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1、第14章 RNA的生物合成-转录,【目的与要求】,1、掌握转录的概念与特点2、掌握并能叙述原核生物与真核生物中RNA聚合酶的组成及功能3、掌握RNA转录过程4、掌握mRNA,tRNA与rRNA转录后加工过程,DNA复制与转录的比较,相同点,模 板 两股链均复制 模板链转录合成方式 半保留复制 不对称转录原 料 dNTP NTP聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶碱基配对 A-T，G-C A-U，T-A，G-C产 物 半保留的双链DNA 单链RNA,不同点,以DNA为模板遵循碱基配对原则都需依赖DNA的聚合酶聚合过程都是生成磷酸二酯键新链合成方向为53,概 述,一、RNA的生理功能 DNA将携带的
2、遗传信息转到RNA分子中，RNA分子以其信息指导蛋白质的合成 二、RNA合成概况 在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导的RNA合成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本是RNA前体（RNA precursor），需经加工过程（processing）方具有生物学活性,第一节 DNA指导的RNA合成-转录体系,转录:由DNA指导的RNA合成,DNA以碱基互补原则，决定合成RNA的全部碱基成分及排列顺序，将DNA模板上的遗传信息传递到RNA分子的过程 1、反应体系：DNA模板,NTP,RNA聚合酶，Mg2+,Mn2+，合成方向
3、53。连接方式-3,5磷酸二酯键 2、特点：不对称转录-DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录,3、原料：四种磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U 4、合成过程:连续，方向：535、合成部位：细胞核内,一、RNA聚合酶,（一）原核生物RNA聚合酶,组成：RNA聚合酶由5个亚基构成，2为全酶（分子量为480kD），2为核心酶作用：识别DNA分子中转录的起始部位。促进与模板链结合，并使DNA双链打开17bp。催化NTP的聚合，完成一条RNA链的聚合反应。识别转录终止信号，停止聚合反应，参与转录水平的调控,核心酶：能与DNA链结合并启动转录，但
4、没有特异性，转录出来的可能不是一个完整的基因序列,决定基因转录的特异性,亚基,分子量,每分子酶中所含数目,功能,36512 2,150618 1,与转录全过程有关,155613 1,结合DNA模板,70263 1,辨认起始位点,原核RNA聚合酶各个亚基的作用,特 点,1.聚合速率慢，30-85NTP/秒2.缺乏外切酶活性,无校对功能，错误率10-63.不同的因子识别不同的启动子 4.可被药物抑制（利福平）人的RNA聚合酶对利福平不敏感。利用此特点可研制杀菌药物,（二）真核生物RNA聚合酶,真核较原核的酶复杂，已清楚的有RNA Pol,及Mt四型组成和功能：均由多亚基构成，聚合酶主要负责mRNA
5、的合成；Pol主要负责rRNA的合成；Pol主要负责tRNA和5srRNA的合成,三种RNA聚合酶对转录抑制剂鹅膏覃碱的敏感性反应不同,二、转录的模板,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene),53,35,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,模板链及反意义链：指导RNA合成的DNA链为模板链，又称反意义链 编码链及有意义链：不作为转录的另一条DNA链为编码链，又称有意义链 由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链,5G C A G T A C A T G T C33c g t c a t g t
6、a c a g5,DNA,5G C A G U A C A U G U C3,mRNA,N Ala Val His Val C,多肽链,转录,翻译,编码链,模板链,不对称转录:模板链并非永远在同一单链上,不对称转录-双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录,（一）启动子,原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。,RNA聚合酶 识别、结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。,开始转录,T T G A C AA A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T
7、A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,RNA-pol辨认位点(recognition site),1、原核生物启动子：约55bp,分为起始点（start site）、结合部位、识别部位 起始点：转录起始部位以+1表示，转录的第1个核苷酸常为嘌呤-G,A 结合部位：约6bp组成,是高度保守区,共有序列为5-TATAAT-3,位于起始点上游-10。因Tm低,DNA易解开双链，为RNA聚合酶提供场所 识别部位：约6bp组成,在-35处,为高度保守区,序列5-TTGACA-3,s因子识别此部位,*-35和-10都是大致位点,启动子：RNA聚合酶识别
8、、结合DNA的部位，包括一些转录调控组件,TTGACA盒子,TATA盒子,启动子区,结构基因,-10bp,+1,转录,初级转录物RNA,-35bp,2、真核生物启动子,-25处含AT富集区,共有序列TATAA（TATA box）-70处含共有序列CAAT,还含许多其它box,例如:GC-box,E-box等含增强子(enhancer)和静息子(silencer)RNA pol和 RNA pol与聚合酶所识别的启动子差异较大,结构基因,-GCGC-CAAT-TATA,真核生物启动子保守序列,（二）终止子,特点：终止部位含GC富集区与AT富集区,它们分别形成发卡结构和连续的U区，以终止转录 蛋白因
9、子辅助识别终止信号，参与终止,第二节 转录过程,一、原核生物的转录过程,转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,（一）转录的起始阶段,2.DNA双链解开,1.RNA聚合酶全酶(2)与模板结合,3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH 3,转录起始复合物:,5-pppG-OH+NTP 5-pppGpN-OH 3+ppi,转录起始过程,1.RNA聚合酶与启动子的结合（亚基辨认-35区）,2.DNA双链的打开RNA pol（全酶移向-10区）,3.RN
10、A链上合成第一个磷酸二酯键,5-pppGpN-OH-3,亚基脱落,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,(二）转录的延长阶段,1.亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2.在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi,转录泡：是由DNA双链,RNA聚合酶与新合成的转录本RNA局部形成的结构,它贯穿于延长过程的始终 过程：在起始阶段形成第一个磷酸二酯键后，RNA聚合酶核心酶沿模板向下游移动，核苷酸之间以3,5磷酸二酯键相连，合成方向53，合成的RNA自3末端逐步延长。合成出的RNA与DNA形成杂交分子,约1
11、2bp，因结合不紧很易脱离,转录复合物：酶-DNA-RNA：转录空泡,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,（三）转录的终止,合成移到终止信号时,酶不滑动,聚合停止,转录完成 特点：因子参与的终止：r因子与RNA产物中富含C的部位结合,并诱使RNA聚合酶构象改变停止滑动;因子的解螺旋酶活性,利于RNA产物的释放,1.依赖因子的转录终止,因子,1.识别结合富含C的RNA链,功能,2.ATPase活性,3.解螺旋酶活性,RNA 聚合酶,因子附在RNA链上,因子,RNA 链形成一个发夹结构，转录停止，因子利用ATP能滑行,因子发挥解螺旋酶活性，解开发夹和RNA
12、-DNA,依赖Rho因子的转录终止,2.不依赖因子的转录终止,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,RNA,5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT.3,DNA,5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGG
13、UGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU.3,茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿；使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,二、真核生物转录特点,真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化，转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，其起始过程比原核生物复杂。,转录起始点,TATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element),转录起始前的上游区段,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,启动子复
14、杂,某些基因不含TATA box，由起动序列参与基本转录的开始 顺式作用元件:真核生物中转录起始中起转录调控作用的DNA序列-35区 5-TATA(TATA盒)-70-110区 CAAT盒 GC盒（真核TATA序列的位置不像原核-35和-10那样典型，某些真核生物基因也可以没有TATA序列）,转录因子与反式作用因子,能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-acting factors)。它们与特异的顺式作用元件相互作用,并激活另一基因的转录 反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptional f
15、actors,TF)。,参与RNA-pol转录的TF,转录起始复合物,真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。,TFF,A,B,由RNA-Pol 催化转录的PIC,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,PIC组装完成，TFH使CTD磷酸化,拼板理论(piecing theory),一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间互相结合，生成有活性，有专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。,转录延长,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没
16、有转录与翻译同步的现象。,RNA-pol前移处处都遇上核小体。,转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,5-AAUAAA-,5-AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,转录终止,和转录后修饰密切相关。,真核转录的转录终止序列，在3端之后有共同序列AATAAA及多个GT序列，mRNA在转录终止序列处被切断,AATAAA,GTGTGTG,-,AAUAAA,GUGUGUG,AAUAAA
17、,GUGUGUG,酶切,加尾信号,GC丰富序列,AATAAA,GTGTGTG,-,AAUAAA,GUGUGUG,酶切,(继续转录，但5端没有“帽子”，产物被降解）,加尾,第三节 RNA 转录后的加工,一、原核生物RNA转录后加工,原核：mRNA是多顺反子(polycistronic),每分子RNA中含几种蛋白质信息，RNA寿命短，原核mRNA不需加工，边转录边翻译，转录没完时翻译即开始 例:乳糖操纵子，含Z,Y,A三个基因,分别编码半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶,二、真核生物RNA转录后加工,意义：转录生成的前体RNA,无生物学活性,需加工变为成熟、有活性的RNA 加工种类：剪切与剪接、末端
18、添加核苷酸、修饰、RNA编辑,几种主要的修饰方式,1.剪接(splicing),2.剪切(cleavage),3.修饰(modification),4.添加(addition),（一）rRNA前体的加工,特点：1、rRNA拷贝多,原核5-10个拷贝;真核:果蝇260个拷贝;Hela细胞1100个拷贝 2、rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列,加工过程,1、剪切作用：需核酸酶参与2、甲基化修饰：修饰在碱基上 3、自我剪接：一种核酶的作用 5S的加工变化不大 原核rRNA加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA 真核rRNA加工：1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。2.45S加工中含
19、剪切和甲基化修饰，需核酸酶,核糖体RNA,18S5.8S 28S,45S rRNA前体,酶切,32S rRNA前体,前rRNA 20S,酶切,28SrRNA,5.8SrRNA,18SrRNA,(二)tRNA前体的加工,1、切除多余的核苷酸：RNase p切除5 端多余的核苷酸；Rnase D切除3端多余的核苷酸2、剪切内含子：核酸内切酶切除内含子,连接酶进行连接3、修饰与3末端加-CCA:修饰包括甲基化,脱氨基,还原反应等，在核苷酸基转移酶催化下完成3末端添加CCA,tRNA的加工,内含子编码区,内切核酸酶,外切核酸酶,5,3,-OH 3,DNA,内含子,初级转录物,3端加CCA-OH,3,除
20、去内含子（内切酶与连接酶）,CCA-OH 3,成熟 tRNA,5,CCA-OH,内含子,5和3端的酶切3加上CCA去掉内含子特异部位碱基的加工,（三）真核生物mRNA前体的加工,原核生物：mRNA是多顺反子(polycistronic),每分子RNA中含几种蛋白质信息，RNA寿命短，转录没完时翻译即开始 例:乳糖操纵子，含Z,Y,A三个基因,分别编码半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶,真核：单顺反子,一个mRNA仅编码一种蛋白质 外显子:在真核生物基因中编码蛋白质的序列 内含子:非编码蛋白的序列,因其插于外显子之间又称插入序列,居间序列 hnRNA:为mRNA的前体,转录物中外显子与内含子间隔排
21、列，需经剪接加工后生成mRNA,mRNA前体加工过程,真核：5末端帽子 部位：核内 3端多聚A尾 部位：核内,胞质也可进行 mRNA的剪接 部位：胞核 甲基化(甲基化发生在剪接之前,在帽子结构及非 编码区分子中含1-2个m6A)RNA编辑(某些mRNA的核苷酸序列,在生成转录产物后还需插入、删除或取代一些核苷酸残基,方能生成具有正确翻译功能的模板,遗传信息在mRNA水平上的改变过程，称为RNA编辑),1.5末端加帽子结构,5加帽,pi,5pppG,磷酸酶,ppi,5pG,pppG,5GpppG,甲基化酶,CH3,mGpppG,O,H,O,H,帽1,帽0,帽2,甲基鸟苷5，5-三磷酸,2.3加p
22、olyA 尾巴,3加尾,AAUAAA,AAAAAAAAA.,加尾,AATAAA,GTGTGTG,-,AAUAAA,GUGUGUG,AAUAAA,GUGUGUG,酶切,转录的终止,加尾信号,GC丰富序列,polyA尾（约20200个A）,A,A,A,A,A,A,3.mRNA的剪接,真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。,（1）断裂基因(splite gene),编码区 A、B、C、D,外显子(exon)和内含子(intron),外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RN
23、A的核酸序列。内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。,核内不均一RNA（hnRNA）：核内的初级mRNA称为杂化核RNA(hetero-nuclear RNA,hnRNA)mRNA的剪接：hnRNA被剪接体作用，剪除内含子、连接外显子，产生成熟的mRNA的过程,剪接,剪接:在细胞核内,hnRNA剪切掉内含子,将多个外显子连接为成熟mRNA的过程为剪接 例:同一转录本,在不同的组织,因剪接差异产生各自不同的mRNA剪接的本质：磷酸酯键的转移剪接特点：剪接部位的结构为内含子末端的特定序列，分布在内含子的三个部位，5端剪切点为GU;3端剪切点为AG；靠近3端含A序列的分支点,鸡卵清
24、蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,目 录,鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图,DNA,mRNA,目 录,外显子,内含子,DNA,mRNA,转录,形成套索RNA，外显子靠近,剪接体,去除套索RNA，外显子连接,成熟mRNA,mRNA的剪接,4.核苷的甲基化作用,原核生物分子mRNA不含有稀有碱基，但真核生物mRNA中含有甲基化核苷酸，甲基化(甲基化发生在剪接之前,帽子结构及在非编码区分子中含若干个m6A),5.RNA编辑,RNA编辑(某些mRNA的核苷酸序列,在生成转录产物后还需插入、删除或取代一些核苷酸残基,方能生成具有正确翻译功能的模板,遗传信息在mRNA水平上的改变过程，称为RNA编辑),RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。,mRNA的编辑(mRNA editing),核酶的发现,1982年Cech在研究原生动物四膜虫的26SrRNA的时候，发现它的一个内含子在除去了所有蛋白质后，剪接仍可完成，只需有鸟苷或鸟苷酸（但两者要有3OH），就能自我剪接这些特殊的rRNA的剪接不需任何蛋白质的参与即可发生，说明RNA 本身就有酶的催化作用。因此把具有酶的催化活性的RNA称为核酶（ribozyme）,
