毕业设计（论文）樟树籽蛋白质的提取与分析.doc

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1、武夷学院毕业设计(论文)樟树籽蛋白质的提取与分析院 系 ：武夷学院专业（班级）：生物技术及应用姓名：学号:指导教师：职称：讲师完成日期：2011 年 6 月 3日武夷学院教务处制樟树籽蛋白质的提取与分析摘要：植物蛋白的提取方法有等电点法 、离子交换法 及超滤法、乙醇沉淀蛋白法等 本实验采用了乙醇沉淀蛋白,其优点是避免蛋白质变性 ,尽可能减少杂质。本实验采用磷酸盐缓冲液溶解蛋白质再用乙醇为脱水剂破坏蛋白质胶体质点的水化层，使其沉淀析出进而对樟树籽蛋白进行提取,并用紫外光吸收法测定蛋白质的浓度,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量，对樟树籽蛋白进行分析关键词：樟树籽，蛋白质，提取，

2、分析目录1 前言11.1 樟树籽简介11.2油类作物蛋白提取方法11.2.1水相萃取法21.2.2有机相萃取法21.2.3水相酶解法21.3 蛋白质分析检测方法31.3.1 Folin-酚试剂法(Lowry法)31.3.2紫外吸收法32 材料和方法32.1材料32.1.1实验材料32.1.2试剂32.2 器材42.3 实验方法42.3.1 提取方法42.3.2 蛋白质分离方法52.3.3蛋白质的定性52.3.4蛋白质的等电点62.3.5紫外光吸收法测定蛋白质浓度62.3.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质的分子量测定73 结果与讨论93.1 前处理93.2 蛋白质的提取93.3 SDS聚丙烯

3、酰胺凝胶电泳法104结论11参考文献11致谢131 前言1.1 樟树籽简介樟树属樟科( Lauraceae)植物 ,是一种生长在亚热带地区四季常青的树种 ,在我国长江以南地区及台湾省有大量种植。樟树籽 ,又名樟犁、香樟子、大木姜子、樟子等，其氨基酸含量丰富 ,品质优良 ,但是、目前 ,樟树籽除极少量被采摘入药外 ,大部分均自生自灭 ,没有被很好地利用.由于食物资源供需矛盾的日益突出 ,开发利用新的蛋白质资源已成当务之急 ,尤其是植物性蛋白质源的开发利用已成为世界各国解决食物资源匮乏的重要突破口.大豆蛋白、 花生蛋白的应用已日趋普遍 ,但对樟树籽蛋白的利用还没有引起足够的重视，樟树( Cinna

4、momum Camphora)是樟科属的常绿乔木植物 ,高2030 m。主要生长在热带和亚热带地区 ,全世界有 45 个属约2 500余种 ,在我国有约 20 个属近 430 种 ,其中我国特有的有 355 余种 ,樟树是我国特产珍贵木材和经济林树种 ,被誉为江南宝树。樟树 34 月开花 ,花小呈绿色或淡黄色 ,长大约 2 mm ,花被 6 裂 ,椭圆形。花期能散发出淡淡的清香 ,这段时期大约一周至半月左右。每年 1012 月樟树籽基本成熟 ,但这时的樟树籽很少自行脱落 ,其果皮依然是与叶面相同的绿色。再往后果皮的颜色逐渐加深 ,到第二年 12 月樟树籽果皮已由绿色逐渐变成棕黑色或黑色。樟树是

5、樟科属的常绿乔木植物中经济价值最大的树种之一 ,是天然樟脑、芳香油、油脂、优质木材、医药等类的重要资源 ,其木材、根、叶、果实皆含精油 ,以往主要是对根、茎、叶进行利用与加工 ,近年来对樟树籽的利用研究增多 ,发现其核仁含脂肪油 ,含油率高达40 %以上。油脂中脂肪酸组成以 C10、 C12脂肪酸为主 ,占 90 %左右。樟树籽 ,又名樟梨、香樟大木姜子、樟子等。成熟的樟树籽呈扁球形 ,直径大约59mm ,每千粒重大约是 200 g,果皮肉质薄 ,能散发出芬芳的清香。我国很早就将樟树籽作为药物用于治病 ,并认为樟树籽有驱风散寒、行气止痛之功效。癸酸(C10)已应用于医药行业合成鱼腥草素等消炎药

6、 ,主要含有癸酸(C10)的樟树籽脂肪油已被试制成碳酸甘油脂 ,用于治疗脂肪代谢紊乱病症 ,并能降血脂及胆固醇。1.2油类作物蛋白提取方法油类作物蛋白营养价值和功能特性已被广泛接受，但国内外仍没有工业化产品。由于油类中抗营养因子的存在，过去很长一段时间内，油脂工业只注重油类作物榨油，忽略了油类作物蛋白的利用，造成植物蛋白资源的浪费。当今世界蛋白资源供求日趋紧张，所以，各国学者们开始转向油类作物蛋白的研究。目前，从油类作物中提取蛋白质的方法主要有以下几种。1.2.1水相萃取法水相萃取法是采用不同水相将菜籽蛋白提取，再分离(常用等电点法)，得到菜籽分离蛋白或者是通过水相将菜籽饼粕中硫苷、植酸、可溶

7、性糖等非蛋白组分溶出，获得菜籽浓缩蛋白的方法。常用的水相有：水、稀酸、稀碱、NaCl溶液、六偏磷酸钠溶液等。刘大川等人(2005年)以脱皮脱脂双低菜籽粕为原料，在pH值11，同液比1：12，浸提温度50下，用NaOH溶液浸提4次，每次35 min，得到产品的蛋白含量8612，蛋白得率2435。金晶等人(2009年)选用双低菜籽粕为原料，采用超声微波辅助水相法，在超声频率40 kHz，功率50 w，微波功率73 w，料液比1：28，时间8 min下，提取3次，获得蛋白含量为8365的产品，蛋白得率3876。水相萃取法工艺简单、成本低，但蛋白得率不高，易污染环境。蛋白得率偏低的主要原冈是菜籽蛋白组

8、成复杂，相对分子量差异大，使得菜籽蛋白溶解曲线不能形成“U”型，而出现2个或多个等电点区域。1.2.2有机相萃取法采用醇、酮等有机溶剂提取菜籽饼粕中植酸、多酚、残油、色素等组分，制取菜籽浓缩蛋白的方法。曾晓波等人(2001年)以双低脱壳菜籽饼粕为原料，采用丙酮浸提法，在丙酮体积分数为78。85，NaCI质量分数为7，pH值为4.0下提取，所得浓缩蛋白的蛋白质质量分数为70，产品色浅味淡，功能性质较好，可用作食品添加剂。金青哲等人(2006年)I以双低菜籽为材料，采用超声波辅助乙醇浸提法，在超声频率20 kHz，功率100 kW，乙醇体积分数为70，液同比35：1的条件下，提取3次，每次20 m

9、in，所得浓缩蛋白蛋白质量分数大于60，氨基酸平衡，硫苷、植酸、单宁等抗营养因子含量低。有机相萃取法具有产品色泽好，脱毒率高等优点，但工艺复杂，成本高，易引起蛋白变性，影响蛋白营养效价。1.2.3水相酶解法水相酶解法是在水相萃取法基础上，增加了酶水解过程，以提高菜籽蛋白收率和品质的方法。常用的酶有：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶等。刘志强等人(2004年)旧以双低油菜籽为原料，采用水相酶解法，并用纤维素酶和果胶酶复合酶(质量比为3：1)作为酶制剂，在固液比l：5，酶用量30 U/g下，酶解100 min，再经超滤分离菜籽蛋白，经干燥所得

10、产品蛋白得率达823。产品安全性能良好，异硫氰酸酯和嘿唑硫烷酮均未检出。张霜玉等人(2009年)以“中双7号”脱皮油菜籽为材料，采用水相酶解法，在料液比为l：5，加酶量为2，pH值38，50下酶解4 h，所得水解蛋白产品的得率为8250。水相酶解法有利于蛋白溶出，提高了蛋白得率，改善了蛋白功能特性，减轻饼粕中抗营养冈子对人体及动物的毒害作用，同时具有降低残油率，增加蛋白产品保藏性能等优点，但该法存在蛋白水解后产生苦味的问题。1.3 蛋白质分析检测方法1.3.1 Folin-酚试剂法(Lowry法)蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在

11、碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二步：蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25-100g）在500nm波长处进行测定，含量低时(5-25g)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5g即

12、可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。1.3.2紫外吸收法大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。2 材料和方法2.1材料2.1.1实验材料樟树籽干燥 70摄氏度 24小时，备用。2.1.2试剂 石油醚（C.P.，沸程3060），磷酸氢二钠（分析纯 AR），磷酸二氢钠（分析纯 AR）， 氯化钠

13、（分析纯 AR），95%乙醇（分析纯 AR），Tris （分析纯 AR），浓盐酸（分析纯 AR） ，SDS（分析纯 AR），甘油（分析纯 AR），溴酚蓝（分析纯 AR），-丙烯酰胺（分析纯 AR），巯基乙醇（分析纯 AR），甲醇（分析纯 AR），考马斯亮蓝R-250（分析纯 AR），冰醋酸（分析纯 AR）2.2 器材FZ102型植物粉碎机，索氏提取器，离心机，紫外分光光度计，垂直电泳槽，电泳仪，微型凝胶电泳装置（宁波宏耀电泳科技有限公司）；水浴锅；Eppendorf管；微量注射器（50l或100l）。2.3 实验方法2.3.1 提取方法1) 将样品在80100电热鼓风干燥箱内烘去水分，一般烘4

14、h，烘干时要避免过热。样品颗粒不宜太大，一般要在研钵中研碎样品。 2) 准备工作：将恒温水浴锅的水温事先加热（80）。务必保证提取管和烧瓶内干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120烘干。 3) 折滤纸斗：取一张11cm的滤纸，折成筒状，再将其一端折起来封死，便做成了滤纸斗。4) 称样：先将数粒樟树籽在碾钵中用碾锤彻底捣碎作为实验样品。参照实验设备和器材，将滤纸斗在电子天平上称重，然后用药勺取10g样品装入滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死；防止样品泄出滤纸斗。调整滤纸斗的高度，使其放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处。将装好样品的滤纸斗放在电子天平上称重，两质量之差即为样品的质量。 5

15、) 提取：首先安装好烧瓶，并调整其高度，使其刚好能浸入水浴锅中的水中。将装置6) 从水浴锅的水中取出，继续安装提取管，把装有样品的滤纸斗放入提取管内，向提取管中缓缓倒入石油醚直至液面达到虹吸管上弯头部，正好虹吸一次；再向提取管中倒入石油醚，使其液面达到第一次液面的一半。用乳胶管将冷凝管与自来水管相连，将冷凝管安装到提取管上，检查一下，确保所有接口均对接完好（不漏气，不打滑）。轻轻打开自来水（冷凝用），将索氏提取仪整个装置放入恒温水浴锅中加热提取（水温80左右），请观看软件中的视频索氏提取仪的安装。提取时间22h，约虹吸10次以上，记录每次虹吸所需的时间和虹吸次数。附注：若要将样品的粗脂提取完全

16、，提取时间至少为12h以上。由于实验时间的限制，我们的提取率只能达到80左右。 7) 回收石油醚：提取2h后，当石油醚在提取管中的液面即将达到虹吸管的上弯头处时，从水浴锅中取出索氏提取仪装置，室温冷却510min；取下平底烧瓶，将提取管的下端口插入回收瓶中，倾斜装置，提取管中的石油醚会虹吸而流入回收瓶中，达到回收的目的。再装上平底烧瓶，继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴下，表明平底烧瓶中的石油醚已经蒸干。注意：必须蒸干后才能放入干燥箱烘干，否则会引起火灾。取下平底烧瓶，回收提取管中的石油醚8) 称量粗脂质量：将平底烧瓶放入120的电热鼓风干燥箱中烘15min，取出冷却后称重（须戴

17、手套，以免烫伤）。再将平底烧瓶用洗涤剂洗净，于120的电热鼓风干燥箱中烘干（约15min），取出冷却后称重，两者的质量之差就是粗脂的质量。 9) 计算 样品粗脂的含量（%）=（粗脂的质量/样品的质量）*100% 10) 将上述去脂烘干的样品置于烧杯中，加入ph为7.2的磷酸盐缓冲夜100ml浸提2h2.3.2 蛋白质分离方法将浸提液均匀倒入两个离心管使两管质量相同，对称放入离心机中，调整离心机4000转 5分钟，将上清液倾入烧杯，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%的乙醇100ml混匀。观察有无沉淀析出将所得溶液离心，获得沉淀，用1% NaCl溶液溶解定容于250m

18、l容量瓶中，备用。2.3.3蛋白质的定性蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质的所含氨基酸不完全相同，颜色反应也不同。颜色反应时一些常用的蛋白质定量测定的依据2.3.3.1黄色反应蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（酪氨酸、色氨酸）。遇到硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝基衍生物。取一试管，置所提取的蛋白质溶液10滴及浓硝酸34滴，加热，冷却后再10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化,2.3.3.2茚三酮反应 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三

19、酮分于和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜pH为57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。操作方法： (1)取1支试管加入蛋白质溶液1毫升，再加0.5毫升0.1茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热12分钟，观察颜色 (2)在一小块滤纸上滴一滴0.5的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察2.3.4蛋白质的等电点在等电点时，其溶解度最小。可调节蛋白溶液的pH值使其达到蛋白质的等电点，获得蛋白沉淀。实验步骤： 取同样规格的试营4支,向以上试管中各加样品蛋白的醋酸钠溶液1毫升,加一管,摇句一管.此时1,2,3,4管的pH

20、值依次为1,3,5,7观察其混浊度.静置10分钟后,再观察其混浊度.最混浊的一管的pH即为样品蛋白的等电点. 2.3.5紫外光吸收法测定蛋白质浓度蛋白质组成中长含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质的含量。由于核酸在280nm波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处。如同时测定260nm的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。操作步骤在紫外

21、分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得280nm和260nm两种波长的吸光度（A280nm及A260nm）。将A280nm及A260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。C = 1.45A280nm 0.74A260nm式中C：蛋白质质量浓度（mg/ml）；A280nm：蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度；A260nm：蛋白质溶液在260nm处测得的吸光本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂的情况，这时用其他方法测定往往较困难。为方便起见对于混合蛋白质溶液，可用A280nm乘以0.75来代表其中蛋白质的大致含量（mg/

22、ml）。2.3.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质的分子量测定2.3.6.1.实验试剂配制 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。 10% (w/v) SDS: 取10g的SDS，加蒸馏水至100ml。 50% (v/v) 甘油: 取50ml 100%甘油，

23、加入50ml蒸馏水。 1% (w/v) 溴酚蓝:取100mg溴酚蓝，加蒸馏水至10ml，搅拌,直到完全溶解，过滤除去聚合的染料。 A液-丙烯酰胺储备液（配制含30% (w/v) 丙烯酰胺和0.8% (w/v) 甲叉双丙烯酰胺的溶液100ml）在通风柜中操作，取29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水至100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉末完全溶解，用石蜡膜封口，可在4存放数月。 B液-4分离胶缓冲液：取75ml 2mol/L Tris-HCl (pH8.8)，加入4ml 10% SDS, 加21ml蒸馏水，混匀，可在4存放数月。 C液-4浓缩胶缓冲液:取50ml 1mol/L Tri

24、s-HCl (pH6.8)，加入4ml 10% SDS, 加46ml蒸馏水，混匀，可在4存放数月。 10%过硫酸铵：取0.5g过硫酸铵，加入5ml蒸馏水，可保存在密封的管内，于4存放数月。 电泳缓冲液：取3g Tris，14.4g甘氨酸，1g SDS，加蒸馏水至1L, pH约为8.3, 也可配制成10的储备液，在室温下长期保存。 5样品缓冲液：取0.6ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入2ml 10% SDS, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml的蒸馏水混匀，可在4保存数周，或在-20保存数月。 考马斯亮蓝染液：1.0g 考马斯

25、亮蓝R-250，加入450ml甲醇，450ml蒸馏水及100ml冰醋酸即成。 考马斯亮蓝脱色液：将100ml甲醇，100ml冰醋酸，800ml蒸馏水混匀备用。2.3.6.2.灌制分离胶 组装凝胶模具: 可按照使用说明书装配好灌胶用的模具。对于Bio-Rad的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与一个平滑的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。 将A液、B液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺(A液中)是神经毒素，操作时必须戴手套。加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会聚合，操作要迅速。小心将凝胶溶液用吸管

26、沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。 当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm)，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1mm5mm的水层，这使凝胶表面变得平整。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面。2.3.6.3.灌制浓缩胶 吸尽覆盖在分离胶上的水后将A液、C液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管中混合。加入过硫酸铵和TEMED，并轻轻搅拌使其混匀。 将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以

27、减少气泡的产生。 凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。将电泳缓冲液加入内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。2.3.6.4.制备样品和上样 将蛋白质样品与5x样品缓冲液(20l+5l)在一个Eppendorf管中混合。100加热2 min10min。离心1s，如果有大量蛋白质碎片则应延长离心时间。 用微量注射器将样品加入样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部，并随着染料水平的升高而升高注射器针头。避免带入气泡，气泡易使样品混入到相邻的加样孔中。2.3.6.5.电泳 将电极插头与适当的电极相接。电流流向阳极。将电压调至200V（保持恒压；对于两块0.75mm的胶来说，电流开始时

28、为100mA，在电泳结束时应为60mA；对于两块1.5mm的胶来说，开始时应为110mA，结束时应为80mA。）。 对于两块0.75mm的凝胶，染料的前沿迁移至凝胶的底部约需3040分钟(1.5mm的凝胶则需40 min50min)。关闭电源,从电极上拔掉电极插头,取出凝胶玻璃板,小心移动两玻璃板之间的隔片，将其插入两块玻璃板的一角。轻轻撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上。2.3.6.6.考马斯亮蓝染色这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为0.1g的蛋白。通常可以根据所需要的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。 戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上，将凝胶移入一个小的盛有少量考马

29、斯亮蓝(20ml已经足够)的容器内(小心不要将胶撕破)。或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落。 对于0.75mm的凝胶，可在摇床上缓慢震荡5分钟l0分钟，对于1.5mm的凝胶，则需10分钟20分钟，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭容器口。弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。 加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。根据凝胶中标准品与待测样品的相对迁移率判断待测样品的大致分子量。 3 结果与讨论3.1 前处理 粉碎后用烘箱对樟树籽进行干燥时，

30、粉末热时湿度较大冷时结冻成固态，可以体现樟树籽中油脂含量较高，称量樟树籽10.002g索氏抽提得到蛋白和淀粉的混合物重7.623g，计算油脂的含量粗脂的含量（%）=2.377/10.002*100%=23.765%3.2 蛋白质的提取 植物蛋白的提取方法有等电点法 、离子交换法 及超滤法、乙醇沉淀蛋白法等 本实验采用了乙醇沉淀蛋白,其优点是避免蛋白质变性 ,尽可能减少杂质。本实验采用磷酸盐缓冲液溶解蛋白质再用乙醇为脱水剂破坏蛋白质胶体质点的水化层，使其沉淀析出进而对樟树籽蛋白进行提取，提取效果好，提取率蛋白质的颜色反应是检验蛋白质方法简单方便，提取的物质在黄色反应中呈黄，茚三酮反应呈紫红色，充

31、分证明所提取的物质为蛋白质。根据蛋白质等电点的测定最终测定蛋白质的在PH为1时沉淀最为明显,所以提取的该蛋白质的等电点为1蛋白质浓度测定方法有双缩尿法、福林酚试剂测定法、考马斯亮蓝结合法、紫外光吸收法测定蛋白质浓度本法采用紫外光吸收法测定蛋白质浓度方法简单方便测得蛋白质的浓度：计算结果: C = 1.45A280nm 0.74A260nm=3.177mgml3.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法经过电泳操作得到出产品的图谱，分离胶的浓度为7.5%，浓缩胶的浓度为5%。样品1样品2图1 电泳图谱（7.5%分离胶，5%浓缩胶）从图中可以看出，当分离胶的浓度采用7.5%时，分离效果比较差，而且泳道中蛋白

32、样品有拖尾现象，因此调整分离胶的浓度。样品1样品2样品1样品2图2 电泳图谱（10%分离胶，5%浓缩胶）从图2可看出，样品1和样品2中蛋白质组分得到较好的分离，出现比较明显的条带，中间所加标准品的量太少，没有显示出条带。从这次的实验结果可知，樟树籽中蛋白质的分子量大约在30200 kdal之间。4结论通过实验可以得到以下结论：1) 通过对樟树籽脱脂，然后采用稀盐溶液所得产品通过茚三酮反应证明是蛋白质，采用醇溶法提取的产品也用该方法证明是蛋白质。提取的蛋白质浓度分别为：1 3 5 7 9 11 13 ，等电点为1。2) 经过初步的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，结果表明提取所得蛋白质的相对分子质

33、量大约在30200kdal范围内。参考文献1 李建武.生物化学试验原理和方法M .北京:北京大学出版社,1994.2 李刚.生物化学，北京： 科学技术文献出版社，2010.3 陈钧辉. 生物化学实验（第三版）.科学出版社，2002. 4 李娜，杨涛我国油菜籽产业发展现状及趋势展望J农业展攀，2009(2)：19-215 韩喜秋我国油菜生产现状、问题及对策J现代农业，2003(12)：34-356 章绍兵，王璋水酶法从菜籽中提取油及水解蛋白的研究Jl农业工程学报，2007，23(9)：213-2187 陈刚，彭建菜籽饼粕抗营养因子研究进展J畜禽lZ业，2001(1)：14-168 杨国燕，陈栋梁

34、菜籽分离蛋白及菜籽蛋白肽的功能特性研究J食品科学，2007，28(1)：76-789 何忠效.电泳M.143-155,科学出版社,1990年10 Galati EM, Monforte MT, Kirjavainen S, Forestieri AM, Trovato A, Tripodo MM (November 1994). Biological effects of hesperidin, a citrus flavonoid. (Note I): antiinflammatory and analgesic activity. Farmaco 40 (11): 70912. 11 Lo

35、scalzo LM, Wasowski C, Paladini AC, Marder M (February 2008). Opioid receptors are involved in the sedative and antinociceptive effects of hesperidin as well as in its potentiation with benzodiazepines. Eur. J. Pharmacol. 580 (3): 30613.12 王车礼，史美仁. 菜籽粕脱毒提取菜籽蛋白研究进展J . 中国油脂，1997，22（2）：36- 40.13 秦刚，周锦兰

36、. 菜籽饼双液相萃取脱毒J . 饲料工业，2005，26（23）：23- 28.14 Gillberg， Tonell. Removal of Phytic acid Protein PhyticAcid Internations in Rapeseed J . Agric. Food - chem，1984，32：38- 40.15 何国菊，李学刚，赵海伶. 菜籽饼粕中植酸新提取方法研究 J . 中国粮油学报，2004，19 （1）：58- 60.16 王车礼，史美仁. 菜籽粕脱毒与菜籽浓缩蛋白制取 J .中国油脂，1997，12（ 2 ） ：56- 58.17 Elzbieta Dtuze

37、wska， Stanistaw Gwiazda， KrzysztofLeszczynski. Influence of membrane processing on functionalproperties of rapeseed protein preparations J . Polish18 Journal of Food and Nutrition Sciences，2000，50（2）：35- 39.致谢本课题在选题及研究过程中得到李卫林老师的悉心指导，并帮助我开拓研究思路，让我学到了对于科学实验严谨态度。大学时光虽然仅历时三载，却使我终生受益。感谢马森老师、李碧婵老师、贾晓丽老师、

38、张剑老师、刘金仙老师等对我的教育培养和精心教导。同时也感谢学院为我提供良好的做毕业论文的环境。最后再一次感谢在毕业论文中曾经帮助过我的所有老师和同学，以及在设计中被我引用或参考的论著的作者。武夷学院毕业设计（论文）任务书 2008 届 茶学与生物 系 生物技术及应用 专业（班级）学生姓名林开鹏学 号20082501015课题名称樟树籽蛋白质的提取与分析一、毕业设计（论文）的主要任务1.搜集资料（不得少于10篇），准备资料2.试探性实验3.资料整理分析、论文撰写.撰写论文，论文要求5000字以上，要求内容正确，论证严密合理，层次清楚。二、毕业设计（论文）的要求（含成果反映形式）1. 查阅资料不得

39、少于10篇2. 论文要求5000字以上，要求内容正确，论证严密合理，层次清楚三、进度计划及指导安排2011年5月05日2011年5月12日 搜集资料2011年5月12日2011年5月31日 资料删选，实验2011年6月1日2011年6月5日 整理资料、论文撰写任务书审定日期： 2011 年 6月 5 日 指导教师（签字）李卫林 任务书批准日期： 2011 年 5 月 5 日 教研室主任（签字） 任务书下达日期： 2011 年 5 月 5 日 学 生 （签字） 注：本表在所报课题审查批准后由指导教师填写（A4纸双面打印一式两份），经教研室主任审阅签字，一份下达给学生，一份交院系备查。武夷学院本科

40、毕业设计（论文）开题报告学生姓名林开鹏专业（班级）08生物技术及应用课题名称樟树籽蛋白质的提取与分析一、本课题的研究背景、意义，在国内外的研究现状和发展趋势，尚待研究的问题二、完成任务的研究思路和方案三、需要的主要仪器和设备等四、 课题工作的总体安排及进度 2011年5月05日2011年5月12日 搜集资料2011年5月12日2011年5月31日 资料删选，实验2011年6月1日2011年6月5日 整理资料、论文撰写五、指导教师评语 指导教师签名： 2011 年 月 日六、院系意见： 院系（盖章） 年 月 日说明：开题报告应在教师指导下由学生独立撰写。在毕业论文（毕业设计）开始二周内完成，交指

41、导教师审阅，并接受学校和院系检查。武夷学院毕业设计（论文）中期检查表武夷学院毕业设计 (论文)指导教师评分表 茶学与生物 系 2008 届 生物技术及应用 专业、班级学生姓名林开鹏学 号20082501015课题名称樟树籽蛋白质的提取与分析指导教师评语：指导教师（签名）： 2011 年 6 月 8 日 可否提交小组答辩 评定成绩（按50%折合后计入）注：1、本表用钢笔填写（字迹须清晰）或电脑打印，要求在在答辩前完成并交给答辩小组组长；答辩工作结束后由答辩小组组长交系里汇总，装入学生的毕业设计（论文）袋。2、各院系可根据本参考标准制定适合本院系专业特点的评分细则，报教务处备案。武夷学院毕业设计

42、(论文)评阅登记表 茶学与生物 系 2008 届 生物技术及应用 专业（班级）学生姓名林开鹏学 号20082501015课题名称樟树籽蛋白质的提取与分析评阅教师姓名职称评阅教师评定成绩（按20%折合后填入）得分18评阅教师评语：评阅教师（签名）：可否提交小组答辩 评阅完成日期注：1、评阅人必须具备指导教师资格，且对自己指导的或参与指导的毕业设计(论文)采取回避制度。凡发现抄袭、剽窃、篡改他人学术成果；伪造或者篡改数据、文献、注释等学术不端行为者将其设计（论文）退回指导老师。2、本表由用评阅教师用电脑打印并签名，要求在在答辩前完成并交给答辩小组组长；答辩工作结束后由答辩小组组长交系里汇总，装入学

43、生的毕业设计（论文）袋。3、 各系可以参照以下的考核指标，制定符合本系专业特点的评阅考核标准及评分实施细则并报教务处备案。武夷学院毕业设计 (论文)答辩过程记录表 茶学与生物 系 2008 届 生物技术及应用 专业（班级）学生姓名林开鹏学号20082501015指导教师姓名李卫林职称讲师课题名称樟树籽蛋白质的提取与分析答辩小组教师签名答辩时间2011年 6 月 9 日 答辩地点答辩成绩（按30%折合后计入）答辩评语答辩小组组长（签名）：答辩委员会意 见 答辩委员会主任（签名）：答辩过程纪录提示： 记录工作介绍情况； 至少记录3个教师提出的问题及学生回答的具体内容； 记录和记录人签名全部手写；

44、本栏纪录内容请在本表背面或用附页书写。记录人（签名）：注： 本表由答辩小组交系里汇总后装入学生的毕业设计（论文）袋。 各院系可参考本标准制定符合本系专业特点的的答辩评审评分标准及评分实施细则并报教务处备案。武夷学院本科毕业设计 (论文)成绩单 茶学与生物 系 2008 届 生物技术及应用 专业（班级）学生姓名林开鹏学号20082501015课题名称樟树籽蛋白质的提取与分析指导教师评定成绩（满分50分）指导教师姓名李卫林职称讲师评阅教师评定成绩（满分20分）评阅教师A姓名职称评阅教师B姓名职称答辩评定成绩（满分30分）答辩小组组长签名毕业设计（论文）成绩等级答辩委员会主任签名备注：本表用钢笔填写（字迹须清晰），经答辩委员会主任签字确认后装入学生的毕业设计（论文）袋。填表人（签名）：