性。在表位研究中，本研究筛选得到了HPV6 优势中和单抗7A8,13H5，这两株单抗同时还具有HPV6/11交叉中和活性。利用这两株单抗模型与HPV6 五聚体模型的分子对接，可以将HPV6 的优势中和表位定位于HPV6 VLP表面的DE,FG,HI三个环状区域上。而后进一步通过同源扫描的方法验证了上述对接结果，并且进一步将上述表位定位于HPV6 VLP表面的三个区域：V138N139V140G141 ，E259V260G261E262P263V264P265D266 T267L268 I269I270, S345
13、T346 Y347T348 N349 S350 D351Y352。综合上述结果，本研究成功利用大肠杆菌表达系统制备了HPV6 VLP疫苗，验证了其稳定性，有效性及结构正确性，并且对其优势中和表位进行了定位。这些工作将为HPV6 疫苗研究及新型HPV疫苗设计提供参考。关键词：人乳头瘤病毒6型 晚期蛋白L1 大肠杆菌表达系统 类病毒颗粒 疫苗 表位定位Basic and Application Studies on E. coli Derived HPV6 L1 Recombinant Protein AbstractHuman papillomavirus (HPV) can cause les
14、ions ranging in severity from benign Condyloma Acuminatum (CA) to malignant in cervical cancer in human anogenital tract. And CA is one of the most common sexual transmitted diseases. Because of frequency of recurrences after treatment, this disease can bring huge economic burden and become a very s
15、ignificant public health problem. Recent studies have shown that about 70% of CA cases are caused by HPV6. So an effective vaccine against HPV6 would greatly reduce CA incidence.Studies had showed HPV L1 can assemble into VLP (Virus-like particle) spontaneously in vitro. The VLPs morphologically and
16、 immunologically resemble native capsids and can elite high titer neutralization antibodies and protect human from homologous genotype HPV infection and had been confirmed to be a good HPV vaccine candidate. There are two available HPV VLP vaccines now and all are proved to be safe and efficient. Bu
17、t both of these two vaccines are derived from eukaryotic expression system and the high manufacturing cost would make them not be ideal for used in developing countries. E. coli expression system has been widely used in producing many recombinant DNA pharmaceuticals because of it is easy to transfor
18、m, grows quickly in simple media, and requires inexpensive equipment for growth and storage. So a highly immunogenicity and low in manufacturing HPV6 vaccine prepared with E. coli expression system will make it ideal for used in developing countries. In this study E. coli expression system was used
19、to develop a cheap and efficient HPV6 VLP vaccine. And the structure and epitopes of HPV 6 VLP were studied too.Not like other studies, HPV6N5C-L1 was expressed in no-fusion soluble form in E. Coil. And after purified by salting, ion-exchange chromatography, and hydrophobic interaction chromatograph
20、y, the purity of HPV6N5C-L1 can reach 96%. The purified HPV6N5C-L1 kept its native confirms and can assemble into typical HPV VLP with the radius of about 25nm in the buffer of 10mmol/L PB pH6.0, 150mmol/L NaCl.The pilot study of HPV6 VLP vaccine was proceed on the base of lab scale preparation proc
21、ess. And the results showed the recovery rate of the process was above 25%. The purity of HPV6N5C-L1 can reach 96% and the content of residual extraneous DNA, residual host bacterial protein and bacteria endotoxin can meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia. The data of 3 batches further show
22、ed the scale up processs stability.In the study of HPV6 VLP vaccines antigencity, the results showed E. coli derived HPV6 VLP vaccines ED50 was 0.009g.This is lower than Mercks 0.016g. And after stored in 25 for 7Day, the radius, HPLC retain time, sedimentation coefficient and related in-vitro poten
23、cy of HPV6 VLP didnt change obviously. The radius of HPV6 VLP stored in 37 for 7Day change from 27.64 nm to 29.81nm, but there were not other obvious change. So the E. coli derived HPV6 VLP vaccine was proved to antigencity and stability.It is well know that HPV6 VLP vaccines efficiency depends on i
24、ts complicate conformation strictly. So it is important to reveal HPV6 VLPs structure and epitope characters to establish a HPV6 VLP vaccine QC system base on these informations.This study showed the pentamers regarded as bricks of HPV6 VLP has the radius of 6nm and molecular weight of 224.8kD which
25、 is highly consist with theoretic values. The pentamerss crystallization in some conditions revealed they were in correct conformation. TM showed HPV6 VLPs were particles consistent with the size and shape of native virions. DLS measurements further showed the average hydrodynamic radiu of HPV 16 VL
26、P was about 25nm. Multi-batches statistics reveal the HPV6 VLPs prepared in this study in highly homogeneous. HPV6 predominant neutralizing mAbs 7A8, 13H5 were identified in this study. These mAbs not only neutralized HPV6 pseudoviruses but also HPV11, so their epitopes were important. These epitope
27、s were mapped to surface loop DE, FG, HI of HPV6 VLP by molecular docking. And the result was confirmed by homology scanning. Homology scanning further mapping these epitopes in 3 regions of HPV6 VLP surface :V138N139V140G141, E259V260G261 E262P263V264P265D266 T267L268 I269I270, S345T346 Y347T348 N3
28、49 S350 D351Y352。Based on all these results, a cheap, efficient and stable HPV6 VLP vaccine can be prepared with E. coli expression system. The structure characters of HPV6 VLP were revealed. And the major binding sites of predominant neutralizing mAb were indentified. All these work will pave the w
29、ay for further design of new generation of HPV vaccine. Key words: Human papillomavirus type 6; major capsid protein L1; E. coli expression system; virus-like particle; vaccine; epitope mapping缩略词aa: amino acid, 氨基酸Amp: Ampicillin, 氨苄青霉素APCs: Antigen Presenting Cells, 抗原呈递细胞AU: Analytical Ultracentr
30、ifugation, 分析型超速离心技术bp：base pair, 碱基对BPV: Bovine Papillomavirus,牛乳头瘤病毒CA: Condyloma Acuminatum, 尖锐湿疣CD: Circular Dichroism, 圆二色性CDR: Complementarity Determining Region, 抗原 互补决定区CH: Constant Region of Heavy Chain, 重链恒定区CIN: Cervical Intraepithelial Neoplasia, 宫颈上皮内瘤样病变CL: Constant Region of Light Cha
31、in, 轻链恒定区COPV: Canine Oral Papillomavirus，犬口腔乳头瘤病毒CRPV: Cottontail Rabbit Papillomavirus, 棉尾兔乳头瘤病毒cryo-EM: cryo-Electron Microscopy, 冰冻电子显微镜CTL: Cytotoxic T Lymphocyte, 细胞毒T淋巴细胞Da: Dalton, 道尔顿DC: Dentritic Cell, 树突状细胞DLS: Dynamic Light Scattering, 动态光散射DNA: Deoxyribonucleic Acid, 脱氧核糖核酸E6AP: E6 asso
32、ciated protein, E6相关蛋白ED50: Median Effective Dose, 半数有效剂量ELISA: Enzyme-linked ImmunoSorbant Assay, 酶联免疫吸附测定EM: Electron Microscopy, 电子显微镜ER: Endoplasmic Reticulum, 内质网FBS: Fetal Bovine Serum, 胎牛血清FCM: Flow Cytometry, 流式细胞仪FDA: Food and Drug Administration, 美国食品及药品管理局GFP: Green Fluorescent Protein, 绿
33、色荧光蛋白HIC: Hydrophobic Interaction Chromatography, 疏水相互作用层析HLA: Human Leucocyte Antigen, 人类白细胞抗原HLH: Helix-Loop-Helix, 螺旋环螺旋HPLC: High Performance Liquid Chromatography, 高效液相色谱HPV: Human Papillomavirus, 人乳头瘤病毒HRP: Horseradish Peroxidase, 辣根过氧化物酶HSPG: Heparan Ssulfate Proteoglycan, 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖ICTV: Int
34、ernational Committee on the Taxonomy of Viruses, 国际病毒学分类委员会IFN: Interferon, 干扰素IL: Interleukin, 白介素Kan: Kanamycin, 卡那霉素kD: kilo Daltons, 千道尔顿LC: Langenhans Cell, 朗格汉斯 细胞mAb: monoclonal antibody, 单克隆抗体MD: Molecular Dynamics, 分子动力学NK: Natural Killer, 自然杀伤细胞NLS: Nuclear Location Signal, 核定位信号NMR: Nucle
35、ar Magnetic Resonance, 核磁共振NP: Nucleocapsid, 核壳蛋白ORF: Open Reading Frame, 开放阅读框Ori: Origin, 复制起始位点PDB: Protein Data Bank, 蛋白质数据库pRb: Retinoblastoma Tumor Suppressor Gene, 视网膜母细胞瘤抑制基因PV: Papillomavirus, 乳头瘤病毒RH: Hydrated molecular dynamic Radius, 水化分子动力学半径RNA：Ribonucleic Acid, 核糖核酸RT: Remained Time,
36、保留时间SAS: Solvent Accessible Surface, 溶剂可及化表面积SCID： Severe Combined Immunodeficiency Mice, 严重联合免疫缺陷小鼠SE: Sedementation Equilibrium, 沉降平衡Size Exclusion Chromatography, 高效分子筛层析SV: Sedimentation Velocity, 沉降速度T: Triangulation number, 三角划分数即T 值TEM: Transmission Electron Microscopy, 透射电子显微镜Th：Helper T lym
37、phocyte, 辅助T淋巴细胞URR：Upstream Regulatory Region, 上游调节区Ve: Elution volume of the peotein(s) of interest, 洗脱体积VH: Variable Region of Heavy Chain, 重链可变区VL: Variable Region of Light Chain, 轻链可变区VLP(s): Virus-Like Particle(s), 类病毒颗粒VLP：Virus Like Particle, 类病毒颗粒VLP：Virus-like Particle, 病毒样颗粒WB: Western Bl
38、otting, 蛋白印迹实验WHO: World Health Organization, 世界卫生组织GWs: Gental Warts, 生殖器疣前言1. HPV研究回顾人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）与棉尾兔乳头瘤病毒（cottontail rabbit papillomavirus，CRPV）、牛乳头瘤病毒（bovine papillomavirus, BPV）、犬口腔乳头瘤病毒（canine oral papillomavirus，COPV）等，同属于乳头瘤病毒科（Papillomaviridae），是一类无包膜的小DNA 病毒，主要引起人或动物皮肤
39、粘膜的增生性病变。对于乳头瘤病毒最早的认识始于20世纪初，当时的研究发现，一些含有人或动物疣组织成分的无菌滤过液可以传播疣。但是在此后较长的一段时间内，对于乳头瘤病毒的研究并未引起广泛的兴趣。其主要原因是乳头瘤病毒难以在组织中培养，限制了对其生活周期，致病机理等方面的深入研究，而且人乳头瘤病毒被认为只引起良性病变，其医学意义有限。不过在这期间，通过对棉尾兔动物模型的研究也逐渐积累关于PV病毒感染机制，生活周期的大量资料。随着20世纪70年代分子生物学技术的飞速发展，对于PV的认识不断深入，其与人类疾病的关系也不断被揭示：在1981年和1983年，引起人生殖器粘膜疣的HPV6, HPV11分别被
40、发现1, 2；zur Hausen在1983和1984年成功地从宫颈癌组织中分离出HPV16和HPV18病毒株3, 4，从而阐明了某些型别HPV感染与宫颈癌发生的密切关系。这一发现使得HPV的研究引起了前所未有的重视，更多的研究者进入了HPV研究领域，大量的研究资金也源源不断得投入这一领域，使得该领域有了突飞猛进的发展。而zur Hausen也因为这项突破性的发现获得了2008年诺贝尔生理学或医学奖。1991 年，Frazer等人发现，在体外表达HPV L1蛋白在特定条件下可以自发形成与病毒颗粒结构高度一致的类病毒颗粒（Virus-like particle，VLP），这种类病毒颗粒具有良好的
41、免疫原性，可以诱导中和抗体的产生，是一种理想的HPV疫苗形式。该发现标志着HPV研究从理论积累进入了应用开发的全新领域5。2006年，世界上第一种HPV疫苗Gardasil的上市标志HPV研究上的又一里程碑式的突破。预计在今后很长一段时间内，HPV的研究应然是病毒学研究领域的一大热点。2. HPV的结构2.1. HPV基因组结构HPV的基因组是大小约为8kb双链DNA，其结构如图1所示。其基因组可以分为含有大部分的顺式作用元件，控制早期、晚期基因的表达和病毒组装的长控制区（long control region，LCR）；编码早期非结构蛋白（E1-E8）的早期开放阅读框（open readin
42、g frame,ORF）和编码晚期衣壳蛋白（L1和L2）的晚期开放ORF。所有这些ORF均位于同一条DNA链上，HPV基因组所编码各蛋白的功能见表1。图 1：HPV16基因组结构图6Fig. 1: Scheme of HPV genomic structure2.2. HPV的早期蛋白表 1 ：HPV各蛋白的功能6Tab. 1: Functions of different proteins expressed by HPV基因表达时期细胞定位/数量基因表达产物功能L1晚期细胞核/+主要衣壳蛋白，L2晚期细胞核/+次要衣壳蛋白，辅助DNA包装E1早期细胞核/+辅助游离体复制，DNA解旋酶E2早
43、期细胞核/+转录因子，参与病毒基因组复制E3早期？E4晚期细胞质/+辅助病毒包装E5早期细胞质/+抑制细胞分化E6中期细胞核/+抑制细胞分化促进P53降解E7中期细胞核/+阻止细胞生长停顿/分化，降低E2F抑制因子的活性E8早期？早期蛋白产生于病毒感染的早期，主要调控病毒的复制和转换功能。E1和E2蛋白在人角朊细胞内以附加体的形式存在，共同调节病毒的转录和复制，为启动病毒复制所必需。E1是一个六聚体的解螺旋酶，与细胞的DNA解螺旋酶具有功能和结构的同源性，能在LCR内的E1依赖性的复制起始位点（E1 ori）处结合DNA聚合酶和伸展的DNA，对于早期的病毒基因组复制和基因组在基底上皮层中的维持
44、极为重要7。E2蛋白能调节HPV蛋白的表达，也能增加HPV基因组的遗传稳定性，还作为E6和E7的转录抑制子与LCR作用。如果病毒基因组整合到宿主染色体上后丢失E2基因，对E6和E7的负调控就会终止，将促进宿主细胞的转化。但是目前对于E1,E2的调控机制尚不清楚，可能受细胞的分化状体调控8, 9。E4蛋白的功能目前尚不十分清楚，但是有研究表明，该蛋白可能与病毒颗粒的释放有关。E5、E6和E7三者编码基因均为病毒癌基因，在病毒的生活周期中共同起着重要的作用10。其中，E6蛋白有151个氨基酸组成，分子量约为18kD。该蛋白的主要结构为两个锌指结构，每个锌指结构的基础是Cys-X-X-Cys，为所有
45、HPV型别E6蛋白所共有。E6蛋白转化细胞的机制相当复杂，可以通过多个细胞通路对细胞的生长特性进行调解从而导致细胞永生化。但是，目前研究最深入也是最重要的一条途径就是促进抑癌蛋白P53的降解。E6蛋白可以通过C末端结合P53蛋白，从而促进泛素连接酶E3p，E6相关蛋白（E6AP）对P53蛋白的降解。在上述过程中，E6蛋白与P53的结合是其发挥功能的关键。致癌型与非致癌型HPV的E6蛋白在性质上的差异主要体现在其与P53的结合活性上11。E6蛋白除了可以直接促进P53蛋白降解之外，还可以使得P53蛋白滞留于胞浆，阻止其进入细胞核，从而抑制P53的正常功能。E7蛋白由98个氨基酸组成，分子量约为1
46、8kD，是HPV的重要转化蛋白。在E7蛋白上，具有一段序列为LXCXE的保守结合域。通过该区域，E7蛋白能够与与pRB家族蛋白结合，抑制其活性，从而使细胞进入S期。最近的研究还发现，E7蛋白可以激活钙离子依赖蛋白酶，直接降解pRB12。E5蛋白是一种具有疏水特性的膜结合蛋白，与E6，E7蛋白失活负性细胞周期调节因子不同，其通过上调细胞生长因子受体的活性而发挥作用13。E5与E6,E7蛋白一起，在病毒的生活周期中共同发挥重要作用，并且E5蛋白对于E6/E7蛋白的致癌活性也有增强作用。目前，有多种证据证表明，高危型HPV E6/E7蛋白可以协同作用灭活多种细胞周期调控蛋白，使得细胞生长失去正常调控。这被认为是HPV感染是引发癌症的主要原因。HPV E6/E7蛋白蛋白协同致癌的详细机制见图2。此外，由于HPV E6/E7蛋白在发生癌变的细胞中持续表达，多种宫颈癌的治疗性疫苗均以上述两个蛋白作为靶分子14-16。图2E6，E7在宫颈癌形成中作用11Fig.2 The roles of E6, E7 in the development of cervical cancer
