核酸化学 核苷酸代谢ppt课件.ppt

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1、王 志 宇,广州中医药大学基础医学部广州中医药大学第二附属医院广东省中医药科学院,核酸化学,Nucleic Acids,第一节 概 述,核酸(nucleic acid)以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。DNA（Deoxyribonucleic acid)脱氧核糖核酸RNA（Ribonucleic acid)核糖核酸,1868年 Fridrich Miescher从脓细胞中提取“核素”1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构1968年 Nirenberg发现遗传密码1975年 Temin和Baltimore发现

2、逆转录酶1981年 Gilbert和Sanger建立DNA 测序方法1985年 Mullis发明PCR 技术1990年 美国启动人类基因组计划(HGP)1994年 中国人类基因组计划启动2001年 美、英等国完成人类基因组计划基本框架,一、核酸的发现和研究工作进展,二、核酸的分类及分布、功能,(deoxyribonucleic acid,DNA),(ribonucleic acid,RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,90%以上分布于细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。,分布于胞核、胞液。,携带遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。,参与细胞内DNA遗传信息的表达。某

3、些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,第二节 核酸的分子组成,一、元素组成,主要元素组成：C、H、O、N、P(911%),与蛋白质比较，核酸一般不含S，而P的含量较为稳定，占9-11%。,二、基本构成单位：核苷酸(nucleotide),核苷酸由戊糖、磷酸和含氮碱三部分构成,(一）戊糖pentose 脱氧核糖（DNA）deoxyribose 核糖（RNA）ribose,（二）碱基base,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),碱基

4、的结构特征,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（260 nm左右）。,核苷 nucleoside,糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。,核糖核苷：AR,GR,UR,CR脱氧核苷：dAR,dGR,dTR,dCR,核苷酸(ribonucleotide)的结构与命名,核苷和磷酸以磷酸酯键连接,5核苷酸 3核苷酸 2核苷酸,ATP的性质,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。ATP水解时,可以释放出大量自由能。ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。ATP 也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普

5、通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,cAMP和cGMP,cAMP(3,5-环化腺苷酸)和cGMP(3,5-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4,cAMP和cGMP的水解能约为43.9 KJ/mol，比ATP水解能高得多。,是核酸DNA、RNA的合成原料（NTP和dNTP)直接为生命活动提供能量(NTP)核苷酸衍生物是许多生物合成中的活化中间产物(如UDP-GA、PAPS、CDP、胆碱）腺苷酸构成酶的辅助因子(如FMN、FAD、NADH）调节体内代谢调节(cAMP c

6、GMP),核苷酸的功能,第三节 核酸的分子结构,一、一级结构（primary structure）,一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。,1、核苷酸的连接方式：3,5磷酸二酯键,2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链,信息量：4n末端：5 端、3端多核苷酸链的方向：5端3端(由左至右),3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写,碱基组成分析Chargaff 规则：A=T；G C,碱基的理化数据分析：A-T、G-C以氢键配对较合理,DNA纤维的X-线衍射图谱分析,DNA双螺旋结构的研究背景,二、DNA的空间结构,（一）DNA的二级结构（secondary

7、structure）,1、碱基组成规则(Chargaff规则),A=T，G=C；A+G=T+C(嘌呤与嘧啶的总数相等),有种属特异性,无组织、器官特异性,不受年龄、营养、性别及其他环境等影响,DNA分子由两条DNA单链组成。DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,DNA双螺旋结构的特点,double helix model,DNA双螺旋结构的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为5端3端，而另一条链

8、的方向为3端5端。,（2）嘌呤和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,（3）螺旋横截面的直径约为2nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈的高度）为3.4 nm。,（4）维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。碱基结合具有严格的配对规律:A与T结合，G与C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,（5）螺旋表面形成大沟(major groove)及小沟

9、(minor groove)，彼此相间排列。小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。（6）氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,（二）二级结构：双螺旋结构模型(double helix model),1、Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA),（1）反平行双链：脱氧核糖-磷酸骨架位于外侧，碱基对位于内侧,（2）碱基互补配对：AT配对（两个氢键），GC配对（三个氢键）；碱基对平面垂直纵轴,（3）右手双螺旋：螺距为3.4 nm，直径为2.0 nm，10bp/圈,（4）表面功能区：小沟较浅；大沟较深，是蛋白质识别DNA碱基序列的基础,（5）维持结构稳定的

10、力量：氢键维持双链横向稳定，碱基堆积力维持螺旋纵向稳定,3、其他螺旋形式,Z-DNA（左手双螺旋）A-DNA,DNA双螺旋结构的多样性,A form:右手螺旋大沟变深小沟变浅11bp/螺旋螺距2.9nm直径2.6nm,Z form:左手螺旋只有一条沟槽窄而深12bp/螺旋螺距4.5 nm直径1.8 nm,DNA双螺旋的稳定性,DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。维持这种稳定性的因素包括：两条DNA链之间形成的氢键，碱基堆积力。双螺旋结构内部形成的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响；介质中的阳离子（如Na+、K+和Mg2+）中和了磷酸基团的负电荷，降低了DNA链之间的排斥力等。改变介

11、质条件和环境温度，将影响双螺旋的稳定性。,天然存在的DNA分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在1061010。大肠杆菌染色体由400万碱基对(basepair，bp)组成的双螺旋DNA单分子。其长度为1.4106nm，相当于1.4mm，而直径为20nm，相当原子的大小。黑腹果蝇最大染色体由6.2107bp组成，长2.1cm多瘤病毒的DNA由5100bp组成，长1.7mm,（二）DNA的三级结构,双螺旋进一步扭曲,形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。包括：线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋、环状DNA形成的结、超螺旋和连环等,大多数原核生物：1）共价封闭的环状双螺旋分子2）超螺旋结构

12、：双螺旋基础上的螺旋化,正超螺旋(positive supercoil):盘绕方向与双螺旋方同相同负超螺旋(negative supercoil):盘绕方向与双螺旋方向相反,右手,左手,（三）DNA在真核生物细胞核内的组装,核小体(nucleosome)：由DNA和组蛋白构成。,DNA：以负超螺旋缠绕在组蛋白上,组蛋白核心：H2B,H2A,H3,H4,H1组蛋白在核小体之间,DNA的存在形式,DNA双螺旋片段,染色质纤维,伸展形染色质片段,密集形染色质片段,整个染色体,串珠状核小体,（三）DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷载遗传信息，并作为基因复制和转录的模板。它是生命遗传的物质基

13、础，也是个体生命活动的信息基础。,基因从结构上定义，是指DNA分子中的特定区段，其中的核苷酸排列顺序决定了基因的功能。,三、RNA的分子结构,RNA的结构特点,RNA是单链分子，因此在RNA分子中，嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成单链突环。这种结构称为“发夹型”结构。在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G 除了可以和C 配对外，也可以和U 配对。G-U 配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分.,（一）信使RN

14、A的结构与功能,*真核生物mRNA的结构特点,1.大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，同时第一个核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,2.大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构，称为多聚A尾。,帽子结构和多聚A尾的功能,5-cap的功能,(1)防止mRNA被核酸酶降解。,(2)为mRNA翻译活性所必需。,(3)与蛋白质合成的正确起始有关。,3-polyA:polyA的残基数20200个，或更多。,polyA的功能,(2)与翻译有关，没有polyA翻译活性降低。,(3)与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。,(1)保护mRNA，免受

15、核酸外切酶的作用。,内含子(intron),外显子(exon),*真核生物mRNA成熟过程,*mRNA的功能 把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。,（二）tRNA的结构与功能,*tRNA的一级结构特点 含 1020%稀有碱基，如 DHU 3末端为-CCA-OH 5末端大多数为G 具有 TC,双氢尿嘧啶(DHU),假尿嘧啶(),次黄嘌呤(I),*tRNA的二级结构三叶草形 氨基酸臂 DHU环 反密码环 额外环 TC环,氨基酸臂,额外环,*tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,1、分子较小，含较多的稀有碱基

16、和非标准碱基配对,2、5端一般为鸟嘌呤核苷酸，3端为CCA-OH3。,3、二级结构为“三叶草”型（cloverleaf pattern）,小结,反密码环：反密码环中部的三个碱基可以与mRNA的三联体密码形成碱基互补配对，解读遗传密码，称为反密码子（anticodon）。I常出现于反密码子中,氨基酸臂：3末端的CCA-OH3单链用于连接该tRNA转运的氨基酸。,二氢尿嘧啶环（DHU）：识别氨酰-tRNA合成酶,TC环：识别核蛋白体（核糖体）,4、“倒L”型三级结构,（三）rRNA的结构与功能,核蛋白体的组成,*rRNA的功能:组成核蛋白体，作为蛋白质合成的场所。,（四）其他小分子RNA及RNA组

17、学,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs,snmRNAs),或非编码蛋白质的RNA(non-coding RNA,ncRNA)。,种类：核内小RNA；核仁小RNA；胞质小RNA；催化性小RNA；小片段干涉 RNA,功能：参与hnRNA和rRNA的加工和转运。ncRNA在在基因表达以及应激信号传导等方面起着重要的调节作用。因此，有人也将其称为调节RNA（regulatory RNA）。,小片段干扰RNA（siRNA；又称“引导RNAs”，guide RNAs）：一些小的双链RNA可以高效、

18、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNA interference，RNAi，也译作RNA干预或干涉）。它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。,RNAi的作用机制：包括起始阶段和效应阶段。（1）在起始步骤，生物宿主将外源基因表达的双链RNA进行切割，产生具有特定长度（19-21nt）和序列的小片段RNA；（2）在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siR

19、NA3端12个碱基的位置切割mRNA。,RNA组学研究细胞中snmRNAs的种类、结构和功能。同一生物体内不同种类的细胞、同一细胞在不同时间、不同状态下snmRNAs的表达具有时间和空间特异性。,RNA组学:,第四节 核酸的理化性质,一、酸性化合物,两性解离，但酸性强 电泳行为泳向正极（pH7-8）,二、高分子性质,粘度 DNARNA 超离心沉降 凝胶过滤 分子大小单位：分子量（道尔顿，D）、碱基对数目（bp）、离心沉降常数（S）,沉淀行为加盐（中和电荷）；乙醇,DNA和RNA中的糖苷键与磷酸酯键都能用化学法和酶法水解。并且碱基和核糖之间的糖苷键更易被水解，其中嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对

20、酸更不稳定。在很低pH条件下DNA和RNA都会发生磷酸二酯键水解。在高pH时，RNA的磷酸酯键易被水解，而DNA的磷酸酯键不易被水解。,一、核酸的水解酸碱水解,二、紫外吸收,1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度DNA纯品:OD260/OD280=1.8RNA纯品:OD260/OD280=2.0,OD260的应用,紫外吸收,最大吸收波长：260nm 核酸定量分析 核酸定性分析,三、变性、复性、分子杂交,1、DNA变性（DNA denaturation）：DNA变性是指在理化因素作用下，D

21、NA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。,DNA的变性(denaturation),方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。,变性后其它理化性质变化：OD260增高；粘度下降；比旋度下降；浮力密度升高；酸碱滴定曲线改变；生物活性改变,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,DNA变性,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,当DNA的稀盐溶液加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大

22、值的一半时溶液的温度称为融解温度（Tm）或解链温度、变性温度。,实验室常用的方法热变性,影响Tm值的因素,(1)溶液的性质,(2)DNA的性质和组成,大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线,GC含量越高，Tm越大,（1）变性后理化性质改变DNA溶液的粘度降低浮力密度增加旋光偏振光改变紫外吸收增加（高色效应）高色效应（hyperochromic effect）：DNA变性后，在260nm处的紫外吸收增高，称为高色效应或增色效应。,（2）变性后的DNA一级结构没有改变。,（3）融解温度（melting temperature,Tm）：DNA热变性过程中，紫外吸收达到最大值的一半时溶液的

23、温度称为融解温度（Tm）,GC含量越高，Tm越大DNA越长，Tm越大溶液离子强度增高，Tm值增加DNA越纯，相变范围越小,2、DNA复性,DNA复性(renaturation)的定义:在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,减色效应（hypochromic effect）:DNA复性时，其溶液OD260降低。,DNA复性,在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子

24、强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybridization),核酸的杂交,DNA-DNA杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用:研究基因的位置确定两种核酸序列的相似性检测样品中的特异序列基因芯片技术的基础,核酸探针（nucleic acid probe）:能特异性的探测带某一特定序列的DNA或RNA分子的标记核酸分子。,3、核酸分子杂交(hybridization),由不同来源的核酸单链形成杂

25、化双链的过程,分子杂交技术的应用：基因克隆筛选、酶切图谱制作、特定基因序列的定量和定性、突变分析、疾病诊断等,核酸的构象和分离,：超螺旋DNA环状DNA线状DNA蛋白质,DNA 沉降,四、沉降特性,超螺旋DNA,五、凝胶电泳,核酸研究中最常用的方法,优点：简单、快速、灵敏、成本低。,通过凝胶电泳,（1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。,（2）测定分子大小。,（3）估计核酸的构象。,凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应,1琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）,琼脂糖凝胶电泳的迁移率主要与分子大小、胶浓度、核酸构象、电流等有关。,2聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacr

26、ylamide gel electrophoresis）,用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段,适用于大分子核酸，一般用于DNA分析。,DNA marker(DL-15000)：15000，10000，7500，5000，2500，1000，250,DNA marker(DL-2000)：2000，1000，750，500，250，100,第五节 核酸酶(nucleases),核酸酶是指所有可以水解核酸的酶,一、种类,1、根据底物分类DNase、RNase；单链核酸酶、双链核酸酶、杂合双链核酸酶,2、根据催化部位分类：外切核酸酶和内切核酸酶外切酶：5端3端或3端5端核酸外切酶。内切

27、酶：限制性核酸内切酶和非限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶(restriction endonucleases)：能够识别DNA分子的特定核苷酸序列，并在识别位点或其周围断开DNA双链的一类核酸酶,限制性内切酶举例,参与DNA的合成与修复及RNA合成后的剪接等重要基因复制和基因表达过程 负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收 体外重组DNA技术中的重要工具酶,生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解,二、核酸酶的功能,三、核 酶,催化性DNA(DNAzyme)人工合成的寡聚脱氧核苷酸片段，也能序列特异性降解RNA。,催化性

28、RNA(ribozyme)作为序列特异性的核酸内切酶降解mRNA。,第六节核酸的核苷酸序列测定,DNA测序技术的发展,测序技术的发展,双脱氧末端终止法(Sanger 测序法)1970s 同位素标记，手工1980s 荧光标记，自动1990s 毛细管电泳合成测序法（第二代测序）焦磷酸测序（Pyrosequencing,Roche/454）合成测序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）连接测序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）单分子测序技术（第三代测序）HelicosPacific BiosciencesOxford Na

29、nopore,Key Genomics Technologies,1975-Southern DNA 杂交技术1977-Sanger双脱氧链终止法测序技术 Maxam、Gilberts 化学法DNA测序技术1980-自动化原位寡核苷酸合成仪1985-Cetus公司的 Mullis发明 PCR 技术1992-Affymetrix公司（Fodor的集团）的基因芯片1995-ABI公司第一代全自动测序仪2006-第二代DNA测序仪上市2007-单分子测序技术（Single molecule sequencing techniques）,第一代测序技术,双脱氧链终止法测序 通过合成与单链DNA互补的多

30、核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。化学降解法测序 将一个 DNA 片段的 5端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。,第一代DNA测序技术,成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期 1977年Sanger发明了双脱氧链终止法 同一时期,Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法 20世纪90年

31、代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代这些技术统称为第一代DNA测序技术,双脱氧链终止法,ddNTP没有3羟基，在链的延伸过程中如果插入，就会终止链的延伸。,单链模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP 存在的反应体系中能合成双链。如果这一反应体系中存在ddNTP，互补链合成过程就会终止于该ddNTP插入位点。,双脱氧链终止法,待测序的双链片段,制备单链DNA,加入反应体系,一次能确定300-500个核苷酸序列,化学降解法,放射性同位素标记5末端,限制性内切酶处理,变性,四个反应体系,一次最多只能分析250个核苷酸,荧光自动测序技术,基于Sanger测序原理 用不同荧光标记的

32、ddNTP,自动化测序,与链终止法测序原理相同。只是用不同的荧光色彩标记ddNTP。如ddATP标记红色荧光。ddTTP标记绿色荧光。ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.,第二代测序技术,以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。,Roche公司推出的 454技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Sanger测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基

33、因组学专家的广泛关注。Illumina公司推出的 Solexa遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的DNA单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时 Solexa公司提出的可逆终止子也是该技术获得认可的原因之一。与 454相比，Solexa拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Solexa理所当然成为第二代测序技术的首选。,1、聚合酶合成测序法,一、样品处理 将大片段的DNA分子片段化（超声或氮气）琼脂糖凝胶电泳回收500-800bp的片段二、文库制备,454（GS FLX）测序技术,包括接头连接和磁珠纯化 4

34、54的文库接头分A、B两种，其中B接头的5端带有生物素（Biotin）标记 经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集,三、连接磁珠四、emRCR,加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液,五、反应板准备、上机测序,454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29m，而测序磁珠的直径为20m，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一种碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。

35、这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被高灵敏度CCD捕获到。,一个磁珠一条读长,DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶5-磷酰硫酸(adenosine-5-phosphosulfat，APS)、荧光素读长230-400bp,样品处理文库制备连接磁珠emPCR反应板准备、上机测序,总结,第三代测序技术,近期出现的Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technolog

36、ies公司正在研究的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序。其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。,表1 三代测序技术特点的比较,核苷酸组成三部分核苷酸的分类与功能DNA二级结构特点核小体结构及特点RNA种类、组成及功能DNA/RNA OD260DNA变形、复性、Tm值分子杂交的应用DNA测序基本原理,第五节 核苷酸代谢,糖,脂肪,蛋白质,食物中的核苷酸大部分都将被分解，不被机体利用。人体内的核苷酸主要由机体细胞自身合成。,主要途径,合成,分解,核苷酸合成在脑,红细

37、胞和骨髓中只能进行“补救途径”。,核苷酸代谢框架,（5-磷酸核糖焦磷酸）,从头合成途径,补救合成途径,用基本原料,用半成品,第一节 嘌呤核苷酸的代谢,包括：ATP GTP,一、嘌呤核苷酸的合成,N,N,N,N,嘌呤碱合成的元素来源：,（一）嘌呤核苷酸的从头合成,1,2,3,4,5,6,7,8,9,机体利用氨基酸、二氧化碳、一碳单位及磷酸核糖等小分子物质为原料，经一系列酶促反应合成嘌呤核苷酸的过程。,IMP,甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、一碳单位、CO2、5-磷酸核糖,AMP,GMP,嘌呤核苷酸从头合成途径,PRPP,第一阶段,第二阶段,第三阶段,一磷酸次黄嘌呤核苷,R-5-P,PRPP,PRPP

38、合成酶,第一阶段：,PRPP的生成,活化过程,PRPP,5-PRA,第二阶段,IMP的生成,限速步骤,限速步骤,腺苷酸代琥珀酸,天冬氨酸,一磷酸黄嘌呤核苷,第三阶段：,由IMP生成AMP和GMP,联合转氨基中，转氨偶联嘌呤核苷酸循环脱氨作用,IMP,R-5-P,天冬氨酸,谷氨酰胺,AMP 和GMP 在激酶作用下，经过两步磷酸化反应，进一步分别生成 ATP 和GTP。,AMP ADP ATP,GAP GDP GTP,激酶,激酶,激酶,激酶,或经底物水平磷酸化,在磷酸核糖分子上逐步合成嘌呤环；PRPP是重要的中间代谢物，它不仅参与嘌呤核苷酸的从头合成，而且参与嘧啶核苷酸的从头合成及两类核苷酸的补救

39、合成。是5-磷酸核糖的活性供体；关键酶为PRPP酰胺转移酶。,嘌呤核苷酸的合成要点,调节要点：调节的机制:反馈调节 PRPP酰胺转移酶:限速酶、变构酶，有两种 形式：单体有活性，二聚体无活性。ATP和GTP分别调控GTP与ATP的相对平衡。,红细胞、脑骨髓、脾脏等组织不能从头合成嘌呤核苷酸，只能利用现成的嘌呤碱或嘌呤核苷来合成嘌呤核苷酸。,（二）嘌呤核苷酸补救合成途径,细胞利用游离碱基或核苷重新合成相应核苷酸的过程称“补救途径”,1.节省能量和减少氨基酸的消耗2.对缺乏从头合成途径的组织 具有更重要的生理意义,Lesch-Nyhan 综合症的病因？HGPRT 遗传缺陷 尿酸增加？神经系统异常！

40、,（三）脱氧核糖核苷酸的生成,(N:A、G、C、U）,还原反应是在核苷二磷酸水平（NDP）,NADPH是最终还原剂,硫氧化还原蛋白还原酶体系：2SH SS 核糖核苷酸还原酶,（四）嘌呤核苷酸抗代谢物,抗代谢物是指一些人工合成的化合物在结构上分别与嘌呤（或嘧啶），氨基酸或叶酸类似，它们主要以竞争性抑制或“以假乱真”等方式干扰或阻断核苷酸的合成代谢，从而阻断核酸以及蛋白质的合成。,1，竞争抑制HGPRT，使PRPP分子中的R-5-P不能 向嘌呤及次黄嘌呤转移，阻断嘌呤核苷酸的补救 途径。2，可在体内经核糖化生成6-MP核苷酸，抑制IMP 转变为AMP及GMP的反应。3，反馈抑制PRPP酰胺转移酶而

41、干扰磷酸核糖胺的 形成，阻断从头合成。,6-MP 的作用机制：,核苷酸分解代谢概况,核苷酸(碱基+戊糖+磷酸),注意不同碱基代谢的异同点,拆零过程,二、嘌呤核苷酸的分解,核苷酸分解代谢的三个重要的酶,核苷酸酶,核苷磷酸化酶,脱氨酶,磷酸+核苷,1-P-核糖,去氨基,+碱基,(R-1-P),嘌呤核苷酸的分解代谢,AMP,黄嘌呤氧化酶,GMP,痛风症:,体内嘌呤分解过盛，尿酸生成过多或排泄受阻，致血液中尿酸浓度增高，尿酸盐结晶在关节、软骨及肾脏等处沉积，导致关节炎、尿路结石而疼痛。,别嘌呤醇,血浆尿酸正常值0.120.36/L，（男性偏高）,次黄嘌呤,别嘌呤醇,从头合成：补救合成：,途径,原料,谷

42、氨酰胺 CO2,天冬氨酸,第二节 嘧啶核苷酸的代谢,一、嘧啶核苷酸合成,O,N,N,O,（一）嘧啶核苷酸的从头合成,C,嘧啶碱合成的元素来源,CTP,嘧啶核苷酸从头合成途径,谷氨酰胺、CO2,（含嘧啶环）,天冬氨酸氨基甲酰转移酶(ATCase),脱羧酶,乳清酸,二氢乳清酸酶,转移酶,（含高能磷酸键）,脱氢酶,转移酶,脱羧酶,激酶,CPSII,CPS I,氨基甲酰磷酸,乳清酸尿症,是嘧啶核苷酸代谢异常的遗传性疾病。,由于乳清酸磷酸核糖转移酶（OPRT）和OMP脱羧酶的缺乏导致“嘧啶饥饿症”，临床表现为尿中排出乳清酸，即乳清酸尿症,引起核酸和辅酶生成不足，生长迟缓，干扰红细胞正常生成，产生“巨红细

43、胞贫血症”,dTMP合成酶,N5,N10-CH2-FH4,dUTP dUDP dCMP,补救途径,dTMP的合成,嘧啶核苷酸+PPi,对胞嘧啶不起作用,嘧啶磷酸核糖转移酶,嘧啶核苷酸的补救途径：,干扰叶酸代谢,（三）嘧啶核苷酸抗代谢物,抗嘧啶代谢药物作用位点,（5 FU）,N,NH,O,O,5-氟尿嘧啶,F,FUTP,5-氟尿嘧啶的作用机制,影响DNA合成,嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸分解代谢的最大不同:嘌呤环不被破坏，而嘧啶环被破坏,UH2,嘧啶核苷酸的分解代谢,1、试述磷酸核糖焦磷酸（PRPP）在核苷酸代谢中的重要性。2、比较氨基甲酰磷酸合成酶I和氨基甲酰磷酸合成酶II在合成 代谢的异同？3、试讨论各类核苷酸抗代谢物的作用原理及其临床应用。4、什么是痛风症？并说明临床治疗原理。5、Lesch-Nyhan 综合症的病因是什么？HGPRT（中文名 称？）是哪个重 要途径的酶？这个途径的生理意义是什么？HGPRT的缺陷为什么会引起尿酸增多和神经系统障碍？（提 示：嘌呤核苷酸的代谢调节）。,