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1、核酸代谢,第四部分：蛋白质的生物合成（章节：8.4）,8.4 蛋白质的生物合成 Protein Biosynthesis,掌握蛋白质生物合成的概况：原料、三类RNA在蛋白质生物合成中的作用、遗传密码的概念及其特点；熟悉蛋白质的生物合成过程；了解蛋白质合成后的加工和转运方式。重点、难点：三类RNA在蛋白质生物合成中的作用、遗传密码的概念及其特点；蛋白质合成的基本过程。,A G C C T G,U C G G A C,Ser Asp,以mRNA为模板的蛋白质合成过程被称为翻译（translation)。,Translation is the second step of gene expressi
2、on蛋白质合成的场所是核糖体(Ribosomes)原料是20种L-氨基酸，反应所需能量由ATP、GTP提供，此外还有Mg2+、K+等金属离子参与。蛋白质合成体系主要由mRNA、tRNA、rRNA、有关的酶以及几十种蛋白质因子组成。,蛋白质合成体系的组分,遗传密码mRNAtRNArRNA和核糖体参与合成的蛋白因子,8.4.1 遗传密码 Genetic Code,mRNA分子中四种不同碱基（A、G、C和U）构成特定顺序决定蛋白质分子中20种AA所构成的序列。mRNA上相邻三个碱基编码一种AA，因而被称为碱基三联体或密码子。四种核苷酸，能有43=64组密码子1966年已经完全查清了20种基本氨基酸所
3、对应的61个密码子，其中有一个密码子也作为肽链合成的起始密码子,另外还有三个终止密码子。,遗 传 密 码,Third letter,书本209面,8.4.1.1遗传密码的特点密码子的方向性 密码子的阅读方向为5-3，与mRNA链合成时延伸方向相同。密码子的简并性 大多数的aa都有几组不同的密码子，Trp及Met只 有一个密码子。一个氨基酸可以由几种不同密码子编码：简并性编码同一氨基酸的密码子：同义密码子简并性可以减少有害的突变,（3）密码子的摆动性（变偶性）密码子的专一性基本取决于前两位碱基，第三位碱基有较大灵活性,如Ala：GCU，GCC，GCA，GCG。tRNA上的反密码子与mRNA上的密
4、码子配对时，密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的，第三位碱基可以有一定变动，这种现象称为密码的摆动性或变偶性（wobble）。,（4）密码子的连续性（读码）（无标点、无重叠）读码框是连续的，若：移码，则：移码突变。,（5）密码子的基本通用性（近于完全通用，普适性）对于高等、低等生物都适用。例外：真核生物线粒体DNA。一些原核生物中利用终止密码翻译AA（如：支原体UGA-Trp）,无间隔、不中断,密码子,反密码子,（6）起始密码子 AUG-Met 终止密码子：UAG、UAA、UGA（无义密码子）终止密码子：核糖体遇到这三个密码子则蛋白质终止合成 起始密码子：mRNA的第一个AUG密码子,8.4
5、.1.2阅读框架,mRNA分子的序列是以3个核苷酸一组，从5端开始阅读，那么有3种可能的阅读框架，但是实际上，通常只有一种阅读方式产生有功能蛋白，另外的2种含有几个终止密码子一段碱基通常只编码单一的蛋白质正确阅读框架：核糖体识别在编码序列开头处的起始密码子AUG,1）mRNA结构 1.原核mRNA结构 在起始密码子AUG上游9-13个核苷酸处，有一段可与核糖体结合、富含嘌呤的3-9个核苷酸的保守序列AGGA，此序列称SD序列。它与核糖体小亚基内16S rRNA的3端一段富含嘧啶的序列GAUCACCUCCUUA-OH互补，使得结合于小亚基上的起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG。
6、,8.4.2 mRNA,SD序列与16S rRNA结合,2.真核mRNA结构 真核mRNA具有m7GpppN帽子结构，无SD序列。帽子结构具有增强翻译效率的作用。若起始AUG与帽子结构间的距离太近（小于12 个核苷酸），就不能有效利用这个AUG，会从下 游适当的AUG起始翻译。当距离在17-80个核苷 酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。,真核mRNA具有“第一AUG规律”，即当5端具有数个AUG时，其中只有一个AUG为主要开放阅读框架的翻译起点。起始AUG二个特点：（1）AUG上游的-3经常是嘌呤，尤其是A。（2）紧跟AUG的+4常常是G。起始AUG邻近序列中，以ANNAUGGN的频率最高。
7、若-3不是A，则+4必须是G。无此规律的AUG，则无起始功能。,8.4.3 tRNA 同工tRNA:一种氨基酸可以有一种以上tRNA作为运载工具。把携带相同氨基酸而反密码子不同的一组tRNA称为同工tRNA。（20种氨基酸，60-120种tRNA）,3,tRNA分子有二个功能:A.专一性地结合氨基酸，生成氨酰-tRNA，使氨基酸活化。B.识别氨基酸密码子，依靠核糖体的特定位点对 mRNA的密码子进行识别。每一个细菌细胞内约有60种不同tRNA（至少有31-32种），真核细胞内可达100-120种。,校正tRNA,某些tRNA能校正基因的有害突变，称为校正tRNA。校正tRNA通常由于反密码子的
8、突变，破坏了译码规则，不按常规引入AA，却恰好起到了校正功能。回复突变（reverse mutation）：突变型生物重新获得其原有的性状。如：mRNA：5GAG（Gln）3 UAG（无义突变）tRNATyr上的反密码子为：3AUG 5 tRNATyr反密码子突变：3AUC 5，它可以将mRNA上的UAG读成Tyr，从而使肽链继续合成。,核糖体是蛋白质合成的场所。核糖体是由几十种蛋白质和几种rRNA组成的亚细胞颗粒,其中蛋白质与rRNA的重量比约为1:2。,真核生物：游离核糖体或与内质网结合原核生物：游离核糖体或与mRNA结合成串状的多核糖体(提高翻译效率)。,8.4.4rRNA及核糖体,细菌
9、mRNA 寿命很短，mRNA必须以最高效率被翻译。翻译的高效性表现在两方面：a转录和翻译偶联 b多个核糖体翻译同一条mRNA链,1.不同来源核糖体的大小和rRNA组成,原核生物,核糖体（S),亚基（S),rRNA(S),真核生物,在16S rRNA的3端有一段富含嘧啶的序列，可以识别、结合mRNA的S.D序列。,P,A,5,3,E.coli.中，30S的小亚基能单独与mRNA结合成30S核糖体-mRNA复合体，后者与tRNA可以专一性结合。,核糖体大亚基两个tRNA的结合部位（大肠杆菌）P位和A位，二者紧密连接，各占一个密码子的距离。P位：结合起始氨酰-tRNA和肽酰-tRNA，A位：结合新掺
10、入的氨酰-tRNA。,核糖体结构模型 50S 亚基上有两个tRNA位点：氨酰基位点（A）和肽酰基位点（P）。50S与30S接触面上有一个mRNA结合位点。,8.4.5参与蛋白质合成的辅助因子（大肠杆菌）蛋白质合成体系中，有一些蛋白质因子，在蛋白质合成的不同阶段起作用。主要有：起始因子、延长因子、终止因子（或释放因子）。此外还有ATP、GTP、Mg2+等参与。原核：Initiation Factor（IF1,IF2,IF3）Elongation Factor（EF-Tu,EF-Ts,EF-G）Termination/Releasing Factor（RF1,RF2,RF3）,IF1:协助IF2、
11、IF3起作用1、起始因子 IF2:促进氨酰-tRNA结合在起 始密码子上 IF3:促进小亚基与mRNA结合（起始因子协助起始复合物的形成）2、延长因子（促进肽 链延长）,EF-Tu:将氨酰-tRNA结合在核糖体A位点EF-Ts:重新生成EF-Tu-GTPEF-G:依赖于GTP，又称移位因子，协助核糖体移位,RF1：识别终止密码子UAA和UAG3.终止/释放因子 RF2：识别终止密码子UAA和UGA RF3：刺激RF1和RF2活性，协助 肽链释放,不识别终止密码子,真核终止因子：RF一种。识别三个终止密码子,原核,8.4.6 蛋白质的合成过程,氨基酸的活化 肽链合成的起始 肽链的延伸 肽链合成的
12、终止与释放,8.4.6.1氨基酸的活化-合成氨酰-tRNA,氨基酸的活化是指各种参加蛋白质合成的AA与携带它的相应的tRNA结合成氨酰-tRNA合成氨酰-tRNA的过程。活化反应在氨酰-tRNA 合成酶的催化下进行。,氨基酸在掺入肽链前，必须活化，获得足够的能量。,氨基酸活化的总反应式是：,氨基酸+ATP+tRNA+H2O 氨酰-tRNA+AMP+PPi 书写如：Ile-tRNAIle异亮氨酰-tRNAIle每一种AA都有各自特异的氨酰-tRNA合成酶。氨酰-tRNA合成酶具有高度的专一性，它既能识别相应的氨基酸（L-构型），又能识别与此氨基酸相对应的一个或同工tRNA 分子；即使AA识别出现
13、错误，此酶具有水解功能，可以将其水解掉。酶高度的专一性保证了蛋白质的合成具有一定的保真性。,氨酰-tRNA合成酶,tRNA与多肽合成的有关位点,可以说tRNA是一个万能接头：（1）对氨酰-tRNA合成酶的识别位点（接头合成酶）（2）3端-CCA上的氨基酸运载位点（接头氨基酸，装载）（3）对核糖体的识别位点（将氨基酸运送到目的地）（4）反密码子位点（接头mRNA，验货并卸载）,氨酰-tRNA合成酶,氨酰基-tRNA的合成,图 氨酰-tRNA,氨基酸一旦与tRNA形成氨酰-tRNA后，氨基酸的去向就完全由tRNA决定。,8.4.6.2原核生物蛋白质肽链的合成 1.起始 A.起始AA大肠杆菌中,起始
14、密码子AUG 所编码的氨基酸并不是甲硫氨酸本身,而是甲酰甲硫氨酸（fMet-tRNAf）。原核细胞中有两种携带Met的tRNA：tRNAf和tRNAm,真核生物：Met-tRNAMet。真核生物无甲酰化过程，起始氨基酸是Met,只有一种携带Met的tRNA，即Met-tRNAMet。,Met-tRNAf+N10-甲酰FH4 fMet-tRNAf+FH4,甲酰化酶,B.70S起始复合物的形成 30S复合物的形成:核糖体30S小亚基在IF3帮助下，识别、结合mRNA上的SD序列。在IF1和IF2的参与下，30S-mRNA-IF3进一步与fMet-tRNAf、GTP结合，并释放IF3，形成30S复合
15、物：30S-mRNA-fMet-tRNAf 30S复合物与50S核糖体结合形成70S复合物，并释放GDP、IF1和IF2。,原核起始复合物,1、mRNA就位,2、起始tRNA结合,3、大亚基结合,2.肽链的延伸,分为三步：1)新氨酰-tRNA入位 新的氨酰-tRNA进入A位。需要消耗GTP，并需EF-Tu,EF-Ts两种延伸因子。延伸因子EF-Tu结合GTP后，协助氨酰-tRNA的就位。氨酰-tRNA入位后，EF-Tu-GDP从核糖体上释放下来，在第二个延伸因子EF-Ts帮助下EF-Tu-GDP释放掉GDP并重新结合一分子GTP再生成EF-Tu-GTP，进入下一轮循环。,所有氨酰-tRNA必须
16、与EF-Tu-GTP结合才可进入核糖体A位，除了fMet-tRNAf,1.入位,2)转肽 在肽酰转移酶的作用下，A位点新氨酰-tRNA氨基亲核攻击P位点上fMet-tRNAf的酯键羰基，形成肽键，无负荷的tRNA留在P位，此时A位点携带一个二肽。,2.转肽,3)移位在EF-G（移位酶）的作用下，核糖体沿mRNA5 3方向移动一个密码子的距离，结果使原来在A上的肽酰-tRNA移到了P位点，原来在P位点的无负载的tRNA离开核糖体，同时一个新的密码子进入空的A位，EF-G 催化的移位过程需水解GTP提供能量。,3.移位,以上三步为一个延伸循环，肽链每掺入一个氨基酸就重复一次延伸循环。肽链合成从N-
17、C,方向（mRNA、肽链）：mRNA从5端向3，多肽从N端向C端。速度：E.coli.每秒约15个氨基酸。,3.肽链合成的终止与释放当终止密码子出现在A位时，RF结合在A位，肽链合成终止。,RF的结合使肽酰转移酶活性变为酯解酶活性，使肽基释放，无负荷的tRNA随机从核糖体脱落，该核糖体立即离开 mRNA，在RF3下,消耗GTP而解离为30S和50S。,蛋白质的合成是一个高耗能过程：第一个肽键形成（合成一个二肽）高能键 甲酰-甲硫氨酰-tRNA ATP-AMP 2 70S起始复合物 GTP-GDP 1 a.a-tRNA ATP-AMP 2 a.a-tRNA进入核糖体 GTP-GDP 1 核糖体移
18、位 GTP-GDP 1,延伸循环,第一个二肽的形成需消耗7个高能磷酸键，以后每掺入一个AA需要消耗4个（活化2+进位1个+移位1个）。最后终止需耗1个GTP。例：合成200个氨基酸残基组成的多肽，需要多少个高能磷酸键？7+1984+1=800 4n=4200=800,8.4.6.3真核生物蛋白质的生物合成,真核与原核蛋白质肽链合成的区别：1.核糖体不同 真核：80S（40S+60S），原核：70S（30S+50S）。2.起始tRNA不同 真核：Met-tRNAm 甲硫氨酸 原核：fMet-tRNAf 甲酰甲硫氨酸 3.起始密码子 真核 AUG，原核 AUG（有时用GUG）。4.起始因子 真核e
19、IF 复杂，至少有9种；真核CBP帽子结合蛋白（cap-binding protein）。5.真核生物mRNA中AUG前无SD序列。,一、翻译后的加工1、切除加工N末端的(甲酰)甲硫氨酸的切除.在去甲酰酶催化下将肽链合成的起始氨基酸-甲酰甲硫氨酸水解脱掉甲酰基，以便肽链形成所需的构象.在氨肽酶催化下切去N末端一个或几个氨基酸。多肽链还未释放时，上两个过程已发生。而真核生物15-30氨基酸时，就已开始上过程。,8.4.7 多肽合成后的加工和定向输送,蛋白质内含子切割：90年代初，发现了两类新的内含子。翻译内含子：mRNA中存在与内含子对应的核苷酸序列，在翻译过程中这一序列被“跳跃”过去，产生的多
20、肽链不含有内含子对应的氨基酸序列。蛋白质内含子：其DNA序列与外显子一起转录和翻译，产生一条多肽链，然后从肽链中切除与内内含子对应的氨基酸序列，再把与外显子对应的氨基酸序列连接起来，成为有功能的蛋白质。,成熟蛋白质 有核酸内切酶活性,Intein Extein Intein,前体胰岛素,胰岛素原,胰岛素,信号肽的切除,2、氨基酸侧链的修饰3、加辅基4、二硫键的形成,在真核生物中，许多加工修饰过程都是发生在特定的细胞器中。例如蛋白质的糖基化就需要存在于内质网和高尔基体中的酶。故新合成的蛋白质通过细胞质向不同细胞器的转移，这种转移称为蛋白质运输或寻靶。新生多肽的运输是定向进行的。大肠杆菌的新生肽一
21、部分留在胞质中，一部分送至质膜、外膜，还可分泌至胞外。真核新生肽一部分在胞质中，另一部分送往溶酶体、高尔基体、线粒体、叶绿体、细胞核等。,二、多肽的定向输送,一）蛋白质的跨膜转运与肽链折叠,1.膜蛋白与分泌蛋白的跨膜转运 信号肽（signal sequence）,信号识别体（signal rccognition particle，SRP）:识别信号肽的核蛋白体。由一分子7SL RNA和6个不同的多肽分子组成。7SL RNA上有两段核苷酸序列，称Alu序列。SRP功能（两个功能域）:A.识别信号肽 B.干扰氨酰-tRNA及肽酰转移酶，暂时终止 多肽链的延伸。C.与停泊蛋白结合。,SRP受体停泊蛋
22、白（docking protein DP）:在内质网上与SRP-核糖体复合物专一性结合 的蛋白质。DP的功能：引起内质网膜上特定的核糖体受 体蛋白聚集，后者具有通道功能，可使转译出的 肽链进入内质网膜腔内。信号肽的识别过程（图）,图：信号肽的识别过程,信号肽的识别过程,信号肽序列,2.伴侣蛋白（molecular chaperone）与肽链折叠 多肽链必须正确折叠才具有天然构象。折叠 过程在伴侣蛋白（分子伴侣）辅助下完成。伴侣蛋白广泛分布于原核及真核细胞中。hsp70、hsp60和hsp90的功能：A.与肽段结合，介导蛋白质正确折叠。B.与胞质中新合成的线粒体、叶绿体蛋白结合。保持肽链伸展，利
23、于跨膜转运。C.应激状态下，与变性蛋白结合，防止聚集。,Fig.Molecular chaparones,二、内质网上多肽的糖基化修饰,多肽经移位后，在内质网的小腔中被修饰。包括信号肽的切除、二硫键的形成、糖基化作用等。糖基化作用使多肽链转变成糖蛋白。O-糖苷，Ser，Thr。N-糖苷，Asn。,三、高尔基体中多肽的糖基化修饰及多肽的分拣,高尔基体的功能：对糖蛋白上的寡聚糖进一步修饰。将多肽进行分类，并送至溶酶体、分泌粒、质膜等目的地。分拣信号：溶酶体，甘露糖-6-磷酸；过氧化体，羧端SKF；内质网，羧端Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL序列）；细胞核，碱性氨基酸残基；线粒体，两个信号序
24、列。,四、线粒体、叶绿体蛋白质的来源,线粒体、叶绿体的DNA基因组，可编码各自 全部的RNA，但只编码各自一小部分蛋白质。大部分线粒体、叶绿体蛋白质由核基因编码，在胞质中合成后，再分别送至这些细胞器中。,多肽的两种转运机制：（1）翻译转运同步机制（cotranslational transfer）分泌蛋白、质膜蛋白、溶酶体蛋白、内质网和高尔基体滞留蛋白等。合成含信号肽的部分肽段后就结合到内质网上，然后边合成边进入内质网腔，经初步加工和修饰后，部分多肽以芽泡形式被运往高尔基体，再经进一步的加工和修饰后被运往质膜、溶酶体或被分泌到胞外。（2）翻译后转运机制（posttranslational translocation）叶绿体蛋白和线粒体蛋白。通过新生肽的信号序列（引导肽Leader peptide）直接运往目的地并被加工。,
