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1、1,1,1,1,1,1,微生物生理生化,胡小兵市政工程专业建筑工程学院二0一五年七月,2,第八章、核酸化学,二、核酸的组成成分,三、DNA的结构,四、DNA和基因组,五、RNA的结构,六、核酸生物合成,一、核酸的生物学功能,七、核酸的分子生物学,问 题,DNA分子有几级结构，细菌的DNA的结构如何？基因与基因组有和区别？遗传中发生点突变的依据是什么？生物遗传中发生了“差错”，这是好事还是坏事？细菌的DNA 重组主要的方式有哪些？对于难降解的有机物如何筛选与培养特效菌种？分子生物学技术在水处理中有何作用？,3,4,一、核酸的生物学功能,（一）核酸与遗传信息的传递,DNA是基本遗传物质RNA在传递
2、遗传信息上的作用 1)mRNA是蛋白质合成的模板；2)tRNA识别mRNA上的遗传密码，转运特定氨基酸到核糖体上合成肽链；3)rRNA是核糖体的主要成分，是翻译工作的场所。,（二）核酸与蛋白质的生物合成,DNA有选择地转录为mRNA，tRNA、rRNA也是DNA转录产物。,5,生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。）由于DNA碱基的颠倒（如TA被颠倒为AT）或被调换（如GC被换为TA）；）由于在DNA复制过程中被遗漏了一对或多了一对核苷酸；）或者在转译时发生了差误，如氨酰tRNA合成酶错将一个结构与正常氨基酸十分相似的物质交给tRNA。）还有一些生物的遗传性状发生了突变。,（三）核酸结构改
3、变与生物变异,变异和进化都是DNA结构改变而引起蛋白质改变结果。,6,（四）遗传工程,遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育新型生物品种的技术。实验室中将细菌作材料研究遗传工程过程可分为：（1）重组DNA分子（基因重组）；（2）将重组DNA引入受体细胞（转化或转导）。,（五）克隆与克隆化,由单一亲代细胞用无性繁殖产生的子代细胞称克隆，形成克隆的过程称克隆化。,二、核酸的组成成分,核酸 nucleic acid,核苷酸 nucleotide,核苷 nucleoside,磷酸 phosphate,嘌呤碱 purine base 或 嘧啶碱 pyrimidine base,（碱基 base）,核糖
4、 ribose 或 脱氧核糖 deoxyribose,（戊糖 amyl sugar）,（一）核糖和脱氧核糖,-D-2-核糖,-D-2-脱氧核糖,O,核糖+H+,糠醛,甲基间苯二酚,FeCl3,绿色产物,脱氧核糖+H+,-羟基-酮戊醛,二苯胺,蓝色产物,RNA和DNA定性、定量测定,（二）嘌呤碱和嘧啶碱,1,2,3,4,5,6,7,8,9,嘌呤,腺嘌呤 adenine,（A）,鸟嘌呤 guanine,（G）,1,2,3,6,H,胞嘧啶 Cytosine,（C）,尿嘧啶 uracil,（U）,H,H,胸腺嘧啶 thymine,（T）,（三）核苷,腺 苷,尿苷,OH,假尿苷（）,NH2,（四）核苷酸
5、,P,-O,胸苷-5-磷酸,3,5,1,P,P,P,OH,A,T,G,pGpTpAOH,pG-T-A,pGTA,14,1、各种核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA 和DNA合成的直接原料。,2、能量代谢中的能量直接载体。,ATP能量“货币”,UTP参加糖的互相转化与合成,CTP参加磷脂的合成,GTP参加蛋白质和嘌呤的合成,核苷酸作用,三、DNA的结构,（一）DNA的一级结构,1)DNA 序列常被认为是碱基序列（base sequence)。2)通常碱基序列由DNA链的53方向写。3)DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。,16,（二）DNA的
6、双螺旋结构,17,鸟嘌呤胞嘧啶碱基对,腺嘌呤胸腺嘧啶碱基对,18,磷酸二酯键,19,2.双螺旋结构模型要点,（1）两条多核苷酸链反向平行。（2）碱基内侧，A与T、G与C配对，分别形成3和2个氢键。（3）双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。,3.双螺旋结构的稳定因素,（1）氢键（太弱）；（2）碱基堆积力（base stacking force，由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。,20,21,22,染色体包装的结构模型,多级螺旋模型压缩倍数 7 6 40 5 DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色
7、单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级包装 三级包装 四级包装,（三）DNA的三级结构,线形分子、双链环状(dcDNA)超螺旋,四、DNA与基因组织,DNA,Transcription,RNA（mRNA、tRNA、rRNA）,Translation,Protein,基因,基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。,结构基因,调节基因,基因组,25,五、RNA结构,26,27,主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶(D)；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以
8、变动；6.TC环含有T和；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。,28,29,1、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式复制,一）DNA的生物合成-半保留,DNA复制的起点和方向,六 核酸的生物合成,30,2、真核生物DNA的多起点复制,n,31,二）原核细胞的DNA复制,1.DNA聚合酶（Pol）,（dNMP）n+dNTP,Mg2+,（dNMP）n+1+PPi,特点,（1）不能催化从无到有的聚合反应。,（2）催化的反应只能在引物的3延伸。,（3）3接上的核苷酸决定于模板链。,（4）具有53和35外切酶活性。,32,2.Pol和Pol,PCR（多聚酶链式反应）,1 热变性,2 退火,3 DNA聚合酶
9、,重复1，2，3,PCR反应全过程,33,3.双链DNA复制的分子机制,（1）冈崎片段和半不连续复制,复制叉上DNA合成的三种可行性,34,（2）冈崎片段的RNA引物,利福酶素对RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素对蛋白质合成有抑制作用。,引物RNA在复制过程中暂时存在，最后通过Pol的53外切酶活力水解。,（3）DNA连接酶,催化一条DNA链的3末端与相邻的另一条DNA链的5末端之间的磷酸二酯键的合成。,35,其它功能：（1）修补双螺旋DNA中单股的缺口；（2）连接线状双螺旋DNA以产生环状DNA；（3）重组过程中将几段DNA链连接起来。,（4）母本DNA双链的分离,DNA解螺旋酶（DNAheli
10、case）,拓扑异构酶（type topoisomerase）,36,（5）DNA聚合酶的“校对”作用,DNA聚合酶的35外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成“错配”的一种手段。,4.真核细胞DNA的复制,（1）真核细胞DNA复制有多个起始点。,（2）至少有5种DNA聚合酶，即、。,（3）端粒由端粒酶催化复制。,生物细胞DNA复制分子机制的基本特点。,37,5.反转录作用,利用反转录酶可制造与任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互补DNA（cDNA）。,6.DNA的损伤与修复,（1）DNA损伤的各种结构变化,碱基缺失或插入,碱基改变,（2）修复机制,光复活；切除修复；重组
11、修复；SOS修复,38,7.重组修复,5,重组,修复,三位科学家Tomas Lindahl、Paul Modrich和Aziz Sancar 因“DNA修复的机制研究”获2015年诺贝尔化学奖。,39,39,1）细菌的转化,40,41,41,2）细菌的转导,42,3）细菌的结合,43,8.细菌的限制修饰系统,限制性核酸内切酶,平头末端,Hpa,粘性末端,EcoR,44,二 RNA的生物合成,（一）转录,转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。,1.原核细胞的转录,E.coli 的RNA聚合酶中，2称为核心酶。,因子辨认模板DNA的起始位点。,45,2.真核细胞的转录,真核细胞RNA聚合酶有、三
12、类。,3.转录产物的加工,（1）rRNA前体的转录后加工,原核细胞,真核细胞,（2）tRNA前体的加工,（3）真核细胞mRNA的加工,46,8、DNA的分子生物学技术(后面我来讲）,47,变形梯度凝胶电泳,微生物群落遗传多样性以及 PCR 扩增 DNA 片段的多态性。,变性剂梯度,低,高,PCR等长DNA产物1 2 3 4 5 6 7,聚丙烯酰胺凝胶,到达变性梯度时DAN解链，速度下降,A BC DE FG,48,DGGE技术主要操作过程如下:,样品预处理;样品DNA(或RNA)提取及纯化;16S rDNA 或基因片段的PCR扩增;预实验(DGGE 条件优化);制胶;样品的DGGE 分析;图谱
13、分析;条带序列分析。,49,DGGE过程示意图,50,DGGE特点：,DGGE 技术快速简便、分离效果好。从理论上讲，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE 技术对于DNA 片段的分辨率可以达到一个碱基差异水平，DGGE 法只能对微生物群落中数量上大于1%的优势种群进行分析。DGGE 技术无法提供代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。,51,应用举例：-变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析生化反应器微生物,一、取样与预处理,1、微生物取样 稳定运行条件下，不同温度条件(1)生物强化一体化反应器的填料上生物膜(2)生物滤塔填料上生物膜。,52,53,2、样品预处理-
14、土壤基因组提取试剂盒快速提取生物膜中的总DNA具体操作如下：1）取0.1-0.3g污泥（生物膜）样本，加入1 ml Buffer SW，涡旋振荡1-3 min（让管底的污泥土壤振动起来），12000 rpm离心1 min，倒去上清液；2）加入750 l 70%乙醇，涡旋振荡1min，12000 rpm离心1min，倒去上清液；并用移液枪吸尽余液；3）在污泥中加入500 l Buffer SL，涡旋振荡1-3min，65水浴20 min，每隔5 min涡旋振荡5秒；4）12000 rpm离心3 min，上清液移至1.5 ml离心管中；上清液中加等体积Buffer SGL，颠倒混匀15-20次，冰
15、上放置5 min，室温12000 rpm离心5min；5)上清液转入Spin column DM 微试管中（管内先放1个2 ml collection tube），12000 rpm离心1 min，弃废液，将2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管；,54,55,6)向Spin column DM加入500 l Buffer GWS，12000 rpm离心1min，弃 废液，将2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管；7)向Spin column DM中加入700 l Buffer GW1，12000
16、rpm离心1min弃废液，2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管；8)向Spin column DM中加入500 l Buffer GW2，12000 rpm离心1min弃废液，2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管；9)将2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管中，最大转速离心2 min，将Spin column DM管中上清液转到1.5 ml离心管中，打开盖子，室温放置数分数以充分晾干；10)再加入5-100 l Buffer GE，12000 rp
17、m离心1min，把离心管中的液体重新加到原来的Spin column DM管中。室温放置1 min，12000 rpm离心1 min，液体离心管中溶液（DAN样品）放置冰箱-20保存。,56,3、DNA提出物分离与鉴别 1)称琼脂糖210 ml，加入TBE缓冲液30 ml，80微波溶化，加入2.0 l goldview新型核酸染料上胶到电泳槽上。2)把分离的总DNA样品加入到琼脂糖电泳凝胶上，同时点入marker DNA/Hind。3)电流条件：U=97V，I=61-63 mA，电泳时间为1h30 min到1h 50 min。4)然后把DNA分离后的凝胶放到凝胶成像系统中观察DAN分离效果，并
18、拍摄图像。,57,二、总DNA提取,58,Marker,59,1、反应体系：,三、PCR扩增,60,60,引物序列,61,变性延伸，25-35个循环；,2、PCR反应条件：,62,3、琼脂糖电泳后紫外成像。,Marker,63,四、DGGE分离,64,DGGE分离具体过程：1）配制高（70%）、低（30%）浓度的变性琼脂糖胶，加入聚合剂 TEMED和DGGE染料。2）用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶放架子上打入胶模中，排气，凝胶厚度为3-5 mm。3）在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1TAE缓冲液的电泳槽中，轻轻拔去梳
19、子，且使缓冲液没过胶面约1 mm。,65,4）DNA样品与10Loading-buffer（含有溴酚蓝和甘油等物质）混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。5）电泳条件：60 C、电泳电压60 V，电泳12 h后，打开夹板，加入10%EB染料缓冲液中20 min，取出夹板，清水冲洗2遍后，擦干放在凝胶放到凝胶成像系统中观察，并拍摄图像。6）用洁净刀片将条带切下，放入1.5 mlEP 管，送测序公司纯化测序。,66,DGGE产物紫外呈像,DGGE条带切割后呈像,五）测序过程,（一）测序过程1、对回收的DGGE条带进行二次PCR扩增及产物回收；2、目的片断TA克隆；3、蓝白斑筛选；4、质粒提取；5、M13+/-测序。,67,（二）测序结果,68,69,五、结论,1、生物强化一体化反应器、HPES反应生物滤塔中的微生物优势种类相同；但前者中的生物多样性要高一些，约高20%。2、生化反应器中的微生物以耐盐性菌类为主。如，新鞘氨醇杆菌属、-变形菌纲的红螺菌、纤发菌属等；3、生物中存在着一些硝化细菌，如：甲基球菌属、亚硝化单胞菌等。4、在冬季取样中发现有耐寒性微生物，如单胞菌属一种Sphingomonas aurantiaca。,70,
