第十三章 DNA的生物合成课件.ppt

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1、基因信息的传递,生化意义上，基因是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是各种RNA。,(二)基因组（genome)某一物种拥有的全部遗传物质，即全部DNA序列。,(一)基因（gene）：,中心法则(The Central Dogma),转 录,翻 译,逆转录,DNA,RNA,蛋白质,复 制,1958年，F.Crick归纳了中心法则;,1970年，H.Temin发现逆转录，补充了中心法则。,RNA复制,人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)1986年:Dulbecco R,癌症研究的转折点人类基因组的全序列分析1990年:“人类基因组计划”正式启

2、动 1999年:中国正式加入HGP并承担1%的任务2001年2月:人类基因组草图表发表2003年4月:中、美、日、德、法、英等6国科学家宣布人类基因组计划完成,克隆羊Dolly,1997年7月24日由Wilmeet小组克隆成功,DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis，Replication,第 十三 章,DNA的生物合成包括DNA的复制、反转录以及DNA损伤修复合成三种不同的类型。,DNA复制的概况Basic Rules of DNA Replication,第一节,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板按碱基配对的规律合成子链DNA的过程。发生

3、于细胞分裂增殖时（S期）。过程的研究一般采用三类系统：1)以X174 DNA或质粒DNA及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子构成的体外系统2)以E.coli为模式生物，研究原核生物的复制3)以酵母和动物病毒为模式生物研究真核生物的DNA复制。,复制的分子基础：DNA双螺旋结构和碱基配对 规律复制的化学本质：单核苷酸的聚合反应复制完成的保证：酶及各种蛋白质因子的参与,一、DNA的半保留复制,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的DNA

4、都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,DNA半保留复制的证据,第一代,第二代,细菌,（含,15,N-DNA),普通DNA,普通DNA,重DNA,重DNA,普通培养基,普通培养基,细菌DNA双链,密度梯度离心,15,N-DNA,14,N-DNA,重DNA,普通DNA,（14NH4Cl）,（14NH4Cl）,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,复制时，D

5、NA从起始点(origin)解链，形成复制叉，大多数的复制是延两个方向延伸的，形成两个延伸方向相反的复制叉。,二、DNA复制的起点和方向,复制叉指的是DNA双链解开分成两股，各自作为模板，子链延模板延长所需要形成的Y字行结构。,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,A.环状双链DNA及复制

6、起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),环形DNA的型复制,复制子是独立完成复制的功能单位。,习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。,真核生物基因组庞大，有多个染色体。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。真核生物有数以万计的复制子，长度差别很大，在13900K碱基对之间。原核生物是单复制子完成复制，称复制体。,真核生物DNA复制形成复制子的电镜照片Electron Microscopy of replicating DNA revealsreplicating bubbles.,滚环复制(rolling ci

7、rcle replication),是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,其感染型的DNA为单链，复制时先形成闭合环状双链分子（复制型），随后正链在受核酸内切酶活性的protein A蛋白的作用下产生切口。3OH延伸，保持闭环的对应单链为模板，一边滚动一边进行连续的复制。滚动的同时，外环5端逐渐离环向外伸出。完成一次复制后，protein A把母链和子链切断3端沿母链延长，最后合成新的环状DNA。,滚环复制形成单链分子,滚环复制的电镜照片,取代环复制（D环复制，D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。

8、特点：复制起始点不在DNA同一位点，内、外环复制有时序差别，需要引物！,原核生物DNA的复制,第二节,参与DNA复制的物质,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP，总称dNTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子以及无机离子(Mg2+),一、参与原核生物DNA复制的酶和蛋白质,（dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,复制的化学本质单核苷酸的聚合,（1）DNA聚合酶,5至3的聚合活性

9、（5 3），焦磷酸的不断水解推动聚合反应的完成。,p,p,p,p,p,p,p,PPP,O,H,OH,O,H,5,5,PPi,N1,N2,N3,N1,N2,N3,5,3,3,3,复制的脱氧核苷酸聚合过程,聚合反应的特点,DNA 新链生成需引物和模板；遵照碱基互补规律按模板指引合成子链；新链的延长只可沿5 3方向进行。,DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：1.53 的聚合活性 2.核酸外切酶活性,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,3

10、5外切酶活性,5 3外切酶活性,?,能切除引物及突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-pol DNA-pol DNA-pol,Arthur Kornberg,（一）原核生物的DNA聚合酶分为三型,功能：对复制中的错误进行校读；去除引物；对复制和修复中出现的空隙进行填补,DNA-pol（109kD）,二级结构：以-螺旋为主，AR共18个-螺旋IH区，50个氨基酸残基，覆盖IO空隙区IO区，空隙较大，容纳DNA,AF 323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,GR 604个氨基酸,DNA聚合酶活性

11、 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,Klenow片段,DNA-pol（120kD）,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。,复制时，DNA从起始点(origin)解链，形成复制叉，大多数的复制是延两个方向延伸的，形成两个延伸方向相反的复制叉。,DNA复制的起点和方向,取代环复制（D环复制，D-loop replication),滚环复制(rolling circle replication),环形DNA的型复制,pol 与校读，修复有关小片段 5 3核酸 外切酶

12、活性大片段（Klenow片段）聚合活性、3 5外切活性 常用的工具酶 pol 它参与DNA损伤的应急状态修复。,原核生物的DNA聚合酶,功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol(250kD),10种亚基组成的不对称二聚体、组成核心酶，具有53 的聚合活性和 5 外切活性亚基复制保真所必需亚基夹稳DNA模板，使酶沿模板滑动-复合物（夹子装配复合物）促进全酶组装模板上，增强核心酶活性。,20世纪90年代末发现的DNA-pol IV和DNA-pol V在DNA出现严重损伤时，参与DNA损伤的修复。,pol 与校读，修复有关小片段 5 3核酸 外切酶活性大片段（Klenow片段）

13、聚合活性、3 5外切活性 常用的工具酶 pol pol 真正起复制作用的酶，由10种亚基组成的不对称二聚体，、组成核心酶聚合活性、3 5外切活性,原核生物的DNA聚合酶,主要成员,主要作用,解螺旋酶(DnaB)解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,拓扑酶 使打结、缠绕、超螺旋的DNA松驰,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,（2）参与原核生物DNA复制的其他酶和蛋白质,E.Coli 基因图,目 录,拓扑酶,拓扑酶,引物酶,RNA-pol,RNA-pol,引物酶(primase)，DnaG复制起始时催化生成RNA引物的酶 在模板的复制起始部位催化N

14、TP的聚合,形成短片段的RNA。这一小段RNA作为复制的引物，提供3-OH末端，使DNA-pol能够催化dNTP聚合。引物酶与RNA聚合酶不同编码的基因不同：rpoA D,rpoB C编码RNA-pol各亚基；对利福平的敏感度不同：RNA-pol敏感,DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,噬菌体和真核细胞的DNA连接酶由ATP提供能量细菌的DNA连接酶由NAD+提供能量,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP或NAD+,AMP,5,3,5,3,DNA连

15、接酶在复制中起最后接合切口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,解螺旋酶(helicase)，Dna B利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链,DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)拓扑酶,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。,拓扑：指物体或图象作弹性移位而保持物体原有的性质。,超螺旋的电镜照片（质粒DNA）,解链过程中正超螺旋的形成,拓扑异构

16、酶（-蛋白）,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态，从而改变超螺旋的圈数。反应不需ATP。可消除和减少负超螺旋，对正超螺旋不起作用。主要集中在转录区，与转录有关。,作用机制,拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶（旋转酶）,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。在利用ATP供能扥情况下，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态，每作用一次可引入2个负超螺旋；在不消耗ATP的情况下该酶可消除负超螺旋。分布于染色质骨架蛋白和核基质部分，与复制有关。,单链DNA结合蛋白（single stranded DNA bindi

17、ng protein,SSB)，亦被称为 螺旋反稳定蛋白,在E.coli由177个氨基酸残基组成的四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷酸单位，作用时表现为协同作用。作用：维持模板的单链状态；保护单链的完整，防止核酸酶的降解,四种酶催化生成磷酸二酯键的比较,酶 提供3-OH 提供5-P 结果,聚合酶 引物和延长中的新链 dNTP(dNMP)n+1,连接酶 复制中不连续的单链 单链 不连续连续,拓扑酶 切断后的链 切断后的链 改变 拓扑状态,引物酶 NTP NTP 合成引物,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,二

18、、大肠杆菌DNA复制的起始,E.coli复制起始点 oriC,1.DNA解链,解链区,20-40个DnaA识别并结合，促使解链区解链。,DnaB在DnaC的协同下，解链，置换DnaA。,识别区,20-40个DnaA蛋白四聚体在ATP参与下与oriC的9bp重复序列结合。然后DnaB蛋白四聚体在DnaC蛋白的参与下和这个区域结合，DnaB具有解螺旋酶的活性，使其打开形成两个复制叉。,引发体,DanA 辨认复制起始点DnaB 解链DnaC 辅助解链DnaG 合成引物DNA模板链复制起始区域,引发体（primosome）含有解螺旋酶DnaB、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发

19、体。,复制起始：辨认复制起始点，激活引物酶，合成引物。,引发体和引物,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,DNA拓扑异构酶II通过切断，旋转，再连接，实现DNA超螺旋转型，在复制整个过程都需要.,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。十几或数十个核苷酸组成，53合成。,引物,引物酶,（三）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,DNA聚合酶催化游离的脱氧

20、核苷酸结合到新链3末端，使其不断延长。,复制的半不连续性,3,5,3,5,解链方向,3,3,5,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),现仅发现53的DNA聚合酶,同一个复制叉中,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链，或领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链，随从链。1968年，岡崎发现了复制中的不连续片段，称为岡崎片段(okazaki fragment，包含RNA引物片段)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,领头链的合成,引物,随从链的合成,冈崎

21、片段长度10002000核苷酸,随从链的模板DNA可以折叠或绕成环状，从而保持与领头链的正在延长区域对齐。,同一复制叉上领头链和随从链由相同的DNA-pol催化延长,Figure 8-21*Trombone model,复制过程简图,引物酶,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止子(ter)处汇合。,（四）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口,terG,大肠杆菌的顺时针复制叉有4个连续排列的终止子的终止序列；逆时针复制叉有3个连续排列的终止子，当复制叉移动到终止子处，被称作终点利用物质（Tus)的蛋白质会结合在ter序列上，阻止复制叉的移动。,随从链上不连续性片段的连

22、接,DNA复制完成后两个子代分子以连环体的形式存在，需要由TOPO IV将其中的一个环状分子切开，使两个子代分子脱离后再将其切开的DNA连接成环状的分子。,小 结,主要成员,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶(DnaB)解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPOII 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,终点利用物质（Tus)使复制叉的移动终止在终止子处,TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式,第三节 真核生物DNA的复制

23、,方式 半保留复制(semiconservative replication)复制的高保真性(high fidelity)形式 双向复制(bidirectional replication)过程 半不连续复制(semi-discontinuous replication),真核生物复制的基本过程与原核基本相似,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。有关真核生物DNA复制的资料主要来源于SV40病毒和酵母的研究。,（一）常见的真核细胞的DNA聚合酶有五种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性,可催化RNA链的合成。,延长子链的主要酶

24、，有解螺旋酶活性。(DNA-pol III),参与低保真度的复制。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,都有53核酸外切酶活性,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen,PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC（相当于-复合物）的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,在复制叉形成，pol 合

25、成RNA引物及20nt-30nt的 DNA生成后，DNA-pol/通过PCNA的协同作用，逐步取代pol，在RNA引物的3-OH基础上合成领头链和随从链。,RNA引物由核糖核酸酶H1和翼式核酸内切酶-1（FEN-1)或FEN1/DNase切除，FEN1有切除引物的核酸外切酶活性和内切酶活性。缺口由DNA-pol 填补。,近些年在真核生物中又发现了DNA聚合酶10多种用于DNA损伤修复的DNA聚合酶。T抗原可解开复制起点处的双螺旋，其功能类似DnaB.蛋白质RPA由宿主细胞的基因编码，可结合于单链DNA，功能类似于原核生物的SSB。真核也需要拓扑异构酶II与DNA连接酶的参与。,小 结,主要成员

26、,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶(DnaB)解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPOII 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,终点利用物质（Tus)使复制叉的移动终止在终止子处,TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式,方式 半保留复制(semiconservative replication)复制的高保真性(high fidelity)形式 双向复制(bidirectional replication)过程 半不连

27、续复制(semi-discontinuous replication),真核生物复制的基本过程与原核基本相似,（一）常见的真核细胞的DNA聚合酶有五种,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性,可催化RNA链的合成。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。(DNA-pol III),参与低保真度的复制。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,都有53核酸外切酶活性,增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen,PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。T抗原可解开复制起点处的双螺旋，其功能类似DnaB.

28、蛋白质RPA由宿主细胞的基因编码，可结合于单链DNA，功能类似于原核生物的SSB。真核也需要拓扑异构酶II与DNA连接酶的参与。,二、真核生物DNA复制的过程,（一）SV40DNA的复制 SV40（simian sarcom avirus40 猴肉瘤病毒)属乳多空病毒类，是最小的DNA病毒之一。它可长期潜伏于猴肾细胞，对新生仓鼠有致癌性，体外试验还可使多种属细胞恶性转化。,反应主要步骤包括：1）2分子T抗原六聚体作为起始蛋白在ATP的存在下与其复制起始区结合并解链。2）复制蛋白（RPA，其作用类似SSB）,结合单链区，进一步提高T抗原的解旋酶活性。但其作用时无协同效应。3）pol 与T抗原/R

29、PA复合物结合，生成前导链引物及20nt-30nt的 DNA。,4）复制因子（RFC）先与新合成的DNA3端结合，随后PCNA取代pol 结合到DNA模板上，前导链合成暂时中断。5）DNA-pol/结合到PCNA-RFC复合物上，持续准确的合成前导链；同时，pol 结合到后随链的模板上开始其后随链的合成。后随链的延伸，也需要PCNA-DNA-pol/取代pol 6）FEN-1-RNase H1负责切除引物，DNA连接酶 I负责连接片段，拓扑异构酶 I负责清除正超螺旋，拓扑异构酶 II负责解开连体环。,Type II topoisomerases are required to separate

30、 daughter DNA molecules,Finishing replication,（2）酵母DNA的复制,ORC：起点识别复合物，由6个亚基组成，相当于DnaA.。ORC募集两种解旋酶装载蛋白，一种是细胞分裂周期基因cdc6表达的Cdc6,另一种是Cdc10依赖性转录因子1Cdt1,随后募集微染色体维持蛋白2-7复合体（Mcm2-7）（Mcm2-7）具有解螺旋酶活性，功能相当于DnaBORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7构成前复制复合体pre-RCCdc6-Cdt1-Mcm2-7复合物可调控复制的起始，称执照因子或复制许可因子。,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G

31、1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制pre-RC而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(Cdk)和另一种蛋白激酶(Ddk)。,Cdk和Ddk可以使pre-RC的Cdc6、Cdt1磷酸化而失去活性，并脱离pre-RC，DNA-pol/在一些辅助蛋白的协助下被募集到pre-RC上，接着募集pol-引物酶，从而确保在合成RNA引物前，合成前导链和后随链的酶已经到位。Cdk可以激活pre-RC，同时抑制形成新的pre-RC，从而确保DNA在一个细胞周期只合成一次。在细胞完成分裂后，Cdk即被分解。,哺乳动物

32、的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。,SV40和酵母的复制过程基本相似最大的不同是参与两者复制起始阶段的蛋白质因子是不同的，已发现至少有35种基因的产物参与真核DNA复制的启动。在复制的启动阶段，基本步骤及其发生次序是相似的，然而，不同的生物在复制起始点的选择，复制起始复合物的组成，和起始蛋白识别的方式方面有明显差异。,三、真核生物DNA复制的特点,（一）原核生物和真核生物DNA复制的相同点1）半保留复制2）半不连续复制3）需要解螺旋酶，并有SSB或类SSB同单链区结合。4）需要拓扑异构酶5）需

33、要RNA引物6）新链合成有校正机制,（二）原核生物和真核生物DNA复制的主要差别1）原核单复制子的复制，真核多复制子的复制，真核的复制子小。2）原核的复制叉移动速度900nt，真核的仅为50nt。3）原核的冈崎片段1000-2000nt，真核的仅为100-200nt。4）真核的DNA聚合酶和蛋白质因子种类比原核细胞多，引物酶活性由聚合酶a的两个亚基承担（引物包含小片段的DNA）,5）原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制，真核细胞的复制在有复制许可因子的控制下，复制周期不可重叠。6）原核生物的DNA为环形分子，DNA复制不存在末端会缩短的问题。真核生物DNA为线性

34、分子，DNA复制时末端会缩短，需要端粒酶解决线性DNA末端问题。,小 结,主要成员,主要作用,DnaA 识别复制起始位点,解螺旋酶(DnaB)解开DNA双链,SSB 维持已解开单链DNA的稳定,引物酶 合成RNA引物,TOPOII 使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰,DNA-pol DNA复制,DNA-pol 水解引物、填补空隙、修复作用,DNA连接酶 催化双链DNA中单链缺口的连接,终点利用物质（Tus)使复制叉的移动终止在终止子处,TOPOIV 切开两个子代分子连环体形式,RPA,RPA,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后

35、复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,结构特点,由染色体末端DNA和蛋白紧密结合。其中一条链末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短 序列，叫TG链;另一条叫AC链。,TTTTGGGGTTTTGGGG,AAAACCCCAAAACCCC,这些重复序列的少量丢失，不会伤及基因的结构。但若端粒缩减到一定程度，细胞会停止分裂。,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,端粒酶(telomerase),RNA-蛋白质复合物,端粒酶RNA含有与端粒区重复序列(TnGn)x相似及互补的序列(AnCn)x，

36、端粒酶以自身的RNA为模板延长DNA单链，然后反折为双链，提供了3-OH与DNA复制的模板爬行模式。,端粒酶的催化延长作用,爬行模型Inchworm model,内在模板RNA,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,端粒与端粒酶是当今的一个研究热点,2009年度诺贝尔生理学或医学奖揭晓，得主是三位美国科学家伊丽莎白布赖克本（Elizabeth H.Blackburn）、卡罗尔格雷德（Carol W.Greider）和杰克绍斯塔克（Jack W.Szostak），他们的研究主题是“染色体如何受到端粒和端粒酶的保护”,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,真核生物复

37、制时的引物不仅包含RNA片断还包括一小部分的DNA片断。,（四）DNA复制与核小体组装,原核细胞复制速率与生长环境有关。原核细胞在第一轮复制还没结束的时候，就可以在复制起始区启动第二轮复制，调控机制在“分子生物学”等后续的课程中学习。,（五）原核生物和真核生物DNA复制调控的比较,真核生物的DNA复制调控至少有三个层次：I.细胞周期水平II.染色体水平的调控III.复制子水平的调控,逆转录作用Reverse Transcription,第四节,逆转录酶(reverse transcriptase，RT):依赖RNA 的DNA聚合酶兼有逆转录酶活性、RNA（水解）酶活性、DNA聚合酶活性,逆转录

38、(reverse transcription),一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RT没有3-外切酶活性，因而缺乏校读功能，使RNA病毒有很高的突变率，这可能是新型病毒频繁出现的一个原因，也是逆转录病毒对许多抗病毒药物产生抗性的主要原因在逆转录病毒中，逆转录酶以tRNALys为引物起始DNA的合成。,逆转录病毒的生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

39、某一细胞的全套mRNA经逆转录合成的一整套cDNA，称cDNA文库。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现，发展了中心法则。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。（人类免疫缺陷病毒-HIV是爱滋病-AIDS的病原）,DNA损伤与修复DNA Damage and Repair,第五节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。

40、从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。DNA突变具体指个别dNMP残基以至片断DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNA damage)。,突变在生物界普遍存在,（一）突变是进化、分化的分子基础,从长远的生物史看，进化过程是突变的不断发生所造成的。大量的突变都是属于这种类型，只是目前还未能认识其发生的真正原因，因而名为自发突变或自然突变(spontaneous mutation)。,（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性,这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。多态性(pol

41、ymorphism)一词用来描述个体之间的基因型差别现象。,（三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡（四）突变是某些疾病的发病基础,一、DNA损伤的产生,大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变的因素，主要有物理和化学因素。,物理因素 紫外线(ultra violet,UV)-形成TT二聚体、各种辐射-打断DNA分子上的共价键,化学因素,生物因素,肿瘤病毒插入宿主细胞基因组中，引起细胞癌变。,DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。点突变发生在基因的编

42、码区，可导致氨基酸改变，为错意突变。若不引起氨基酸的替换称同义突变或中性突变若将氨基酸的密码突变为终止密码，引起肽链合成的终止，称无义突变碱基置换包括：转换两种嘌呤或两种嘧啶的互换，颠换嘌呤和嘧啶的互换,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致移码突变，或框移突变。移码突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。3个或3n个的核苷酸插入或缺失不一定能引起框移突变。

43、,缺失引起框移突变,RPA,RPA,结构特点,由染色体末端DNA和蛋白紧密结合。其中一条链末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短 序列，叫TG链;另一条叫AC链。,TTTTGGGGTTTTGGGG,AAAACCCCAAAACCCC,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,物理因素 紫外线(ultra violet,UV)-形成TT二聚体、各种辐射-打断DNA分子上的共价键,化学因素,生物因素,缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致移码突变，或框移突变。移

44、码突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。3个或3n个的核苷酸插入或缺失不一定能引起框移突变。,二、DNA损伤的修复,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,直接修复(direct repair)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型：,光修复酶可使二聚体解聚为单体状态，DNA完全恢复正常。光修复酶的激活需300-600 nm波长的光。,光修复酶(photolyase),UV,（一）直接修复系统利用酶简单地逆转DNA损伤,1、形成

45、嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,（二）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形,这是细胞内最重要和有效的修复方式。其过程包括去除损伤的碱基和核苷酸，填补空隙和连接。主要由DNA-pol和连接酶完成。,碱基切除修复,当非正常的碱基生成时，DNA糖基化酶可将其切除，留下一个无碱基部位，有时无碱基部位会自动生成，因为嘌呤-脱氧核糖键在化学上不稳定。去碱基部位会与相邻的多核苷酸链一起被去除，然后由pol I和连接酶将其修复。,E.coli的切除修复机制,人类典型病症：着色性干皮病（XP）发病机制与DNA修复有缺陷有关。患者缺

46、乏特异的核酸内切酶，紫外光照射后易患皮肤癌。,甲基化指导的错配修复,蛋白质MutS发现错配对位置，MutL和 MutH切除，由Po III和连接酶补齐缺口。,错配的核苷酸只是其碱基不能与母链配对,核苷酸本身结构是正常的,对正确母链和错配子链的区分至关重要。原核细胞利用两条链的甲基化状态的不同来区分。复制的模板链GATC序列中腺苷酸残基被甲基化酶作用而甲基化,但在新合成的子链瞬间,子链未被甲基化。这样修复系统能区分甲基化的母链和未被甲基化的子链。,（三）重组修复,错误的模板复制的子链带有错误甚至缺口，这种损伤以重组方式修复。（先复制后修复）由核酸酶和其它重组蛋白将另一股健康链与缺口部分进行交换，

47、以填补缺口。,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,第六节,DNA重组和克隆,一、DNA的重组,接合作用(conjugation),转化作用(transformation),转导作用(transduction),转 座(transposition),1.同源重组(homologous recombination),2.位点

48、特异的重组(site-specific recombination),细菌的基因转移与重组,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称一般性重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,（一）同源重组是最基本的DNA重组方式,（二）位点特异重组，即特异位点间发生的整合,位点特异重组(site-specific recombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。,免疫球蛋白（Ig）的结构,转座子(trans

49、posons)可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。也就是一段可以发生转座的DNA。,克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一）克隆的基本概念和PCR,二、DNA克隆-DNA Cloning,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombin

50、ant DNA)。,DNA克隆,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的：分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering)用重组DNA技术改变某物种的性状，或得到某基因的表达产物，又称重组DNA工艺学。,PCR法PCR-Polymerase Chain Reaction,（一）基本工作原理1、概念：聚 合 酶 链 反 应-体外迅速大量扩增DNA的方法，细胞外的DNA克隆。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,目 录,目 录,4、PCR的基本反应步骤,变性95C,