第12章 DNA的生物合成课件.ppt

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1、第12章,DNA的生物合成,DNA Biosynthesis,2023年4月2日9时25分,1,2023年4月2日9时25分,2,第5节 DNA损伤（突变）与修复,第4节 反转录和其他复制方式,第3节 DNA复制的基本过程,第2节 DNA复制的酶学和拓扑学变化,第1节 DNA复制的基本规律,第12章 DNA的生物合成,1865年，奥地利生物学家孟德尔(Mendel)总结8年的豌豆杂交实验提出：“hereditary factor(遗传因子)”决定生物性状、分离定律和自由组合定律。,1910年，美国生物学家摩尔根(Morgan)对果蝇进行系统研究，提出基因在染色体上直线排列、连锁遗传和连锁交换定

2、律。1933年获诺贝尔奖。,1909年，丹麦生物学家约翰逊(Johannsen)进行了年的菜豆自交与纯系实验；据希腊文“给予生命”之义，最先用“基因”替代了“遗传因子”。,2023年4月2日9时25分,3,1.基因概念的提出和发展,1928年格里非斯(Griffith)，1944年艾弗里(Avery)的肺炎双球菌遗传转化实验，证实了遗传物质是DNA而不是蛋白质。,2023年4月2日9时25分,4,2.遗传物质化学本质的探索,1952年赫尔希(Hershey)和沙斯(Chase)的T2噬菌体侵染细菌实验进一步证明携带遗传信息的是DNA。与德尔布吕克(Delbrck)和鲁利亚(Luria)同获19

3、69诺贝尔生理医学奖。,1951年，鲍林(Pauling)，威尔金斯(Wilkins)和富兰克林(Franklin)用X线晶体衍射技术发现了蛋白质双链螺旋结构。Franklin DNA X射线衍射图谱即将面世。,1952年，查戈夫(Chargaff)等用层析和紫外光谱分析技术发现：A=T，G=C；不同种属DNA的4种碱基组成不同；同一种属不同组织的DNA碱基组成相同。,1953年4月，Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，Nature杂志上发表。同一杂志上还发表了Franklin的DNA X射线衍射图谱，及Wilkins的DNA X射线衍射分析数据。,2023年4月2日9时25分

4、,6,3.DNA分子的双螺旋结构模型提出,DNA,RNA,Protein,中心法则The Central Dogma1958 F.Crick,中心法则的补充：1965年发现RNA复制1970年发现逆转录酶,2023年4月2日9时25分,7,4.中心法则的提出和发展,复制的基本规律,第一节,Basic Rules of DNA Replication,2023年4月2日9时25分,8,学习要求：,掌握复制及其基本规律、半保留复制、双向复制、半不连续性复制、复制叉、复制子、领头链、随从链、冈崎片段的概念。熟悉半保留复制的实验依据。,DNA复制的概念:,2023年4月2日9时25分,9,DNA复制是

5、一个由多种酶催化，多种蛋白因子参与，并且受到精密调控的复杂过程。E.coli 染色质的复制涉及约30种蛋白质。,指遗传物质的传代，是以母链DNA为模板，按碱基配对的原则,合成两个完全相同的子链DNA分子的过程。,复制的基本规律,半保留复制(semi-conservative replication),双向复制(bidirectional replication),半不连续复制(semi-discontinuous replication),2023年4月2日9时25分,10,一、半保留复制,DNA复制时，母链DNA解开成两股单链作为模板，按碱基配对规律合成与模板互补的子链；形成的2个子代DNA

6、中，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成；2个子代DNA碱基序列都和亲代DNA的一致。,Watson and Crick,1953.,亲代DNA,子代DNA,模板,荣获1962年诺贝尔医学与生理学奖。,图12-1 DNA复制理论上有三种可能形式,2023年4月2日9时25分,12,1958,M.Mmlson&F.W.Stahl设计的实验,2023年4月2日9时25分,13,1958,M.Messelson&F.W.Stahl设计的实验,2023年4月2日9时25分,14,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性

7、。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,2023年4月2日9时25分,15,二、双向复制,DNA复制从固定的复制起始点(origin，ori)开始，分别向两个方向进行解链、复制，称为双向复制。,复制叉,复制叉,5,3,5,5,3,3,5,3,3,5,原核DNA：单点双向复制,2023年4月2日9时25分,16,ori是指DNA复制起始时必需的一段特殊DNA序列。共同特征：,这些短重复序列被多亚基的复制起始因子(DnaA；RC:origin recognition complex)所识别并结合；,一般富含AT，利于双螺旋DNA解旋解链产生单链 DNA。,由多个

8、独特的短重复序列组成；,E.Coli的称ori C，由245 bp的保守序列和控制元件组成；酵母的称自主复制序列(autonomously replicating sequence,ARS),含含11 bp富含AT的核心序列。,2023年4月2日9时25分,17,真核DNA：多点双向复制,两个相邻复制起始点之间的距离定为一个复制子长度。,2023年4月2日9时25分,18,复制子(replicon)：独立完成复制的功能单位。,三、复制的半不连续性,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),2023年4月2日9时25分,19,半不连续性 复制过程中，领头链连

9、续复制，而随从链不连续复制的现象。冈崎片段(okazaki fragment)指不连续复制的片段 原核:10002000 个核苷酸（nt）(相当于1个顺反子，即基因的大小)真核:100200个核苷酸（nt）(相当于1个核小体DNA的大小),2023年4月2日9时25分,20,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第二节,The Enzymology of DNA Replication,2023年4月2日9时25分,21,学习要求：,掌握参与DNA复制的主要物质种类，原核和真核生物DNA聚合酶作用、种类及特点，拓补异构酶、引物酶、单链DNA结合蛋白和DNA连接酶的作用和特点。熟悉DNA复制的化学反应、

10、保真性的酶学依据。了解DNA聚合酶的分子结构特点，复制中DNA分子的拓补学变化。,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；(dNTP)聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。,参与DNA复制的物质:,2023年4月2日9时25分,22,一、复制的化学反应,(dNMP)n,+dNTP,(dNMP)n+1,+PPi,DNA pol,活性：1.53 聚合酶活性，需要引物；2.35核酸外切酶活性。,二

11、、DNA聚合酶,是指以DNA作为模板，催化底物dNTP合成DNA的一类酶。,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,2023年4月2日9时25分,24,DNA-pol 的53聚合作用,2023年4月2日9时25分,25,35外切酶,5 3外切酶,5,3,内切酶,35外切酶,5 3外切酶,外切酶与内切酶作用图解,2023年4月2日9时25分,26,（一）原核生物的DNA聚合酶,共同点：1.53 的聚合活性，需要引物；2.35 外切酶活性。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,不同点：DNA-pol还有53外切酶活

12、性。,2023年4月2日9时25分,27,大肠杆菌三种DNA聚合酶性质与功能,2023年4月2日9时25分,28,功能：对复制中的错误进行校读，对复制 和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol(109kD),2023年4月2日9时25分,29,1959年诺贝尔生理学医学奖得主,DNA-pol I 53外切酶活性的功能,切除引物，切除突变片段,2023年4月2日9时25分,30,DNA-pol I 35外切酶活性的功能,校读（proofread）功能,将错配的核苷酸从引物链的3端除去,2023年4月2日9时25分,31,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,

13、604个氨基酸,5核酸外切酶活性；DNA聚合酶活性,N 端,C 端,DNA-pol酶切片段,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,2023年4月2日9时25分,32,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活；对模板的特异性不高；它参与DNA损伤的应急状态修复。,2023年4月2日9时25分,33,*是由A.Kornberg的二儿子Tom B.Kornberg发现的。,DNA-pol(含10多个亚基的异二聚体),核心酶:由、构成,2023年4月2日9时25分,34,功能:,原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-po

14、l 同时合成领头链和随从链,2023年4月2日9时25分,35,（二）真核生物的DNA聚合酶,2023年4月2日9时25分,36,三、复制的保真性(fidelity),（1）严格按照碱基配对规律外进行复制，突变率约为1/103；,（2）DNA聚合酶对模板的依赖性和对碱基的选择，是子链与母链能准确配对(突变率1/1045)，使遗传信息延续和传代的保证；,（4）DNA修复系统和复制起始必须利用引物等机制，使突变率由1/1068降低到1/10910。,（3）DNA聚合酶 35外切酶功能和53聚合酶活性实现的即时校读(proofread)，可使突变率由1/1045降低到1/1068；,2023年4月2

15、日9时25分,37,四、复制中的解链和DNA分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用；因此，DNA复制涉及DNA双螺旋构象变化及解链过程。,2023年4月2日9时25分,38,种类：解旋酶、和rep蛋白,解旋酶、：沿着随从链的模板，从5 3方向，促使复制叉向前延伸；,rep蛋白(六聚体)：沿着领头链的模板，从3 5方向向前移动，促使双链不断解开；,（一）解螺旋酶和单链DNA结合蛋白,解螺旋酶(helicase),又称解链酶，利用ATP供能，作用于氢键，使双螺旋DNA解旋和解链成为两条单链。,2023年4月2日9时25分,39,解螺旋酶和单链DNA

16、结合蛋白协同作用,单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,2023年4月2日9时25分,40,（二）引物酶(primase),所有细胞和多数病毒的DNA复制，都须首先利用DNA模板合成一段被称之为引物的，长度从几个到几十个核苷酸的，短链RNA序列，为DNA聚合酶提供游离3-OH端合成DNA链。,原核细胞的引物酶是一种仅用于DNA复制所需引 物合成的RNA聚合酶；,真核细胞的引物酶是DNA聚合酶的两个小亚基。,G4噬菌体等利用宿主菌引物酶合成引物，M13噬 菌体则利用细菌RNA聚合酶合成

17、引物。,2023年4月2日9时25分,41,反转录病毒利用宿主细胞tRNA的3-OH端 作为反转录引物；,线粒体DNA复制利用RNA聚合酶的转录产物 3-OH端作为引物；,X174噬菌体利用环形双链DNA中一条链的 切口处为DNA聚合酶提供游离3-OH端。,特殊形式的引物：,2023/4/2,42,2023年4月2日9时25分,42,是一种可逆的核酸酶，它既能水解DNA分子中的磷酸二酯键，又能将其重新连接；可快速消除DNA解链过程中所产生的正超螺旋累积，使复制叉能够顺利前进。,（三）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase,Topo),2023年4月2日9时25分,43,2023年

18、4月2日9时25分,44,拓扑异构酶可快速消除DNA解链过程中所产生的正超螺旋累积，使复制叉能够顺利前进。,原核和真核生物都发现了三类拓扑异构酶：,Topo、Topo和近期发现的Topo；Topo 只消除负超螺旋，而且活性较弱。,原核生物：Topo将前方的正超螺旋转变为负超螺旋；Topo使DNA变为松弛状态，与转录有关。,真核生物：Topo和Topo都能清除前方的正超螺旋。,作用：通过切断、旋转和再连接，理顺DNA链。,2023年4月2日9时25分,45,DNA正超螺旋与负超螺旋,负超螺旋,DNA双螺旋,正超螺旋,原核Topo,原核Topo,真核Topo、,DNA聚合酶,2023年4月2日9时

19、25分,46,切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。,不需ATP，切割双链DNA中的一条链，使DNA松弛后,连接切口。,Topo:,Topo：,临床上使用的某些抗肿瘤药(如喜树碱、鬼臼乙叉甙等)可通过抑制Topo酶活性而杀死肿瘤细胞。,作用机制,2023年4月2日9时25分,47,五、DNA连接酶(DNA ligase),由RNase H与DNA-pol外切酶活性除去冈崎片段中的RNA引物，间隙由DNA-pol填补成DNA，缺口由DNA连接酶催化相邻冈崎片段间的3-OH和5-P形成磷酸二酯键而连成完整的DNA链。,注意：只能连接碱基互补基础上双链中

20、的单链缺口；而对单独存在的DNA单链或RNA单链没有连接的作用。,AMP+PPi,2023年4月2日9时25分,48,连接酶连接模板链上相邻两个片段的切口,2023年4月2日9时25分,49,在复制中起最后接合缺口(双链中的单链 缺口)的作用；在DNA修复、重组及剪接过程中起缝合缺 口的作用；基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶功能,2023年4月2日9时25分,50,参与DNA复制的主要因子和酶,2023年4月2日9时25分,51,DNA生物合成过程,第三节,The Process of DNA Replication,2023年4月2日9时25分,52,学习要求：,掌握原核生物DNA复

21、制过程和各阶段的特点；掌握端粒和端粒酶概念，熟悉真核生物DNA复制过程和各阶段的特点；熟悉复制起始、引发体、负超螺旋等概念。了解端粒延长机制。,（一）复制的起始(initiation),一、原核生物的DNA生物合成,复制是一个连续的过程，根据复制的特点，人为分成起始、延长和终止三个阶段。,引物合成,DNA解链,引发体生成,1.DNA复制起始点的辨认结合与解链,原核生物DNA的复制有一个特定的复制起始点；E.coli的复制起始点称为oriC，由245 bp的保守序列和控制元件组成。,2023年4月2日9时25分,53,上游有3组13 bp串连重复序列能被DnaB(解螺旋酶)和DnaC蛋白识别结合

22、,下游有2对9 bp反向重复序列能被DnaA蛋白(起始因子)识别结合,复制起始辨认oriC并解链主要需要6种蛋白因子：,DnaA(起始因子)、DnaB(解螺旋酶)、DnaC、HU(类组蛋白)、拓扑酶(即促旋酶)和SSB,2023年4月2日9时25分,54,Arrangement of sequences in the E.coli replication origin,oriC.*DUE:DNA unwinding element.,Model for initiation of replication at the E.coli origin,oriC.Eight DnaA protein

23、molecules,each with a bound ATP,bind at the R and I sites in the origin.,引物,3,5,3,5,引物酶,引物酶,SSB,引物,SSB,HO3,(Dna B),(DnaG),(DnaG),引发体：含有解螺旋酶(DnaB)、DnaC蛋白、引物酶(DnaG)和DNA复制起始区域的复合结构。,引 物：是由引物酶催化合成的短链 RNA分子,能提 供3-OH。,2.引发体的形成和引物,2023年4月2日9时25分,56,（二）复制的延长(elongation),复制延长指在DNA-pol 催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或

24、延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,2023年4月2日9时25分,57,领头链：合成一段RNA引物（比冈崎片段的引物 略长），开始合成后通常一直继续下去。,2023年4月2日9时25分,58,随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎 片段。,2023年4月2日9时25分,59,领头链：合成一段RNA引物（比冈崎片段的引物略 长），开始合成后通常一直继续下去。,随从链：分段进行，需要不断合成RNA引物和冈崎 片段。,2023年4月2日9时25分,60,在营养丰富培养基，E.Coli 每20分钟即可分裂一次；其基因组碱基数为4.6106 bp,DNA为单点双向复制，可推算出复

25、制速度约115 kb/min(1,900 bp/s)；,真核染色体DNA为多点双向复制，复制叉移动速度约13 kb/min(1650 bp/s)；复制子长度为100200 kb，约3060分钟内完成复制(25110 bp/s)；完成染色体复制时间通常要用68小时。,2023年4月2日9时25分,61,1.原核生物基因是环状DNA，双向复制的汇合 点就是复制的终止点。,（三）复制的终止,2023年4月2日9时25分,62,2.终止区含有多个约22 bp的终止子(termi-nator,ter),识别结合ter序列的是Tus蛋白。,Tus(terminus utilization substanc

26、e)蛋白具有反解旋酶活性，Tus-ter复合物可以抑制DnaB蛋白的解旋作用，阻止复制叉前进。,Tus蛋白除了使复制叉停止运动以外，还可能造成复制体解体；解体后大约仍有10100 bp未被复制，这时通过修复方式填补空缺。,2023年4月2日9时25分,63,3.随从链上不连续性片段的连接,2023年4月2日9时25分,64,When DNA replicated,its strands are separated by the enzyme helicase.Single strand DNA binding protein keeps the strand from re-annealing

27、.One DNA strand we called the leading strand,which form from 5 prime to 3 prime end,using DNA polymerase III,no problem here.But the lagging strand presents problem.It has formed from 5 prime to 3 prime too.It forms pieces called Okazaki fragments.First a RNA primase lays down the RNA primer,then DN

28、A polymerase III lays down new DNA.the process repeats again and again.DNA polymerase I replaces the RNA primer ith DNA,finally DNA ligase links the Okazaki fragments.,原核生物的DNA生物合成,2023年4月2日9时25分,65,二、真核生物的DNA生物合成,复制起始点多、冈畸片段短、复制叉前进速度慢等特点，最重要的是参与复制的酶种类、数量更多更复杂。,细胞完成一轮分裂的过程称为细胞周期(cell cycle)，分为4期；在良好

29、营养条件下培养细胞，历时约24小时。复制仅发生在细胞分裂的合成期(S期)，而且只复制一次。,2023年4月2日9时25分,66,（一）复制的起始（与原核生物比较）,1、过程同原核生物：解链 引发体形成 生成引物,2、特点：起始点称自主复制序列(autonomous replication sequence,ARS),结构较ori C短(酵母：为150 bp 含有 11 bp富含AT的 核心序列的片段;被ORC(origin recognition complex)识别结合。多起点（多复制子）时序性（分组激活，非同步进行）,2023年4月2日9时25分,67,3、参与酶和蛋白因子：DNA-pol

30、（引物酶活性）DNA-pol（解螺旋酶活性）拓扑异构酶 复制因子(RF，如：RFA、RFC)增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA),4、通过细胞周期实现其调节：蛋白激酶磷酸化激活各种RF而调控细胞周期进入S期，相关cyclin和CDK相互作用，实现对DNA复制的多样化和精确的调节。,2023年4月2日9时25分,68,ARS,ARS：自主复制序列，为150bp含11bp富AT核心序列的片段。,复制起始分两步：,G1期，ORC对ARS的识别结合及前复制复合物(pre-RC)的形成：ORC识别结合ARS、Cdc6与ORC结合、MCM 27成

31、环状复合体，组装成pre-RC。,S期，pre-RC磷酸化激活：CDK 使pre-RC磷酸化激活，复制起点DNA解旋、募集DNA聚合酶，起始复制。,Cdc6:Cell division cycle 6，细胞分裂周期蛋白6,MCM:minchromosome maitenance proteins，小染色体维持蛋白,领头链,5,3,3,5,随从链,（二）复制的延长,DNA-pol：在PCNA和RF-C协同下，替代DNA-pol继续催化领头链和随从链合成。,DNA-pol：催化10个碱基引物和头2030个碱基组成的DNA合成；,2023年4月2日9时25分,70,35,35,53,注：当随从链延长

32、了大致相当于一个或若干个核小 体的长度(135 bp，或135 bp的若干倍)就要重 新合成引物长度。,2023年4月2日9时25分,71,5P,HO3,P5,3 OH,P5,HO3,5P,3 OH,真核生物染色体DNA是线性结构，染色体两端新链的引物被去除后，分别留下一段空隙和一段单链DNA母链。,（三）复制终止和端粒酶,引物水解（RNA酶）补缺（DNA-pol）连接（连接酶）,1、复制终止基本过程,2023年4月2日9时25分,72,两端单链DNA母链不填补成双链，就会被核内DNase酶解，造成子代染色体末端缩短。,某些低等生物出现少数特例，经多次复制后的染色体越来越短，造成末端相邻的一些

33、重要基因丢失、遗传信息完整性破坏。,2023年4月2日9时25分,73,端粒(telomere),是指真核生物染色体末端DNA 与它的结合蛋白紧密结合而形成的特殊结构。,端粒的功能：,稳定染色体末端结构；防止染色体间末端连接；补偿DNA 5末端在清除RNA引物后造成的空缺。,2023年4月2日9时25分,74,端粒的结构特点,端粒的共同结构是富含(TmGn)x重复序列，重复的次数由几十到数千不等，并能反折成二级结构。,水解引物后每个染色体的3末端比5末端长,伸出约1216个单核苷酸链，这一特殊结构可募集一种称为端粒酶(telomerase)的特殊酶。,P5,HO3,5P,3 OH,2023年4

34、月2日9时25分,75,端粒酶(telomerase),人端粒酶组成(1997,成功克隆),功能特点,由RNA和蛋白质组成，是一种特殊的反转录酶。,2023年4月2日9时25分,76,端粒酶催化作用的爬行模型,G-C配对回折,2023年4月2日9时25分,77,-OH,-OH,-OH,细胞年轻化,抗衰老,端粒、端粒酶与细胞衰老,2023年4月2日9时25分,78,端粒、端粒酶与肿瘤,但某些肿瘤形成时可产生端粒缺失、融合、或缩短等现象。,癌细胞可通过某些机制启动端粒酶基因的表达，使染色体端粒稳定地维持一定的长度，使癌细胞得以持续增殖、转移并获得永生。,大多数增殖活跃的肿瘤细胞（约85%）端粒酶活

35、性增高。,端粒酶可作为为病变组织良恶性鉴别指标，及抗癌治疗的靶位点。,2023年4月2日9时25分,79,2023年4月2日9时25分,80,真核与原核生物复制的主要区别,2023年4月2日9时25分,81,反转录和其他的复制方式,第四节,Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,2023年4月2日9时25分,82,学习要求：,掌握反转录概念、作用特点、作用过程及生物学意义。了解滚环复制和D环复制。,逆转录酶(reverse transcriptase),RNA病毒逆转录(reverse transcription)现象,又称反转

36、录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶(RNA dependent DNA polymerase,RDDP)。,一、反转录酶和反转录,1.逆转录酶活性：以RNA为模板(tRNA为引物)合成DNA,2.RNase H 活性：水解RNA-DNA杂合分子中的RNA,3.DNA-pol活性：以DNA为模板合成DNA,逆转录酶没有35外切酶活性,无校对功能。,2023年4月2日9时25分,83,图12-18 反转录酶催化RNA转变为双链cDNA的途径,AAnA,TTnT 5,5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,Rnase H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶

37、S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,B试管内合成cDNA,逆转录病毒的生活周期：,进入宿主细胞 双链RNA 逆转录酶 双链cDNA(前病毒)整合到宿主细胞基因组DNA中 宿主细胞RNA聚合酶II mRNA 病毒RNA基因组 合成病毒蛋白质 包装成新的病毒颗粒，离开宿主,2023年4月2日9时25分,85,2023年4月2日9时25分,86,反转录病毒细胞内的逆转录过程：,受体:CD4,辅受体：CCR5/RANTES 或 CXCR4/SDF-1,gp120,二、逆转录研究的意义,（1）扩展了中心法则；表明RNA可同时兼有遗传信 息传代与表达的功能。,（2）对反转录病毒的研究，有助于肿瘤和艾滋

38、等疾 病发病机制和诊治的研究。,（3）cDNA 法、反转录病毒载体已成为基因工程和 基因治疗的重要工具。,19641970,Baltimore、Temin和Dulbecco在RSV和MLV研究，发现反转录酶、肿瘤病毒和细胞遗传物质间的相互作用，获1975诺贝尔生理/医学奖。,2023年4月2日9时25分,87,AZT(3叠氮-2,3双脱氧胸腺核苷)是已用于艾滋病临床治疗的抑制反转录酶的药物,AZT经T淋巴细胞吸收后转变为AZT三磷酸酯。一方面AZT三磷酸酯与HIV反转录酶有高亲和力，竞争性抑制了酶对dNTP的结合；另一方面AZT可被加接到合成中的DNA链3端，但AZT没有3-OH，故病毒DNA

39、合成被迅速终止。,2023年4月2日9时25分,88,2007年，艾滋病疫苗研究接连受挫：,9月底，美国国立卫生研究院(NIH)在最后一刻决定：停止一项耗资达1.3亿美元的艾滋病疫苗试验。,9 月中旬，默克制药公司宣布，其耗时10年研制的艾滋病疫苗中期临床试验失败；默克的疫苗被认为是最有希望的艾滋病疫苗。,2009年，艾滋病疫苗研究再现新希望：,2009，美国和泰国研究人员在泰国首都曼谷联合宣布,一种新型试验疫苗可使人体感染艾滋病病毒的风险降低31.2%。,中国艾滋病疫苗类型：复制型多价活病毒重组疫苗,疫苗载体：,疫苗原毒株：HIV-1 CRF-07株，中国流行最广毒株。,可选用的重组DNA抗

40、原成分：gag、pol、env和nef基因。,复制型天坛株痘苗病毒。是自1926年从天花患者的疱痂中分离出来的病毒，经连续传代减毒而获得。,一期临床实验：2005年3月12日开始，在广西进行，共有49名志愿者接受了疫苗的注射。,二期临床实验：2009仍在广西进行，将有230名志愿者开展一系列实验研究。,经过基因操作技术将4个毒力基因剔除，用4个HIV基因取代。,研究进展：,2023年4月2日9时25分,90,三、滚动复制和 D环复制（自习）,某些低等生物中存在一种单向复制的特殊方式滚环复制（rolling circle replication）。如174和M13噬菌体，爪蟾卵rDNA。,202

41、3年4月2日9时25分,91,线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）采用另一种单向复制的特殊方式，称为D-环或取代环式（displacement loop）复制。,2023年4月2日9时25分,92,第五节,DNA Damage(Mutation)and Repair,DNA损伤(突变)与修复,2023年4月2日9时25分,93,学习要求：,掌握DNA损伤(突变)的概念、突变的类型，切除修复的基本原理。熟悉突变的意义、引发因素，光修复、SOS修复及重组修复的概念。了解光修复、SOS修复及重组修复的机制。,基因组DNA分子序列的异常变化，称为DNA突变(mutation)

42、，或DNA损伤(DNA damage)。,一、突变的意义,（1）突变是进化、分化的分子基础（2）突变导致基因基因多态性产生（3）突变是某些疾病的发病基础（4）突变可导致死亡,2023年4月2日9时25分,94,物理因素:紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射。,化学因素：化学诱变剂，大多数是致癌物。,生物诱变剂：*如可移动遗传因子，即能在基因组中移 动的DNA序列。如：病毒(如逆转录病毒),二、引发突变的因素,2023年4月2日9时25分,95,DNA分子上的碱基错配又称点突变(point mutation),1.错配(mismatch),三、突变的分子改变类型,2023年4月2日9

43、时25分,96,2023年4月2日9时25分,97,2.缺失、插入和框移突变,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从 DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插 入到DNA大分子中间。,缺失或插入都可导致框移(frame shift)突变或称移码突变：,是指读码框三联体密码的阅读方式改变,造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,2023年4月2日9时25分,98,缺失引起框移突变,2023年4月2日9时25分,99,由基因重排引起两种地中海贫血基因型,3.重排(rearrangement),DNA分子内较大片段的交换，又称为重组或重排。,2023年4月2日9时25分,100,四、DNA

44、损伤的修复,DNA修复(DNA repair),直接修复(direct repair)切除修复(excision repair)重组修复(recombination repair)SOS 修复(SOS repair),修复的主要类型,是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态,2023年4月2日9时25分,101,1.光修复(light repair),（一）直接修复,2.断裂处直接修复,可见光(300600 nm)能激活细胞内的光修复酶(photolyase)。,由电离辐射等引起DNA损伤断裂，断裂处两侧的3和5端保持完整，可进行直接修复。,2023年4月2日9时25分,102,

45、（二）切除修复,在一系列酶的作用下，将 DNA分子中受损伤部分切除，同时以另一条完整的链为模板，合成出被切除部分的空隙，使DNA恢复正常结构的过程。,碱基切除修复(base excision repair,BER)：单个碱基突变以BER方式进行修复。,核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER):,4种蛋白质：UvrA(损伤识别)、UvrB(DNA变性)、UvrC(内切酶)和UvrD(解旋酶),2023年4月2日9时25分,103,图12-23 切除修复方式：碱基切除修复和核苷酸切除修复,*人类XP相关基因(XPA、XPB、XPC、XPD、XPF、XPG),（

46、三）重组修复,（recombination repair）是先复制后修复。,2023年4月2日9时25分,105,（四）SOS修复(SOS repair),是指DNA损伤严重，细胞处在复制难以继续进行的危急状态下诱发产生的一种应急修复方式。,能诱导切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质产生，如uvr，rec基因产物，调节蛋白Lex A等，构成一个网络式调控系统。,能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，故在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的变异率。,2023年4月2日9时25分,106,原核生物和真核生物DNA复制的比较,一.掌握复制、半保留复制、双向复制、半不连续性复制、复制

47、叉、复制子、领头链、随从链、冈崎片段的概念。熟悉半保留复制的实验依据。,二.掌握参与DNA复制的主要物质的种类，原核和真核生物DNA聚合酶作用、种类及其特点，拓补异构酶、引物酶、单链DNA结合蛋白和DNA连接酶的作用和特点。熟悉DNA复制的化学反应、保真性的酶学依据。了解DNA聚合酶的分子结构特点，复制中DNA分子的拓补学变化。,三.掌握原核生物DNA复制过程和各阶段的特点。熟悉真核生物DNA复制过程和各阶段的特点。熟悉复制起始、引发体、负超螺旋等概念。掌握端粒和端粒酶概念，了解端粒延长机制。,四.掌握反转录概念、作用特点、作用过程及生物学意义。了解滚环复制和D环复制。,本章学习要求,五.掌握DNA损伤(突变)的概念、突变的类型，切除修复的基本原理。熟悉突变的意义、引发因素，光修复、SOS修复及重组修复的概念。了解光修复、SOS修复及重组修复的机制。,2023年4月2日9时25分,108,