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1、文献综述植物组织培养褐化控制研究进展 摘 要：褐化是植物组织培养过程中产生的一种常见的不利现象，是近几年植物组培方面的研究热点之一。结合国内外新研究进展，论述了褐化现象并对其产生的主要机理和影响褐化的因素并综合提出控制褐化的有关措施。外植体发生褐化的基本机理包括酶促褐化和非酶促褐化。酶促褐化的主要原因是参与褐化反应的酚类物质、酚氧化酶和氧相互作用毒害外植体；影响褐化有生物因素、培养基种类和成分、培养条件等多方面因素；可通过控制相关的生物因素、培养基种类和成分，以及添加一定的吸附剂或抗褐化剂达到减轻褐化的效果。关键词：植物组织培养；褐化；控制措施；进展在珍稀植物组织培养研究中，会发现一些外植体或
2、培养物的褐化、枯死现象，这种褐化现象又被称为褐变1。褐化是植物组织培养过程中产生的一种较为常见的现象，在植物组织培养、细胞悬浮培养和原生质体培养中常有发生2，它对诱导外植体的脱分化和再分化有重大影响，甚至对一些植物组织培养能否取得成功起到决定性作用。对这一问题，国内外文献均有报道。本文就有关褐化现象的机理、影响褐化的因素及控制揭化的措施等研究进展作概述。1. 褐化现象的机理1.1 非酶促褐化非酶促褐化是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响造成的细胞死亡，即坏死形成的褐化现象，并不涉及酚类物质的产生。许多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境这种褐化就不再发生3
3、-6。1.2 酶促褐化1.2.1 化与酚类物质及其合成代谢酶活性的关系研究当外植体组织被切割后，切口附近的细胞受到伤害时，酚、酶的分隔效应被打破，细胞内酚类化合物向外分泌、酚氧化酶释放或合成。在合适的pH、温度等条件下，在酚氧化酶的作用下，酚类物质(底物)和氧气发生氧化反应，形成褐色醌类物质，这使切面迅速变成棕褐色或暗褐色。这种褐色物逐渐在培养基中扩散，抑制其它酶的活性，毒害整个外植体组织，外植体随之进一步变褐而最终死亡，这种有酚氧化酶参与的褐化现象又被称为酚污染7-11。酚污染对诱导外植体的脱分化和培养物的再分化产生严重影响，以至对某些植物的组织培养能否取得成功起决定性的作用，尤其是木本植物
4、组织的外植体褐化死亡是培养难度较大的主要因素12。1.2.2 褐化与活性氧清除机制的关系研究当外植体组织被切割后，切口附近的细胞受到伤害使酶与底物的细胞间隔被打破时，可诱发活性氧(ROS)迅速过量产生。过剩的ROS对植物组织造成氧化胁迫，导致膜脂过氧化，其产物丙二醛(MDA) 的积累会对细胞膜造成进一步的伤害。植物细胞的抗氧化系统由抗氧化酶系统(如SOD、CAT、GPX、APX、GR等)和抗氧化小分子物质(AsA和GSH)组成。抗氧化系统的启动对于清除过剩的ROS，抑制膜脂过氧化，维持膜系统的稳定,进而控制褐化的发生起到至关重要的作用13。罗建平等14研究发现在培养基中加入AsA可显著提高SO
5、D和APX活性，减轻膜脂过氧化,从而减轻沙打旺原生质体的褐化。1.3 酶促褐化与非酶促褐化的关系张影陆等15在研究中发现酶促氧化反应速率约是非酶促氧化速率的的800倍，酶促褐化程度(1.5731/120 min)也远大于非酶促褐化(0.4742/316 h)酶促褐化。因此，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐化引起的，即由酚氧化酶（PPO和POD）或酪氨酸酶等作用于天然底物酚类物质而引起的16-17。2. 褐化的研究历史及现状2.1. 褐化的影响因素研究2.1.1. 外植体的选择外植体的选择直接关系到褐化的产生和褐化率的高低，影响因素分别有外植体大小、木本植物的木质化程度、年龄、取材季节和取
6、材部位等。一般认为选择生长旺盛的组织或器官作为外植体，这样的外植体有很强的分生能力，抵抗褐化的能力强18。Bonga19认为外植体越小，切面表面积与体积的比率越大，伤害及褐化的程度就越大。王小敏等20对黑莓不同年龄外植体进行研究时发现褐化程度与外植体的木质化程度及取材部位均有一定的关系，选择处于旺盛生长状态的1年生半木质化枝条的上部茎段作为外植体，可大大减轻黑莓外植体的褐化程度，降低褐化率。杨海芸等21以不同叶龄的叶片为外植体接种后发现：取叶龄45 d的试管苗为外植体，组培褐化最轻，30 d次之，60 d褐化最重。蔡建荣22利用山药不同外植体进行组织培养时，其褐化的程度也不同。当外植体为含节问
7、的茎段时，其褐化程度最轻，当外植体为切成小方块的零余子时，褐化现象最严重，叶片的褐化程度居中。2.1.2. 培养基和生长调节剂的选择不同基本培养基和不同生长调节剂配比都会影响外植体的褐化情况。陈之林等23发现，用含30 g/L蔗糖的MS培养基接种的蝴蝶兰花葶切片褐化较严重，部分外植体生长停滞，并逐渐坏死；而将MS培养基中的蔗糖浓度降至为15 g/L时,外植体褐化程度减轻，诱导率显著升高。而刘兰英24在“薄壳香”核桃的组培快繁过程中，高温、较高浓度的细胞分裂素和较高浓度的无机盐都会促进褐化的发生；王小敏等20对黑莓在不同培养基上培养研究发现在供试的6种基本培养基(MS、1/2MS、B5、1/2
8、B5、N6和1/2 N6)中，在MS、B5和N6三种基本培养基上黑莓外植体的褐化率均高于各自的1/2培养基。由于MS培养基的总盐浓度相对低于B5和N6培养基，在MS培养基上外植体的褐化率较低(37.78)、腋芽诱导率最高(67.89)且生长状况良好。因此，使用MS基本培养基可减轻黑莓外植体的褐化。由此可知，组培中不同植物所适宜的褐化率最低的培养基配方并不相同，目前并没有找到适合绝大部分植物降低褐化率的培养基配方，但相对低浓度的无机盐和蔗糖浓度对降低褐化率有一定效果。2.1.3. 培养条件的调整不同的培养条件也能明显影响一些植物的褐化率如光照、温度、pH和有无转瓶等。王小敏等20培养过程中的光照
9、度与外植体褐化也有一定的关系，在1500 lx光照度下外植体的褐化率较低(15.66)且腋芽诱导率和生长状况均较好。杨海芸21适当时期的暗培养有利于不定芽的发生，暗培养1430 d，叶片不定芽诱导率和分化系数显著高于其他处理，以暗培养21 d诱导率和分化系数最高，分别为74.5%和6.86。许传俊25研究光照强度对外植体褐化影响时发现随着光照的加强蝴蝶兰外植体褐化加重 而黑暗培养的外植体褐化较轻。因此，易褐化的材料在初代培养时 先进行暗培养可以获得较好的效果。赵伶俐等26对蝴蝶兰R4品种进行研究发现培养基pH 5.6或培养温度20时外植体褐化率最低。在相同温度（25 ）下，PPO活性、总酚含量
10、高低并不与pH值大小成正比，且褐化率与PPO无显著相关性，pH为5.0时，褐化率与总酚含量显著相关；在相同pH（6.0）下，温度越高，褐化率越高， PPO活性越强，总酚含量越高，且20 下，褐化率与PPO、总酚含量分别达到极显著显著相关，在30 下，褐化率与总酚含量显著相关。黄燕芬27外植体表面消毒时间、切割方式、转瓶问隔时闻、培养基类型、激素配比、抗褐化剂和吸附剂的使用方面进行了综合试验。结果表明：表面消毒最适时间为7-8 min；接种外植体带腋芽叶片保留2/5，3 d转瓶1次降低褐化的效果较好。2.2. 褐化控制的措施研究2.2.1. 抗褐化剂的应用植物组培中用于抑制褐化常用的抗氧化剂有：
11、抗坏血酸(Vitamin C)、硫代硫酸钠(Na2S2O3)，此外还有柠檬酸、谷胱甘肽、芸香苷、二硫苏糖醇、酪氨酸、巯基乙醇、卵清蛋白、维生素B、维生素E、有机酸、蛋白质水解产物、氨基酸、亚硫氢酸钠、氰化钾、多胺等4。吕宗友28研究不同防褐化措施对苏丹草愈伤诱导的影响及抗褐化的效果表明Vc、PVP和AgNO3均能不同程度地提高愈伤诱导率和降低褐化率，柠檬酸能提高愈伤诱导率但不能防止褐化。王颖29在研究烟草愈伤组织褐化现象时发现在愈伤组织的继代培养中，PVP对愈伤组织褐化抑制效果最好的浓度是2 g/L，褐化率为35；柠檬酸对愈伤组织褐化抑制效果最好的浓度是8 mg/L，褐化率为25；在愈伤组织继
12、代培养中可以用8 mg/L柠檬酸抑制外植体的褐化。由此可知，不同的抗褐化剂对不同外植体作用效果有差异，不同浓度的抗褐化剂对外植体的抗褐化效果也有差别。2.2.2. 吸附剂的应用一般用于植物组培用的吸附剂有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(AC)等。张俊琦30认为吸附剂PVP和结冷胶（Phytagel）能够有效地缓解褐化。马文卿31研究大花蕙兰组培苗增殖时发现添加活性炭的效果最好，添加1500 mg/L活性炭，使褐化得到很好的控制，并使得试管苗生长旺盛，保持较高的增殖系数。李萍等32研究牡丹组培时发现活性炭能有效控制褐化，但长时间处理会抑制组培苗的生长和增殖；继代培养初期在含活性炭2.0 g/L
13、的培养基中进行4 d短期处理，不仅能有效控制褐化，还在一定程度上促进了组培苗的生长和增殖。但刘均利等33发现吸附剂在吸收酚类物质过程中，也可能吸附培养基中的有益成分，使外植体生长受到影响，甚至发生毒害作用。3. 褐化控制研究的展望到目前为止，组织培养过程中的褐化现象研究已经历几十年，积累了大量的资料，但我们还是不能确切地阐述组织培养褐化的机理。通过对褐化现象研究状况的回顾和了解，我们可以得到以下共识：组织培养褐化主要是酚类物质被氧化的结果，其中PPO和POD能促进褐化的发生；此外也有些为非酶促褐化。褐化的发生往往是多种因素同时作用的结果：内因包括外植体材料的生理状态、基因型、生长环境、营养状况
14、、生长部位和年龄等；外因包括培养基的成分、外加激素的种类含量及比例、吸附剂、抗褐化剂、有无热激处理34、培养条件(温度、pH、光照时间、光照强度、通气状况等)等也会影响褐化的发生35。在导致褐化的诸多因素中，膜结构的破坏或细胞中物质区域化分布的破坏是酚类物质的酶促氧化和组织发生褐化的关键。因此，未来的发展方向应是深入了解有关机制，从理论上认识植物组织褐化，找到影响褐化主导因子和克服褐化的有效方法，并进行实践从而防止褐化的发生。这对促进组培技术的日臻完善，具有重要的理论和现实意义。参考文献1 周俊辉, 周家容, 曾浩森, 等. 园艺植物组织培养中的褐化现象及抗褐化研究进展J. 园艺学报, 200
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