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1、,Clin-Chemistry Technology,picture placeholder,全自动生化分析仪检测技术原理,分光光度法的工作原理分光光度法的分析类型分光光度法的校准及常见报警间接选择离子检测（ISE）的工作原理间接选择离子检测（ISE）的校准及常见报警,分光光度法的工作原理“墨水颜色”的深浅可以间接反映墨水的浓度,三、溶液颜色越深，间接说明墨水浓度越高,一、杯中的水就如同等待检测的样本溶液,二、墨水的浓度就如同我们需要检测的项目,分光光度法的工作原理不同种类的“墨水”具有不同的颜色及深浅,分光光度法的工作原理构成这个美丽世界的不同的颜色，是由各种波长的光线产生的,分光光度法的工
2、作原理构成这个美丽世界的不同的颜色，是由各种波长的光线产生的,400-700nm为人肉眼可见光,可见光从最冷色（紫色）到最暖色（红色），波长逐渐升高,340nm及以下的紫外波段为人肉眼不可见光,分光光度法的工作原理Q：如果需要检测的物质本身是无色的怎么办？,无色的待测物质,生化反应,有色的生成物质,众所周知的生活小魔法：淀粉遇上碘酒之后变蓝色,分光光度法的工作原理让我们做一个阶段要点的总结,一、待测物浓度可以由检测其颜色深浅得到。,二、即使待测物没有颜色，也可设计生化反应生成产色物质，间接计算得到浓度。,三、不同物质产生不同颜色，从而在不同波长进行检测。,分光光度法的工作原理那么，生化分析仪是
3、如何检测溶液颜色的深浅的？,一、产色物质浓度越高,二、容器的厚度越长,三、产色物质的吸光系数越高,出射光线的强度越低！（朗伯比尔定律）,Lambert和Beer指出，在产色物质处于一定浓度范围内，且入射光线为单色光的情况下：,分光光度法的工作原理朗伯比尔定律：一切分光光度法的基石,A=Lc,结论：在和L为固定常数的情况下，吸光度A与浓度c呈线性关系！,分光光度法的工作原理Q：为什么朗伯比尔定律只在一定浓度范围内有效？,超出一定浓度范围之后，由于分子之间的影响程度加剧，浓度与吸光度不再呈线性关系！,分光光度法的工作原理Q：为什么朗伯比尔定律计算吸光度只适用于单色光？,在复色光的条件下，由于待测物
4、质在各个波段下吸光系数的不同，造成相关曲线也出现不同程度的偏离,Absorbance(Abs)is more convenient to calculate concentration than transmittance%.The Abs is directly proportional to concentration.,Absorbance A=-log T,Transmission%T=I/I0*100,为什么要采用出射光与入射光比值的对数作为吸光度计算方式？,T=100%,log1000,分光光度法的工作原理了解一下分光光度法检测的完整流程（前分光）,1、光源灯发出全波段光线,2、单
5、色器将全波段光线分为不同波长的单色平行光,3、单色平行光经过反应杯溶液,4、光电信号接收器检测光线强度,分光光度法的工作原理再了解一下另一种分光光度法的流程（后分光）,5、光电信号检测光线强度,4、衍射光栅将出射光线分为不同波长的单色光,3、平行光经过反应杯溶液,1、光源灯发出全波段光线,2、光线经凸透镜整理成为平行光,分光光度法的工作原理Q：后分光模式相比前分光模式有什么优点？,后分光模式进入比色杯时为全波段光线，出射之后再分为多束单波长光线各自检测强度，所以方便仪器得到多个波长下的吸光度。,前分光模式进入比色杯时为单色光，要想实现多波长检测则需要两个单色器产生不同波长光线，由切光器控制，交
6、替的通过同一比色杯，不可连续监测。,在罗氏仪器上，待测物的12个波长的吸光度都被检测！并选择设定中的2个波长进行计算！,分光光度法的工作原理Q：那么，为什么Roche推荐使用双波长检测模式？,在双波长模式下，由于A=A（主波长）-A（副波长），那么电压不稳定等环境影响，都将会由于主副波长都产生了相同程度的影响而被消除。,在双波长模式下，一些常见的干扰因素如轻度溶血，将可以由于在主波长和副波长具有相同的吸光度而被间接消除。,分光光度法的工作原理让我们再次做一个阶段要点的总结,一、分光光度法的原理基础是朗伯比尔定律。,二、Roche使用的是主流的后分光比色分析技术。,三、Roche使用的双波长分析
7、法能去除多种样本干扰因素。,分光光度法的工作原理分光光度法的分析类型分光光度法的校准及常见报警间接选择离子检测（ISE）的工作原理间接选择离子检测（ISE）的校准及常见报警,分光光度法的分析类型首先，我们Roche的检测系统包括哪些组成部分？,分光光度法的分析类型接下来，检测系统中都存在哪些影响因素需要消除？,标本及容器（不同样本具有的不同本底吸光度）,一,仪器（比色杯的本底吸光度、不同比色杯之间的本底亦不同）,二,试剂（试剂具有的本底吸光度）,三,分光光度法的分析类型Q：样本的本底吸光度应该如何消除？,早期的分光光度计，只能读取比色杯中反应终止以后的吸光度，所以无法消除样本本底的影响。,Ro
8、che通过设置2Point End这一检测方法，可以有效扣除样本带来的本底吸光度影像。,分光光度法的分析类型Q：比色杯的本底吸光度应该如何消除？,Roche通过每天开机时自动执行光密度检查，更新比色杯的本底吸光度，之后在检测标本时均自动扣除。,分光光度法的分析类型Q：不同比色杯之间的本底吸光度差异应该如何消除？,Roche通过每周执行杯空白检查，更新所有比色杯各自的本底吸光度，之后在检测标本时均自动扣除。,Stored Cell Blankmeasured/updated as a part of the weekly maintenanceStored in the instruments
9、memoryGives information about each individual cell for each wavelengthCompensates for the cuvette wear with timeA cell wash must to be performed before cell blank measurementIf there are cells out of limits,the concerned cells are listed in the Abnormal Cell List,Cell Blank Measurements,Cell Blank M
10、easurements,Passing Cell Blankmeasured just before performing a test Gives current information about the cuvette before useDuring cell preparation(in operation mode),compared to stored cell blank held in memory Rejects the cell if absorbance reading difference is too greatMakes a comparison only at
11、the wavelength to be used for the current assay,If the difference value between Passing Cell Blank and Stored Cell Blank 1000(0.1ABS),the alarm(“Cell?”or“Cuvet”)occurs,分光光度法的分析类型Q：试剂的本底吸光度应该如何消除？,即使样本浓度为0，试剂本身仍然产生了一定的本底吸光度（称之为S1Abs）,Roche将检测到的吸光度变化一律扣除S1Abs，消除了由试剂本底造成的这部分吸光度。,分光光度法的分析类型让我们再次做一个阶段要点的
12、总结,分光光度法的分析类型我们已经了解了2Point End，那么Roche还有哪些其它的分析类型？,分光光度法的分析类型我们已经了解了2Point End，那么Roche还有哪些其它的分析类型？,分光光度法的分析类型我们已经了解了2Point End，那么Roche还有哪些其它的分析类型？,分光光度法的分析类型我们已经了解了2Point End，那么Roche还有哪些其它的分析类型？,分光光度法的分析类型Q：如果出现以下的Rate A反应曲线，结果是否可信？,此阶段由于样本中待测物浓度太高，反应体系吸光度出现急剧变化。,试剂中的底物不足以支持过快的消耗速度，反应体系吸光度变化开始加慢，甚至不
13、再变化。样本浓度会被严重低估。,分光光度法的分析类型Q：如何避免以上误报情况的发生？,绝大多数非配套试剂都无法做到！,Roche通过设计相应的检测程序参数，可以做到！,分光光度法的分析类型Abs Limit的设置,分光光度法的分析类型Q：如果出现以下的速率法反应曲线，结果是否可信？,在苦味酸法检测肌酐时，样本中的结合胆红素也会发生杂反应，并在主波长处造成吸光度的下降，对结果产生负干扰。干扰程度与样本中结合胆红素浓度有关！,分光光度法的分析类型那么，某些速率法项目也需要扣除样本空白？,是的，我们是否能能够像设置可以扣除终点法样本空白的2Point End一样，设置一种能够扣除速率法项目的样本空白
14、的检测参数？,分光光度法的分析类型Roche为此设计了可以扣除样本空白的速率法,得到了真正由肌酐产生的吸光度变化率！,分光光度法的分析类型Rate A的Blank Read设置,分光光度法的分析类型让我们再次做一个阶段要点的总结,1Point End可以读取反应终点的吸光度,2Point End可以读取终点吸光度，并去除样本空白影响,Rate A可以分析一段时间内吸光度平均变化率，并且通过设置也可去除样本空白的影响；或者提示反应中存在着底物耗尽,2Point Rate可以读取两个时间点之间的计算变化率，不受变化率线性的约束，适用于特定项目。,分光光度法的工作原理分光光度法的分析类型分光光度法的
15、校准及常见报警间接选择离子检测（ISE）的工作原理间接选择离子检测（ISE）的校准及常见报警,分光光度法的校准什么是校准？,如果把我们的生化仪系统比作一把用来测量长度的尺子。,那么在使用尺子之前，我们必须要先划好这把尺子的刻度。,分光光度法的校准那么，我们对于理想的检测结果，有什么样的要求？,在不同实验室间、测量系统间，具有可比性,在不同时间检测，能够前后一致,结果的准确性可靠,最终目的：不论使用哪种方法，在世界的哪个地方，在什么时候，都能得到相同的结果。（就像格林尼治标准时间）,分光光度法的校准如何才能达到我们刚才的要求？,在不同实验室间、测量系统间，具有可比性,在不同时间检测，能够前后一致
16、,结果的准确性可靠,所有的实验室均使用统一的校准品进行校准,定期对检测系统进行校准，确保任何时间都处于同一种“刻度”下,所使用的校准品的浓度真实、可靠！,分光光度法的校准对于以上要求，Roche都可以做到！,所有的实验室均使用统一的校准品进行校准,定期对检测系统进行校准，确保任何时间都处于同一种“刻度”下,所使用的校准品的浓度真实、可靠！,cfas系列,制定详细的项目校准周期建议,完整的溯源传递链条，保证了检测结果的可追溯性,分光光度法的校准全球使用统一的校准品,分光光度法的校准完整的溯源链至参考物质或参考方法,分光光度法的校准周密详细的校准周期建议,校准品与参考方法/参考物质之间的溯源链,采
17、用参考方法或参考物质为主校准品赋值主校准品为商业校准品赋值客户只需用商业校准品在配套系统上校准即可实现溯源,分光光度法的分析类型让我们再次做一个阶段要点的总结,校准是检测样本的前提,科学有效的校准是保证检测结果的可比性、再现性和可靠性的基石,Roche所提供的校准系统可以达到我们的要求,分光光度法的分析类型我们通过校准得到的“尺子”是什么样子的？,以待测物浓度Concentration为横坐标,以吸光度为纵坐标,分光光度法的分析类型我们看到的这把“尺子”是一把“直”的。,我们一般选取的浓度为0和浓度接近医学决定水平的两个点，称之为两点定标（2Point calibration）。,因为“两点决
18、定一条直线”，我们仅需两个不同浓度及对应的吸光度就可以作出一把“尺子”。,分光光度法的分析类型如果这把“尺子”是“弯曲”的我们如何校准？,分光光度法的分析类型Roche可供选择的校准曲线类型非常丰富,分光光度法的分析类型那么，Roche为每个项目选择校准曲线的原则是什么？,在各个医学决定水平处，检测试剂能表现出最佳的灵敏度、精密度和准确度。,为此，Roche使用模拟程序测试所有的曲线拟合，来选择一个最适宜的曲线。,The K Factor-End Point AssayK 值的计算公式,The K Factor-End Point AssayK 值的计算公式,K factor calculat
19、ion 2 point linear校准工作曲线,分光光度法的分析类型我们已经了解了“直尺”和“弯尺”如何校准,分光光度法的分析类型是否还有其它校准方式？,分光光度法的分析类型Span校准的更新方式,分光光度法的分析类型让我们再次做一个阶段要点的总结,校准曲线为样本浓度与对应吸光度的相关曲线,校准曲线可以分为线性（Linear）和非线性（non-Linear）两种,执行校准的方式可以分为2 Point、Full、Blank和Span四种,常用的校准方式为2 Point、Full两种,分光光度法的分析类型校准如此重要，应有保证它准确可靠的手段！（SD Limit）,校准时出现SD？报警，说明有一
20、个或多个浓度的数据偏离理论值太远，但是此次校准仍然是通过的。,SD Limit(标准差限制):常见校准失败的原因,校准的放置顺序可能有误（多个校准品）单个校准品自动稀释后校准 加样精度问题比色杯或光源灯老化污染的或蒸发浓缩的校准品混匀机构问题,分光光度法的分析类型校准如此重要，应有保证它准确可靠的手段！(Duplicate Limit),如果两次之间的结果既超出了下图中设置的5%，又超出了30Abs，则会提示DUP?，此次校准失败。,Duplicate limit:重复性限制,相对范围%和绝对范围,检查同一个校准品的两次吸光度差异Abs1-Ab2校准的时候,每个校准品会重复做两次,进行计算Du
21、p%(输入值)=|Abs2-Abs1|*100|Abs1+Abs2|/2 Abs(输入值)=|Abs2-Abs1|,Duplicate limit:常见校准校准失败的原因,如果是新试剂，检查试剂复溶及混匀情况检查样品针和试剂针.样品或试剂上有气泡光源灯或比色杯老化混匀不佳需要重新校准.,图片,分光光度法的分析类型校准如此重要，应有保证它准确可靠的手段！(Sensitivity Limit),浓度之差,吸光度之差,如果出现Sens?报警，说明校准液的吸光度变化太小或者太大，试剂或校准液失效都有可能造成，此次校准失败,Sensitivity limit(灵敏度限制),该数值标识出空白和 c.f.a
22、.s之间的单位浓度吸光度变化差异的最大值和最小值.在终点法的生化项目校准中，最小吸光度变化是必须检测的标准Sen:,Sensitivity limit(灵敏度限制):常见校准校准失败的原因,错误的校准品 蒸发浓缩或配制错误旧的或污染的试剂污染的空白校准品,空白和CFAS校准品的测得的吸光度值过于接近,分光光度法的分析类型校准如此重要，应有保证它准确可靠的手段！(S1 Abs Limit),如果出现S1Abs?报警，此次校准失败。常见于单试剂项目由于被氧化变质，试剂颜色严重加深。,分光光度法的分析类型校准如此重要，应有保证它准确可靠的手段！(Calib Limit),此报警仅仅提示两次校准之间存
23、在较大差异，此次校准仍然成功。,分光光度法的分析类型让我们再次做一个阶段要点的总结,因为校准很重要，Roche设置了对校准数据的各种检查,SD Limit检查了非线性校准曲线是否有离群点,Duplicate Limit检查了校准数据的重复性是否良好,Sensitivity Limit检查了校准液的吸光度高低是否达到预估水平,S1 Abs Limit检查了试剂的空白本底是否异常,Roche能够针对每个项目都通过反复实验，设定其适宜的控制限，而开放项目无法做到！,Calib Limit检查了本次校准K值与前次差异是否超过20%,让我们练习一下如何分析校准报告中报警的原因！,造成生化校准报警的潜在可
24、能原因,校准报警,如果校准失败，系统将自动使用之前有效的校准曲线计算标本浓度。,分光光度法的分析类型其它一些常见的数据报警,Abs 超出ABS,说明：反应杯空白校正用于计算的吸光度值超过33000。,样品浓度过高或者为脂血样品；试剂贮存或处置不当；光度计的光路中有阻塞物。,React 超出ABS,说明：在速率法测定中，主波长吸光度的变化率超出设定的限值。,样品浓度过高,底物耗尽试剂配制不当或已变质“综合功能应用分析”中的某个吸光度设置值不当。“增量减量”框内的“限定值”行。,Proz Prozone错误,两种Prozone Check的方式,两种Prozone Check的方式Prozone
25、Check的相关设置,Antigen re-addition method,Reaction Rate method,1st entry前带限制最小值2nd前带限制最大值3rd测量点1 第一个斜率4th测量点2 5th测量点3 第二个斜率 6th测量点4Pull downinside/Outside7th 吸光度差异(测量点1-2)8th吸光度差异(测量点3-4),抗原再次添加法 输入区 1 4反应速率法 输入区 1 6Inside Outside 输入区 7 8,1 2 3 4 5 6 7 8,Samp.?超出ABS最大值（非线性曲线）,样本吸光度值,Abs,S3,S2,S1,S4,S5,校
26、准品浓度,校准曲线,说明：发现样品吸光度等于或大于吸光度的理论最大值（适用于分析物浓度无限大时）。在报告和数据浏览子菜单中，结果字段将保留空白。原因：样品浓度过高,Photometer Check,Performed dailyChecks integrity of lampWater blank absorbances of cuvette No 1 at all 12 wavelengthsMust lie within defined valuesModularP No.1cell，ModluarD：No.123Cell，C501：无固定cell,e.g.all Abs,Abs betw
27、een previous and current values must be 300,Cell Blank Measurements,Stored Cell BlankIs measured/updated as a part of the weekly maintenanceStored in the instruments memoryGives information about each individual cell for each wavelengthCompensates for the cuvette wear with time,Passing Cell BlankIs
28、measured just before performing a test Gives current information about the cuvette before useCompared to stored cell blank held in memory如吸光度差距超过0.1则相应的比色杯号会被系统记录下来Rejects the cell if absorbance reading difference is too greatMakes a comparison only at the wavelength to be used for the current assay.,Cell Blank Measurements,Doing now what patients need next,
