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1、进行病原性细菌的分离鉴定 如何提高检出率？,四川大学华西公共卫生学院 医学检验教研室 刘衡川 电话：028-85502097 13982287006,标本处理,增菌培养或修复培养,采集：正确采集方法,时间、种类运送：温度、时间、培养基处理：集菌、减少杂菌、生物过滤、修复培养,样品的种类和来源卫生指标微生物病原微生物采集：正确采集方法,时间、种类运送：温度、时间、培养基处理：集菌、减少杂菌、生物过滤、修复培养,要不同部位采取,GB 4789.1,影响样品代表性的因素,采样量,采样部位,采样时间,采样的随机性和均匀性,批号,酸处理：军团菌：1份样品+1份1.2mol/L酸缓冲剂，pH2.2，5mi
2、n，中和后接种结核分支杆菌：1份痰样品+24倍的4%硫酸，室温30min，作用？碱处理：结核分支杆菌：1份痰标本+24倍量2%NaOH，室温510min，作用？,(一)样品处理,酶处理：结核分支杆菌：1份痰标本+12倍量的0.1%胰蛋白酶，室温5min，作用？消毒剂处理：结核分支杆菌：1份痰标本+1/2倍量0.3%苯扎溴胺，室温5min，作用？加热处理：军团菌：50水浴30min炭疽杆菌：65水浴30min或855min,(一)样品处理,中和消毒剂处理：硫代硫酸钠中和含氯消毒剂，如检测自来水的细菌，检测水标本的军团菌等生物过滤：钩端螺旋体小白鼠肺军团菌豚鼠肺,(一)样品处理,35 2.5%CO
3、2 37天,标本,快速诊断,直接涂片染色,DFA,ELISA,Gimene 染色,酸、热处理,豚鼠腹腔,鸡胚卵黄囊,卵黄PBS液,腹腔液脾悬液,45天,分离培养,可疑菌落,纯培养,初步报告,鉴定试验,染色镜检,生化反应,血清学试验,气相色谱,DNA相关度测定,报告,出现 症状,酸、热处理,浓缩,损伤菌的复苏,2023/4/1,13,(二)样品浓缩,常用方法,过滤法,细菌：离心沉淀，3000r/min,30min 差速离心：去除杂质，收集菌体 絮凝剂沉淀：FeCl3+NaOHFe(OH)3病毒：高速或超速离心机,细菌：在负压或正压作用下，通过 0.45m孔径的滤膜病毒：通过膜的静电吸附浓缩过滤法
4、 还可消除样品中的抑制剂,滤膜：硝酸纤维素、醋酸纤维,2023/4/1,14,2023/4/1,15,吸附法,非特异性吸附：化学制剂形成沉淀，共沉淀细菌特异性吸附：利用配体与受体的亲和力，吸附待检微生物。如流感病毒血凝素可与红细胞结合，低速离心收集红细胞，即达到浓缩病毒的目的,(二)样品浓缩,捕获,清洗,释放,固相包被的抗体捕获目标细菌,洗涤程序减少杂菌,用特异性酶切割抗体以释放活菌細胞,磁珠-抗体与抗原結合,(二)样品浓缩,修复培养微生物受到严重损伤后，一般培养方法不生长亚致死性损伤的致病菌，普通培养方法无法培养而造成假阴性人类食用后有患病的潜在威胁，当受损细菌进入人体，得到修复产生致病性,
5、(三)损伤菌的复苏,加工食品日益增多,细菌受损因素：,热冷冻冷藏干燥,高渗透压消毒剂防腐剂添加剂,(三)损伤菌的复苏,修复培养方法：增加营养成分：如肉浸汁、胰胨、蛋白胨、各种氨基酸、活性酶蛋白、ATP、丙酮酸等简单的低级培养基：缓冲蛋白胨水，蛋白胨、Nacl、磷酸缓冲液缓冲液等高渗培养基、含有血清培养基无抑制剂的培养基改变pH降低培养温度,(三)损伤菌的复苏,（3）弯曲杆菌：样品先于0.3琥珀酸钠、0.01胱氨酸-HCl和抗生素的布氏肉汤，37培养6h再加多黏菌素B，42，微需氧培养,损伤菌的恢复,国际上较公认的一些方法：（1）副溶血弧菌：用3NaCl蛋白胨水，35培养2h前增菌（2）耶尔森氏
6、菌属：4培养前，先25 培养4h，前增菌,（4）大肠菌群、粪大肠菌群、副溶血弧菌、粪链球菌和金黄色葡萄球菌的MPN测定法：样品接种STB培养基，3537，416h前增菌每管再加双料选择性肉汤培养基。再按原法进行,（5）表面覆盖平板法：样品倾注无选择性营养丰富的琼脂的平板，2537，14h，恢复受伤菌再依据欲计数的细菌类别，覆盖一层约1012ml的选择性培养基，继续培养。按原法进行,（6）滤膜平板法：混匀的样品1ml，涂布于孔径450m的滤膜上置无选择性的琼脂平板培养基上，37，4h，恢复受伤细菌然后将滤膜置于选择性琼脂平板培养基上，4018h，计数粪大肠菌群,选择合适的分离培养方法,挑选多个可
7、疑菌落进行鉴定,培养基的质量控制,增菌培养、弱选择性和强选择性培养基各一种培养条件：温度、湿度、气体等。如幽门螺杆菌,二、选择合适的分离培养方法,四、挑选多个可疑菌落进行鉴定,三、增加样品接种量,阪歧肠杆菌检验方法 FDA方法,100、10、1g样品各三份（分别溶于9份45无菌蒸馏水）36过夜 10ml培养液+90ml的EE肉汤，混匀 36过夜 涂布法或划线法接种VRBG琼脂 36过夜 选择可疑菌落划线接种于TSA琼脂上 2548-72h 选择黄色菌落用 API 20E和氧化酶试验确证,333g样品,阪歧肠杆菌检验方法,每一增菌培养物接种2个VRBG平板(结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂），0.1m
8、l/平板，用无菌玻璃棒涂布36过夜挑取5个可疑菌落，划线接种5个TSA平板，25 4872h典型菌落形态：菌落周围紫色沉淀环,选用敏感的、特异的选择性平板或鉴别平板进行分离培养免疫荧光菌球法,非军团菌,Legionella pneumophila(灰兰色可疑菌落),GVPC 平板,李斯特氏菌显色培养基Listeria Chromagenic medium,用于李斯特菌的选择性分离鉴别，24h可初步判定结果,单增李斯特菌:绿色，周围有晕圈绵羊李斯特菌:绿色，周围有晕圈英诺克李特菌:绿色,科玛嘉显色培养基,单增李斯特菌,蓝色菌落，并带有白色脂质溶解环,O157:H7 ID 显色培养基典型菌落,单增
9、李斯特菌,大肠杆菌O157:H7显色培养基,用于大肠杆菌O157:H7的选择性分离鉴别，24h可初步判定结果,O157:H7:紫红色其他大肠杆菌:蓝色其他:无色或被抑制,沙门菌显色培养基(陆桥),沙门菌的选择性分离鉴别，1824h可初步判定结果,沙门菌 红色大肠杆菌 黄色,沙门氏菌菌落(紫)(CHROMagar显色培养基),沙门菌显色培养基,沙门氏菌菌落特征（红）(海博公司显色培养基),Baird Parker 培养基+RPF,R1 试剂:Baird Parker 基础琼脂R2 试剂:RPF 配方(兔血浆+纤维蛋白原试验),凝固酶阳性葡萄球菌:菌落周围形成沉淀圈,弧菌显色培养基Vibrio C
10、hromagenic medium,用于副溶血性弧菌的分离鉴别，24h可初步判定结果,副溶血性弧菌:紫红色创伤弧菌:蓝绿色霍乱弧菌:蓝绿色拟态弧菌:蓝绿色溶藻弧菌:无色,分子生物学方法：荧光定量PCR单克隆抗体免疫荧光免疫磁珠技术全自动微生物分析仪器,选用敏感的、特异的鉴定方法,仪器检测法,VIDAS应用酶联免疫原理制造的全自动免疫分析仪，用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体捕捉目标生物体，然后用带荧光的酶联抗体结合，充分冲洗，激发光源检测，自动读结果优点：灵敏度高，快速，48h内鉴定沙门菌、大肠杆菌O157:H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等,VIDAS 免疫检测原理,3
11、70 nm,450 nm,免疫浓缩原理,捕获,清洗,释放,固相包被的抗体捕获目标细菌,洗涤程序减少杂菌,用特异性酶切割抗体以释放活菌細胞,VIDAS,将30个细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上培养后，仪器判断显色反应利用数值法进行判定根据鉴定的微生物种类的不同，设计不同的鉴定卡片，如革兰阴性菌卡、革兰阳性菌卡、酵母菌卡等,生物梅里埃自动微生物检测仪,1.鉴定范围广：肠道G-杆菌、非发酵G-杆菌、葡萄球菌、链球菌、G+和G-厌氧菌、淋球菌等2.有20多种药敏试卡3.功能广泛：可同时连接自动免疫诊断系统，食品质量鉴定Lactometer系统等4.设有多种程序，可根据不同需要加以调整5.自动化
12、程度高，一次性消耗品少6.快速、动态分析7.封闭式操作,自动微生物检测仪,生物梅里埃自动微生物检测仪,检测时间,80%临床分离株鉴定:平均检测时间5h鉴定+药敏:平均检测时间6h,自动化金标准,商品化生化鉴定系统,VITEK GEN+一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质制备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液将菌悬液接种到各种细菌的卡片中放入具有读数功能的孵箱内每隔一定时间，仪器自动检测发酵情况换算成能被计算机所接受的生物编码最后由计算机判定，打印出鉴定结果,API 20E是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展的一种细菌编码鉴定方法广泛应用于临床、食品中革兰阴性杆菌的快速鉴
13、定,自动核酸纯化系统,应用面广：病毒、细菌的核酸提取，富集增菌试剂开放：可使用各家公司的核酸磁珠提取试剂盒速度快：20min内完成咽拭子H1N1核酸提取使用方便：仅需一步加入试剂,多病原体复合检测系统液相悬浮芯片系统 多指标同步分析（flexible multi-analyte profiling,xMAP）,未来的一个主要检测技术！,Ex1,Ex2,Em1,Em3,Em2,DD,Read 100 each color bead in assay 1-100 bead sets avail.,Readed,Bead-Based Technology,上世纪90年代，美国Luminex公司将流式
14、细胞仪、数字信号处理器和激光检测装置相结合具有多指标同步分析功能悬浮芯片技术(suspension array)液态芯片技术(liquid chip)广泛应用于细菌、病毒、单核苷酸多态性(SNP)检测等领域,技术核心是特制直径5.6m的聚苯乙烯微球每种微球按严格比例掺入2种不同荧光染料每种染料有10种浓度梯度，两种染料搭配比例的不同，可将微球分为100种每种微球都有独特的光谱地址根据试验目的，微球表面标记可以捕获相应目标分子的配体，在杂交过程中加入荧光标记，反应后检测,在同一反应体系加入不同的微球，即可实现高通量标记的微球与样品中待检目标分子作用，在液流带 动下通过流式细胞仪，两束不同波长的激
15、光检测每个微球：635nm的红色激光区分微球种类532nm的绿色激光荧光强度当标记的待测样本与特定微球上的探针结合，仪器检测两束激光所发的光计算机自动分析特定微球上的平均荧光强度,脉冲场电泳系统菌株鉴定系统,全球脉冲网的标准平台,菌株鉴定?,追踪溯源,多功能荧光酶标仪,荧光检测（包括时间分辨荧光）,化学发光检测,Elisa 酶联免疫检测,检测灵敏度大大提高,七、培养基的质量控制,购买有质量认证的成品培养基新购买的成品培养基鉴定后使用,理化指标微生物学方法营养培养基选择性增菌培养基,七、培养基的质量控制理化指标,pH值：25时的测定值，0.2 比色法：用指示剂在不同pH溶液中的颜色变化，与标准比
16、色管或比色板相比电极式pH计：用可测定固体的特殊电极,pH值、凝胶强度、色泽、澄清度、水分含量,七、培养基的质量控制 微生物学方法,灵敏度测定法混合增菌培养法测定增菌倍数法特异性测定方法,七、培养基的质量控制 营养培养基,灵敏度测定法质控菌株：乙型溶血性链球菌 32210 短小芽孢杆菌 7316实验方法1.制备实验菌108菌悬液，10倍稀释至10-82.选取适宜的34个连续稀释度，接种1mL于9mL待测试的培养基中，每个稀释度接种3管，37培养3天3.以接种管2/3生长的最高稀释度为该培养基灵敏度,七、培养基的质量控制 选择性增菌培养基,混合增菌培养法(SC肉汤)质控菌株：鼠伤寒沙门氏菌和大肠
17、杆菌实验方法 将沙门氏菌和大肠杆菌肉汤新鲜培养物按1:99 混合，接种SC肉汤，351824h，适当稀释，涂布麦康凯琼脂，平板上应90%以上为沙门氏菌,大肠杆菌菌落应10%。,七、培养基的质量控制 选择性增菌培养基,测定增菌倍数法(TTB)质控菌株：鼠伤寒沙菌和粪链球菌实验方法,合格指标：沙门菌应增菌105倍以上 大肠杆菌和粪链球菌增菌应低于102,七、培养基的质量控制选择性分离培养基,含菌量约1001000CFU 菌悬液涂布平板按ISO/TS11133-1要求，接种目标阳性菌、弱生长阳性菌株、呈现不同生化特性的菌株和非目标菌（被抑制菌株）观察菌种的典型生长情况，并通过灵敏度、特异性对培养基的
18、质量进行控制,灵敏度：目标菌1001000 cfu/板特异性：目标菌生长良好，特性典型，非目标菌 不生长,干粉培养基使用注意事项,摇匀后准确称量蒸馏水或去离子水配制用中性玻璃质容器加热溶解时适当搅拌，不能过度加热含琼脂的培养基灭菌后，不能长时间处于高温状态,干粉培养基保存,阴凉、干燥、避光保存，不能放置冰箱保存，防止受潮结块保质期：开封后6个月称量后迅速拧紧瓶盖，潮湿结块不能再使用,物质储备知识储备 责任心、事业心、荣誉感团结合作：科室内、外科室耐心、信心只有有所为，才能有所地位,提高检出率的方法,用阳性、阴性菌株与标本同步进行试验，特别是生化反应,八、设阳性、阴性对照,1.样品采集、样品运送
19、2.样品处理：集菌、减少杂菌、生物过滤、修复培养3.增加样品接种量4.挑选多个可疑菌落鉴定5.增加分离平板的种类 6.选择合适的分离培养方法7.选用敏感的、特异的鉴定方法,提高检出率的方法,8.培养基的质量控制9.用阳性、阴性菌株与标本同步进行试验10.物质储备，技术储备11.责任心、事业心、荣誉感12.团结合作、团队精神13.“猎人的精神”14.耐心、信心15.计划、演习,临床相关知识：所致疾病感染量症状体症潜伏期病程并发症愈后病死率治疗原则致病机制,分离培养,标本,增菌培养,流行病学：传染源传播途径易感人群季节分布地区分布年龄分布性别分布,纯培养,鉴定、分型,确诊报告,培养特性生化反应生理特性,染色性形态、排列特殊结构抗原结构抵抗力、生态,生物学特性,实验室生物安全,社 自会 然因 因素 素,分类,分子生物学,培养基对照：检查灭菌是否合格培养基+试验菌培养基+试验菌(灵敏度菌量)制剂对照：培养基+标本+试验菌 环境对照,无菌制剂的检查应设的对照？,食品卫生微生物检查的结果解释 1.大肠菌群：阳性；菌落总数：10 2.大肠菌群的试验结果：,敬作抛砖之引，以求美玉之来。,谢谢！,
