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1、第九章 核酸的生物学功能,讲授内容,第一节 DNA的生物合成第二节 RNA的生物合成第三节 RNA催化活性的发现第四节 蛋白质的生物合成第五节 蛋白质的到位第六节 中心法则第七节 基因表达的调控第八节 分子生物学技术,教学目标,了解DNA复制的一般过程，以及原核细胞和真核细胞DNA合成的异同了解PCR有选择扩增DNA的原理了解RNA合成涉及的起始、延伸和终止三个过程掌握核酶的概念掌握蛋白质合成的一般过程 掌握乳糖操纵子模型了解几种分子生物学技术过程及原理,第一节 DNA的生物合成,一、DNA的复制,Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型推测DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂，两
2、条链分开然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制,半保留复制,A=TG=C,DNA合成的同位素示踪实验1958，Meselson和Stahl 大肠杆菌 15NH4CI为唯一氮源的培养液中生长若干代被15N标记的大肠杆菌转入14NH4CI为唯一氮源的培养液中完成第一代和第二代繁殖时，分离DNA，密度梯度超速离心被15N标记的亲代双链DNA（记作15N/15N）密度大，在下部；14N/14N密度小，在上部；15N/14N在15N/15N和14N/14N之间,（一）DNA的半保留复制,（二）DNA复
3、制开始于特定的起点,复制是从DNA分子上的特定部位开始的，这一部位叫原点（origin）从原点开始同时向DNA链的两个方向进行，结果形成一个分叉，称为复制叉（fork）,原核生物与真核生物DNA合成区别,大肠杆菌只有一个复制原点，Q形复制，速率1700bp/s高等生物有多个复制点，速率只有50bp/s,DNA的复制总是由5向3 方向进行前导链(leading strand)以35方向的母链为模板，连续复制合成的一条53方向的链随后链 另一条母链DNA是53方向，它作为模板时，复制合成许多条不连续的53方向的短链,（三）DNA复制中一股链是不连续合成,DNA复制的过程,（四）DNA复制相关的酶和
4、蛋白质,（1）DNA聚合酶,DNA聚合酶I是一个模板指导酶需要打开的DNA单链作为模板才能合成子链此酶催化的底物必须是脱氧的核苷5-三磷酸（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）DNA聚合酶 需要引物DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加于已存在的DNA或RNA链的3-羟基上，缺少则不能合成DNA聚合酶还具有水解作用DNA聚合酶I是一个35核酸外切酶，又是53核酸外切酶。这两种酶活性对DNA的复制都是十分重要的,由DNA聚合酶催化的链延长反应,2引物酶,复制合成先导链或随后链冈崎片段的引物是一段RNA（5-10个核苷酸）这段RNA由一种特异的RNA聚合酶合成，此酶称为引物酶（Primerase）。,
5、引物及引物酶的作用,已知DNA聚合酶具有35的外切作用以校对复制中的错误核苷酸。这就决定了它不能从头开始合成。因此先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以核糖核苷酸来标记是“暂时”的。这种高度精确的安排增加了DNA复制的复杂性，却保证了复制的忠实性。已知复制的误差率仅为十亿分之一至百亿分之一，即复制十亿到一百亿个碱基才可能出一个差错。,3.DNA连接酶,DNA聚合酶能将脱氧核苷酸加到引物RNA链上并延长，但不能催化两条DNA单链连接起来或把单条DNA链闭合起来。,二、DNA的损伤和修复,保证DNA分子的完整性对于生物是至关重要的在几亿年进化的过程中产生了对复制过程中偶然发生的错误，
6、进行校正的高效“校正”系统及由于客观因素造成的DNA损伤进行修复的系统。,（一）DNA的损伤,某些化学、物理的因素可引起细胞DNA的损伤（化学结构发生改变）化学因素种类繁多，机制也很复杂；物理因素中紫外线的作用机制研究得比较清楚。例如形成胸腺嘧啶二聚体。此外，DNA的损伤还有碱基可能改变或丢失、骨架中的磷酸二酯键可能断裂，螺旋链可能形成交联等。,胸腺嘧啶二聚体,紫外线引起DNA分子中同一条链上相邻的两个嘧啶核苷酸以共价键连接生成环丁烷结构，即嘧啶二聚体。最易见的是胸腺嘧啶二聚体。此种二聚体不能容纳在双螺旋结构中，它不能与互补链上的腺嘌呤形成氢键配对，影响DNA的复制和基因表达。,（二）损伤修复
7、系统,修复保护DNA的正常功能是非常重要的不论物理因素或化学因素所造成的损伤，只要DNA结构发生改变，就能被修复酶识别，而把不正常的部分切除光诱导的修复（光修复）不依赖光的修复（暗修复）在高等动物体内暗修复代替了光修复。,光修复,光修复也称光复活它是由可见光（300-400nm）激活光复活酶，该酶能分解胸腺嘧啶二聚体。已从细菌和动物的细胞中分裂出一种光复活酶。哺乳动物和人体内缺乏此酶。,暗修复,暗修复通过三种不同的机理来完成修复：1切除修复（excison repair）2重组修复（recombinational repair）3SOS修复（SOS repair）,切除修复,2重组修复,重组修
8、复是一种复制后修复。这种修复中含嘧啶二聚体的DNA片段仍可进行复制，但子链中在损伤的对应部位出现缺口。复制后通过分子内重组或称为姐妹链交换（sister-strand exchange），从完整的亲代链上把相应碱基顺序的片段移至子代链缺口处，使之成为完整的分子。亲链上的缺口由聚合酶I和连接酶填补完整，这就称为重组修复。,重组修复的结果,在重组修复过程中亲代链上的嘧啶二聚体并未消除，因此在进行第二次复制时子代链中仍会出现缺口，还需通过重组修复来弥补。但随着复制的不断进行，代数增多之后，虽然亲代链中的嘧啶二聚体仍然存在，而损伤的这一条DNA链却逐渐被稀释，最后对正常生理过程没有影响，损伤也就得到了
9、修复。,3SOS修复,这种修复是允许子链DNA复制合成时越过亲链上受损伤的片段而不形成缺口，称为旁路系统（bypass system）。这种修复以牺牲复制的忠实性为代价。例如修复嘧啶二聚体时，SOS系统被激活后，就沿复制叉前进合成子链，但在损伤对应部位随机放上两个腺嘌呤或其它错误核苷酸，子链虽合成但可能含有碱基错误。SOS修复的详细机理还不十分清楚。,三、RNA指导下的DNA合成,20世纪70年代从一些含RNA的肿瘤病毒如鸟类成髓细胞白血病病毒和劳氏肉瘤病毒中分离到一种独特的RNA指导的RNA聚合酶由于它以RNA为模板合成DNA，故此称为反转录酶（reverse transcriptase）,
10、反转录酶,反转录酶以病毒RNA为模板，在引物参与下以四种dNTP为底物，按53方向催化合成一条与模板RNA互补的RNA-DNA杂交链，其中的DNA链称为互补DNA链（cDNA）。然后再以新合成的RNA链为模板，合成另一条互补的DNA链，形成双链的DNA分子。新合成的双链DNA分子可以进入宿主细胞核，并整合到宿主的DNA中，随宿主DNA一起复制传递给子代细胞。在某些条件下此潜伏的DNA可以活跃起来转录出病毒RNA而使病毒繁殖。在另外一些条件下它也可以引起宿主细胞发生癌变。,逆转录病毒的生活周期,四、多聚酶链式反应（PCR）,多聚酶链式反应（PCR，Polymerase chain reactio
11、n），是20世纪80年代末发展起来的一种快速的DNA特定片段体外合成扩增的方法。,PCR反应的步骤,在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，人工合成的两个DNA引物，四种脱氧单核苷酸（dNTP），一种耐热的多聚酶和Mg2+。将上述溶液加热，使模板DNA在高温下（如95）变性，双链解开为两条单链；然后降低反应温度，使两条引物在低温下（37）分别与两条模板互补退火，形成局部双链；再升高反应温度至中温（72），此时多聚酶以dNTP为原料，以两引物为复制的起点，在两条模板上合成新的DNA子链。如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段。,PCR反应的结果,以三次改变温度为
12、一个循环，每一次循环就使欲扩增的DNA区段的拷贝数放大一倍即第一次循环，每条模板双链DNA变为2条；第二次循环，则变为4条；第三次循环，变成8条以几何级数扩增下去。一般样品经30次循环最终使特定DNA片段放大了数百万倍。,PCR的特点,（1）对DNA模板要求不高，纯度要求不严，用量很低，DNA分子量的长度仅为几百个bp，只要含有未损伤的需要扩增的片段即可。（2）引物设计十分重要，它决定了PCR扩增片段的大小及特异性。引物的设计是按需要及引物设计原则进行的。现在已有DNA合成仪，设计好的引物能很快合成。（3）需要一个耐热的DNA聚合酶。发现了TaqDNA聚合酶，PCR才进入实用阶段。PCR技术现
13、已成为分子生物学、医学、生物工程、法医学及考古学等领域不可缺少的工具。,PCR技术的应用,PCR技术可以广泛应用于科研和实际检测中，用于DNA研究、序列分析、测定基因表达，从cDNA可放大特定克隆、构建基因图、进化分析、生物证据分析和医学研究与临床检验等。,五、DNA核苷酸顺序测定,DNA顺序测定技术有A.Maxam和W.Gilbert提出的化学裂解法和1978年F.Sanger提出的双脱氧核苷酸末端终止法。以Sanger法最适用。,Sanger法的程序,Sanger法最突出的特点是在PCR反应中加入一种2，3-二脱氧核苷三磷酸（ddNTP），整个测定的程序如下：将被测DNA制成单链模板。分别
14、加入4个反应管中。并在每个管中加入引物、DNA聚合酶和4种dNTP（其中一种为32P标记）。然后在4个管中分别加入ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP。然后进行保温反应。由于双脱氧的ddNTP比正常的dNTP少了3-羟基，当它在DNA聚合酶作用下掺入到正在延伸的DNA链时，因ddNTP不含3-羟基，于是就阻止了其它dNTP的继续掺入，起了特异性终止剂的作用。,2，3-二脱氧核苷三磷酸结构图,Sanger法的结果分析,反应结束后在4个管中分别形成一些全部具有相同5-引物端、和分别以ddT、ddC、ddG、ddA 残基为3-端结尾的一系列长短不一的混合物。每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分
15、离及放射自显影，可见4种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表着一段以ddNTP终止的片段。只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测DNA的顺序。,第二节 RNA的生物合成,一、转 录,整个生物体所有的遗传信息，都编码在每个细胞的DNA分子中。DNA是通过转录（transcription），将遗传信息转移到RNA分子上。转录就是以DNA为模板合成RNA的过程。,（一）DNA的大小与基因,在整个DNA的分子上分布着许多特殊的片段。在这些片段中有些是为一种或几种蛋白质的全部氨基酸编码的核苷酸顺序，称为基因（gene），也称为顺反子或多顺反子。通常也把这些编码蛋白质的基因片段称为结构基因。在
16、DNA分子上还有些片段是为rRNA和tRNA编码的核苷酸，这些片段有时也称为基因。有些DNA片段，不编码基因而是一些不被转录的调控区，它们具有主宰基因转录和表达的功能，是基因不可缺少的部分。,重复基因,DNA中有些基因是重复的，称为重复基因。原核生物中的重复基因数较少，真核生物中重复基因则很丰富如酵母的tRNA基因为每一种不同的tRNA编码的基因平均达10个重复基因这种多重复基因的现象，是为适应细胞的分裂和增殖的需要。,基因重叠,DNA分子中的基因的组合也很不相同在一些病毒中存在基因重叠的现象，如大肠杆菌噬菌体174DNA序列中基因排列。,不连续基因,真核生物的许多基因是不连续的，即一个完整的
17、基因被一个或更多个插入的片段所间隔。把这些插入而不编码的序列称为内含子（intron），把被间隔的编码蛋白质的基因部分称为外显子（exno）。转录出来的所有RNA都必须经过加工，除去其中的内含子并经复杂的修饰才能成为成熟的各种RNA，其中的mRNA才能成为合成蛋白质的模板。,（二）双链DNA中仅有一段被转录,基因中仅一股链被转录。现在把被转录的一股链称为模板链，另一股链称为编码链。mRNA与模板链是互补的。mRNA的核苷酸顺序则与编码链完全相同，只是其中以U代替了T。因此，mRNA的遗传信息与编码链相同，代表了基因的编码顺序。,（三）RNA聚合酶,基因的转录是由RNA聚合酶（RNA polym
18、erase）催化。RNA聚合酶催化底物合成时是形成磷酸二酯键。合成的方向是53：即RNA聚合酶是沿着模板链的3 5方向移动。RNA聚合酶的条件模板，双链DNA或单链DNA均可作模板。活化的底物，需要4种三磷酸的核苷酸：ATP，GTP、UTP及CTP为反应底物。二价金属离子，主要是Mg2+和Mn2+。,RNA聚合酶的结构组成,大肠杆菌的RNA聚合酶是一个非常大的（450KD）极其复杂的酶分子。它由4种亚基组成。整个酶的亚基组成是2，称为全酶。没有亚基的RNA聚合酶称为核心酶（2）。RNA聚合酶中各亚基的作用亚基激活RNA聚合酶使之识别转录起始点的序列，并参与解开DNA双链，找到模板链。当转录开始
19、合成RNA链后，亚基就从全酶中解离下来。解离下来的亚基可与另一核心酶连接，开始另一轮的转录。核心酶继续对DNA模板转录。全酶的作用是识别起始，而核心酶的作用是延长及辨认转录终止。,（四）DNA模板上的启动子,概念转录起始于RNA聚合酶结合在被转录的DNA区段上。结合的特定部位称为启动子（promoter）。它是20至200个碱基的特定顺序。习惯上将+1以下的转录方向称“下游”，-1以上称“上游”，启动子在上游区。现在发现原核生物的启动子顺序中存在两个共同的顺序，即-10顺序，也称为Pribnow顺序（pribnow box）和-35顺序。,启动子中不同顺序的作用,-10顺序-10的基本顺序是T
20、ATAATG。-10顺序被看作是双螺旋打开形成开放启动复合物的区域。-35顺序典型的情况下含有9个碱基，被认为是酶结合的起始部位。启动子常以单位时间内合成RNA分子数的多少分为强启动子和弱启动子。据认为强弱之间的区别就存在于-35的结构中。,启动子处的反应,聚合酶含有两个核苷酸结合位点，称为起始部位和延伸部位。起始部位结合三磷酸嘌呤核苷酸ATP或GTP。转录与复制不同，不需要引物，因而合成的RNA第一个核苷酸常常是pppA或pppG。,（五）延长在转录鼓泡上进行,转录泡是一个含有核心酶、DNA和新生RNA的区域，在这个区域里含有一段解链的DNA“泡”，所以称为转录泡（transcription
21、 bubble）。在“泡”里新合成的RNA与模板DNA链形成一杂交的双螺旋。此段双螺旋长约12bp，相当于A型DNA螺旋的一转。在“泡”里核心酶始终与DNA的另一链（编码链）结合，使DNA中约有17个bp被解开。延长速率大约是每秒钟50个核苷酸，转录鼓泡移动170nm的距离。,RNA-DNA杂交链的长度,在RNA聚合酶沿着DNA模板移动的整个过程中形成的RNA-DNA杂交链的长度及DNA未解开的区域长度均保持不变。杂交双链12bp的长度恰好短于双螺旋完整的一转，当形成完整的一转前，RNA因弯曲很厉害即离开了DNA模板，防止了RNA 5-末端与DNA相互缠绕打结。,转录的错误频率,RNA聚合酶没
22、有核酸外切酶活性，不能对进入RNA链的核苷酸进行校正，所以转录的错误频率是每104或105中有一个错误，是DNA复制中错误的105倍。这种准确性虽很低，但由于RNA的转录产物很多，极少数有缺陷的转录产物大概不会产生有害的影响。,（六）转录终止,转录有终止点，转录终止出现在DNA分子内特定的碱基顺序上。细菌及病毒DNA的终止顺序分析证明，它们有明显的特点。富含GC，转录产物极易形成二重对称性（dyadsymmetry）结构，紧接GC之后有一串A。按此模板转录出来的RNA极易自身互补，形成发夹状结构新生的RNA链却以几个U残基而结束。当RNA聚合酶遇到这种结构特点时就会停止下来。,二、RNA转录后
23、的加工成熟,1.原核生物的mRNA成熟过程 2.原核生物的tRNA成熟过程 3.原核生物的rRNA成熟过程,1.原核生物的mRNA成熟过程,原核生物的mRNA通常不用修饰，因生成的mRNA高度不稳定，当它们的3末端合成尚未完成时，mRNA的5末端已经开始降解。mRNA的转录和翻译是同步发生的，mRNA仅仅合成一部分时，翻译就开始了，翻译结束，mRNA就开始降解。,2.原核生物的tRNA成熟过程,tRNA的成熟过程较为复杂，包括切割与核苷酸的修饰。多数tRNA的前体约比成熟分子大20，在5和3端都含有多余的顺序。这些多余顺序由特异的核酸酶RNase P及Rnase Q（或RNase）分别在5和3
24、端进行切割。,稀有碱基,稀有碱基的形成是在转录后与切割同时完成的。碱基的修饰是由酶催化的如甲基化酶，该酶能将甲基引入tRNA核苷酸的不同位置。,3.原核生物的rRNA成熟过程,大肠杆菌的rRNA是由三种rRNA丛集在一起形成一个转录单位，彼此由间隙区（内含子）分隔开来。在间隙区中还存在着tRNA。这些rRNA和tRNA基因同时转录，形成一个长的RNA分子。在原核生物中，加工修饰与转录是同时进行的，因此在细胞内从来不存在完整的前体分子。,由16sRNA、tRNA谷、23sRNA、5sRNA和tRNA色以及在远端的另一个tRNA天冬等组成,三、真核生物中的转录,真核生物中的转录比原核生物复杂，其主
25、要差别如下：1真核生物中转录与翻译处在不同的区域 2RNA聚合酶不相同 3启动子不同 4转录后RNA加工修饰不同,1真核生物中转录与翻译处在不同的区域,在原核生物中mRNA的转录与翻译几乎是同步发生的。而真核生物，转录是发生在细胞核内，翻译则在核外进行。转录合成的RNA必须穿出核膜才发挥作用。这种转录和翻译在空间上和时间上的分隔使得真核生物能够以精巧的方式进行RNA的加工、修饰、拼接，增强了真核生物对基因转录和翻译的调控。,2RNA聚合酶不相同,原核生物中RNA由一种聚合酶合成。在真核生物中则有三种类型的RNA聚合酶。,3启动子不同,已知真核生物的启动子与原核生物的很相似，也位于转录起始部位的
26、5端，但存在着几个重要的区域。如距起始部位最近的一个是在-25处，称为TATA盒（Hogness盒），与原核的-10顺序（TATAAT）极为相似。它是启动子活性所必需的。此外在-40和-110之间还有更多的影响启动的碱基。具体的生物学功能尚在研究中。,4转录后RNA加工修饰不同,（1）mRNA加“帽子”和“尾巴”的修饰（2）mRNA的剪切加工（3）rRNA 的剪切加工（4）tRNA 的剪切加工,（1）mRNA加“帽子”和“尾巴”的修饰,原核生物的只有几秒钟。而且不用加工修饰。真核生物mRNA分子的寿命较长，有的可达几小时，真核生物的mRNA在5和3两个末端都要受到修饰。5末端要形成一种称作帽子
27、（cap）的复杂结构。,帽子,在mRNA5末端连接一个7-甲基的鸟苷。连接帽子的头两个核苷酸的核糖也被不同程度的甲基化。,mRNA3末端的poly（A）结构,在mRNA3末端则要加上一段多聚腺嘌呤核苷酸poly（A）:（AAAAAAAAA-）的顺序，长度可达20至200个核苷酸。,真核生物中mRNA的加“帽子”和“尾巴”的生物学意义,真核生物中mRNA的加“帽子”和“尾巴”的生物学意义尚不十分清楚。添加帽子发生在mRNA合成起始不久，其功能也许是保护mRNA免受核酸酶降解，以及为蛋白质合成机器（核糖体）提供识别特征。加“尾巴”可能增加mRNA的稳定性，并对mRNA附着于细胞的内膜上也可能有作用
28、。,（2）mRNA的剪切加工,真核生物每种mRNA分子内部含有数目变化很大的内含子。最少的是2个，最多的例如-胶原蛋白在转录单位中含52个内含子之多。这些内含子广泛地分布于mRNA的前体分子中，长短各不相同，但都比外显子长。真核生物mRNA前体物的剪切加工，包括内含子的剪除及留下的片段拼接成成熟mRNA等过程，称为RNA剪接（RNA Splicing）。剪接是在核内进行，而且是在加上“帽子”和接上“尾巴”之后。整个剪接过程完成之后，5端的“帽子”和3端的“尾巴”并不丢失。,原核生物 真核生物,核不均一RNA,在细胞内任何时候都存在着大量正在加工似乎无用的RNA分子。这些分子总称为核不均一RNA
29、hnRNA。,（3）rRNA 的剪切加工,在典型动物细胞的核仁中有一段几百个拷贝的DNA顺序（核糖体DNA或rDNA）编码18s，5.8s和28srRNA分子。5srRNA基因位于核仁之外，处在另一个转录单位中，基因长24000个拷贝。所有的rRNA转录物都需要加工，过程与原核相似，即剪切5和3末端和切除转录物中不需要的区域。,（4）tRNA 的剪切加工,真核生物的tRNA也是一个大转录物（tRNA前体转录物），这些转录物可能含有一个或多个tRNA的顺序。成熟的tRNA也是在转录后经剪切加工而成。,第三节 催化活性RNA的发现,一、TCech的发现,1982年塞克（TCech）及其同事在用四膜
30、虫（Tetrahymena）研究rRNA剪接的过程中引出了一个非常出人意料的发现。,四膜虫核糖体RNA的前体长4.6kb，必须除去一段414bp的内含子，才能产生成熟的26srRNA。塞克（TCech）及其同事发现只需核苷酸存在下，RNA就能剪接自身或自我剪切（self-splicing）。即RNA分子本身具有高度的专一性和催化活性。,其它催化活性RNA的发现,对大肠杆菌核糖核酸酶P（Rnase P）的研究真核的酵母和真菌的线粒体中的发现对核糖体大亚基的研究,早期RNA世界,在DNA和蛋白质出现之前，生命进化的早期存在着一个RNA的世界。这些RNA分子集信息编码和催化功能于一身;经过亿万年的衍
31、变进化，开始合成蛋白质，由于蛋白质有20种氨基酸的多侧链，比RNA的4个碱基更为多样性，于是逐步替代RNA形成催化活性更高的酶；由RNA衍变，出现反转录开始形成DNA。由于DNA的双螺旋比单链的RNA更稳定，因此替代RNA成为遗传信息稳定的贮藏所，成为今天专管遗传信息编码的载体。,第四节 蛋白质的生物合成,蛋白质的生物合成概述,生物体每个蛋白质的生物合成都受DNA的指导，但贮存遗传信息的DNA并非蛋白质合成的直接模板，而是转录了遗传信息的mRNA。以mRNA为模板合成蛋白的过程称为翻译（translation）或称为表达（expression）。,遗传信息是如何储藏在4种核苷酸中的？如何破译遗
32、传密码？,一、遗传密码,数学家、物理学家逻辑运算或推导分子生物学家？,遗传密码的破译,1955年 纽约大学Grunberg-Manago用将核苷酸连接起来的酶形成RNA聚合体 A连接成多聚A（polyA，A-A-A-A-A-A-A）polyC polyG polyU polyAU问题：什么样的核苷酸组合可以被翻译成多肽片段？1960年德国人 31岁 Matthei 和美国国家健康研究所 33岁 的Nirenberg将ATP和游离的氨基酸加入到从细胞中提取的核糖体、核酸和酶的混合物中在试管中合成多肽问题：哪一种RNA可促进多肽的合成？,在试管中加入了ATP、游离的氨基酸、酶和核糖体及核糖体RNA
33、没有蛋白质的合成 问题：需要其他带有遗传信息的RNA？,Marianne Grunberg-Manago方法人工合成RNA 加入不同的酶、核糖体、ATP、氨基酸 加入poly U、poly A、poly AU poly U产生了许多蛋白质 问题：poly U主要利用了哪些氨基酸呢？,不同的氨基酸分别加入到poly U试管系统中 5天通宵达旦 星期六早晨，熬红了眼的Matthei得到了答案：poly U合成的肽链全部是苯丙氨酸（Phe）世界上破译第一个遗传密码的人,问题：几个U决定一个苯丙氨酸的合成？,Nirenberg 莫斯科 第五届国际生物化学大会不善于推销自己 小组会上 Meselson认
34、为非同小可 全体大会上重新做学术报告,问题：几个U决定一个苯丙氨酸的合成？Nirenberg全力组织其他遗传密码的破译 Nirenberg发现并定义了3个核苷酸为一个密码子 决定一个氨基酸的翻译Khorana 按需要连接任意核苷酸 ACACACACACACAC thr-his-thr-his链ACA苏氨酸的密码子CAC组氨酸的密码子,1966年，Nirenberg和Khorana 全部遗传密码字典 64个密码子 61个负责20种氨基酸翻译，3个终止密码子Nirenberg 和 Khorana 1968年 诺贝尔奖,遗传密码,遗传密码DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中的氨基酸序列之间的
35、对应关系称为。密码子DNA（或mRNA）上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸,这3个核苷酸就称为密码子,（二）遗传密码的主要特征,1.密码子高度简并 2.密码的通用性 3.遗传密码的变异性 4.重叠基因与重叠密码,二、解码系统,氨基酸与tRNA分子的连接，也称为氨基酸的活化密码子一反密码子的相互作用 反密码子 3-X-Y-Z-5 密码子 5-X-Y-Z-3摆动假说前两个碱基对是标准型的碱基互补，以保证结合有最大限度的稳定性，第三个碱基则要求不那么严格，可以允许结构上有小小的波动（即摆动）。在Holley测定的酵母tRNA Ala顺序中发现反密码子是TGC，它可以识别丙氨酸的同义密码子
36、GCU、GCC、GCA。,氨基酸+tRNA+ATP 氨基酰-tRNA+AMP+PPi,氨基酰-tRNA合成酶,三、核糖体,核糖体（ribosome）是蛋白质合成的主要场所。它含有蛋白质合成中所需要的多种酶活性，能将mRNA分子的碱基顺序翻译成氨基酸顺序。,（一）核糖体的化学组成,真核生物核糖体,真核生物的核糖体大约是80s40s亚基18srRNA约30种蛋白质60s亚基5s、5.8s、28srRNA50种蛋白质,（二）核糖体的结构与功能,核糖体的结构至少要满足如下的部位：容纳mRNA的部位，结合氨基酰-tRNA的部位（称A-位点），结合肽基-tRNA的部位（称P-位点），形成肽键的部位（转肽酶
37、中心）。识别并结合mRNA上特异的起始部位，能沿mRNA移动以“解读”全部信息，在翻译结束后肽链脱落掉下等功能。,（三）多核糖体,蛋白质合成过程中一个mRNA的分子上不止结合一个核糖体而是一群核糖体，称多核糖体（polysome）。,多个核糖体同时翻译一个mRNA分子，这显著提高了mRNA的利用率。一条mRNA的最大利用率可达每80个核苷酸结合一个核糖体。合成的多肽释放后，核糖体即解离成30s和50s亚基。,四、蛋白质合成的过程,（一）翻译起始（二）肽链延长（三）肽链合成终止三个阶段,（一）翻译起始,大肠杆菌内蛋白质合成的起始，是从核糖体小亚基30s与fMet-tRNAfmet及一个mRNA分
38、子起始因子参与下形成起始复合物开始。最终形成70s的起始复合物，完成翻译起始阶段。,fMet-tRNA fMet,大肠杆菌蛋白质合成的第一个氨基酸都是甲酰化的甲硫氨酸，即N-甲酰甲硫氨酸（fMet）。Met的甲酰化是在Met-tRNAfMet合成后，由转甲酰基酶催化，从N-9-甲酰四氢叶酸（fTHF）上将甲酰基转移到甲硫氨酸的NH3+基上形成。但转甲酰酶不会催化组成肽链中的甲硫氨酸甲酰化。,翻译起始信号,作为起始密码子的AUG通常离mRNA5-末端约20-30个碱基，在这段前导顺序中，具有一段特殊顺序AGGAGGU，位于起始AUG之前的固定的位置上，称为S.D序列核糖体小亚基30s内的16sr
39、RNA3-末端有顺序5-PyACCUCCUUA-3，Py可以是任何嘧啶核苷酸。于是这段顺序即与mRNA前导顺序中的AGGAGGU能形成稳定的碱基对。,翻译起始信号示意图,mRNA翻译的方向,翻译的方向是沿mRNA的53方向进行。所以，在大肠杆菌中，当mRNA的5端刚转录合成后不久就与核糖体结合开始翻译。,（二）肽链延长,蛋白质合成的肽链延长阶段包括进位肽键形成移位,1进位,2肽链形成,3.移位,（三）肽链合成的终止,当70s移位至A位出现终止密码子时，就没有氨基酰-tRNA再进入A位点，肽链延长停止。终止过程是由释放因子（release factor，RF）参与下完成的，使P位上的肽链转移至水
40、中，形成游离肽链，同时70s释放出50s核糖体亚基。此时，另一个被称为核糖体释放因子（ribosome releasing factor，RR）的成分参与使30s与mRNA分开。脱去肽链的tRNA与终止因子也离开。分离后的50s、30s又可为合成另一条肽链所用。,蛋白质的合成过程,五.真核生物的蛋白质合成,真核生物中蛋白质合成的基本过程与原核生物中类似。只是真核生物蛋白质合成时参与的蛋白组分较多，有些步骤更为复杂。,六.蛋白质的加工,从mRNA翻译得到的蛋白质多数是没有生物活性的初级产物。只有经翻译后的加工过程才能成为有活性的终产物。加工包括修饰折叠,蛋白质的折叠,助折叠蛋白酶二硫键异构酶加速
41、蛋白质中形成正确的二硫键肽酰脯酰顺反异构酶催化肽脯氨酰之间肽键的旋转反应，从而加速蛋白质的折叠过程分子伴侣能帮助新生肽链正确组装，成熟，自身却不是终产物分子成分的蛋白质,（二）蛋白质的修饰,（1）N-端修饰除去甲酰基，多数情况甲硫氨酸也被氨肽酶除去（2）多肽链的水解切除水解切除多余的肽段，使之折叠成为有活性的酶或蛋白质。（3）氨基酸侧链的修饰氨基酸侧链的修饰包括 羟化、羧化、甲基化、二硫键的形成等（4）糖基化修饰糖糖基化是多种多样的，可以在同一肽链上的同一位点连接上不同的寡糖，也可以在不同位点上连接寡糖。糖基化是在酶催化下进行的。,第五节 蛋白质的到位,蛋白质到位的机制,信号肽除了少数蛋白外，
42、几乎所有分泌蛋白都在N-末端含有一段信号序列（Signal sequences）或称为信号肽。信号识别蛋白（SRP）能识别正在合成多肽并将要通过内质网膜的核糖体，与信号肽相结合，形成SRP-信号肽-核糖体复合物，并暂时停止多肽链的合成。随即SRP将复合体从细胞质引向内质网膜。停靠蛋白（DP）膜上SRP的受体，与复合体相结合，释放出SRP。通过一个依赖GTP的过程，内质网膜被打开一个通道，信号肽穿过膜与膜内另一受体SSR（SSR）相结合核糖体上暂时停止的多肽链又恢复合成延长。这样新生的肽链就尾随信号肽穿过膜延伸进入内质网。进入内质网的信号肽在蛋白质肽链合成完成之前，即由内质网内的信号肽酶切除。,
43、第六节 中心法则,第七节 基因表达调控,DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总称为基因表达基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控在高度复杂的生物细胞及其多种多样的代谢过程中，基因的表达是高度有序的。,一、原核生物基因的表达和调控,乳糖操纵子学说,乳糖进入肠道后，大肠杆菌会立刻制造出一些特殊的酶，其中最主要的为b-半乳糖苷酶，来吸收和利用作为细胞能源的乳糖。法国科学家Monod和Jacob发现，大肠杆菌在不含乳糖的葡萄糖培养基中不会分泌b-半乳糖苷酶；相反，含有乳糖时，会合成b-半乳糖苷酶
44、，使乳糖水解。经过一系列的实验后，他们又发现，大肠杆菌在没有乳糖的环境中不产生编码b-半乳糖苷酶的mRNA。1961年，他们提出了一种模型即乳糖操纵子学说。,乳糖操纵子,结构基因编码b-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。操纵子包括启动子、操纵基因和结构基因调节基因、阻遏蛋白乳糖+阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状,第八节 分子生物学技术,分子生物学技术,概念以DNA和RNA的体外操作为核心建立的一系列试验技术包括DNA和RNA的分离制备基因的分离核苷酸的顺序分析分子杂交DNA重组转基因技术克隆技术DNA指纹技术,一、DNA重组技术,概 述,DNA重组技术（recomb
45、inant DNA techniques）运用多种限制性内切酶和DNA连接酶等，把DNA作为组件，在体外将一种DNA和载体DNA重新组合，转入宿主体内，使外源基因表达，最终改变生物原有遗传性状的综合技术由于这项技术是按照人们预先设计的方案，实现体外基因改造，最后使生物的遗传性状获得改变，故又称为“遗传工程（genetic engineering）”或“基因工程（gene engineering）”、“分子克隆（molecular cloning）”。基因工程是采用分子生物学、核酸生物化学以及微生物遗传学的现代方法和手段建立起来的综合技术。基因工程技术的建立，使所有实验生物学领域产生巨大变革。,
46、DNA重组技术发展,1970年，Smith等人从细菌中分离出的一种限制性酶，酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年，Berg等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和l噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来，得到新的DNA分子。,1973年，Cohen等进一步将酶切后的DNA分子与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中。,（一）DNA重组技术基础,核酸的制备关键在于对核酸酶的抑制DNA制备操作相对简单很难获得完整的DNA大分子RNA制备难度较大,2.限制性内切核酸酶,概念 一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具生命的手术刀。这种酶能识别双链DNA分子中一
47、段特异的核苷酸序列，在这一段序列内将双链DNA分子切断。细菌细胞中存在限制/修饰系统限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中。,限制性内切酶的类别第类酶每隔一段DNA序列随机切割双链DNA分子，没有序列特异性,酶切位点不定。如EcoB(大肠杆菌B株)、EcoK(大肠杆菌K株)分子量较大(约300000)，作用时需ATP、Mg+等辅助因子。第类酶能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列。如EcoRI(大肠杆菌)、Hind(嗜血杆菌)，分子量较小(约20000-100000)，作用时需Mg2+存在。,第类酶特点：,(1)切割产生平
48、末端(blunt ends),如Sma：,(2)有的产生粘性末端,从两个方向阅读而序列相同的序列。,识别特定碱基顺序，为回文对称序列,又称反向重复序列：,如EcoR：,3.载体,载体（vector）能将外源基因DNA带入宿主细胞，并复制或最终使外源基因DNA表达的自主DNA。将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。类型质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等。,细菌质粒,概念质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。质粒能从细菌中提取出来，又能转入细菌，这个过程称为转化。质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。,4.宿主细胞,概
49、念可使外源基因得以增殖和表达的活细胞类型细菌、酵母、真菌、各种真核细胞、受精卵,（二）DNA重组的基本过程,目的基因的获得准备基因，载体和工具酶等。重组目的基因与载体结合形成重组DNA分子。转化重组DNA分子引入受体细胞，并克隆。分离、鉴定筛选目的基因在受体细胞能够正确表达的无性繁殖系。,DNA重组技术说明,不同来源、无关的基因在实验室中可以按人的愿望进行重组构建。重组的外源基因引入另一种生物细胞后，可以被增殖并保持原有的遗传性状，在新的环境中转录和翻译。使宿主的遗传性状按照设计的路线发生永久性的改变,二、转基因技术,1982年Palmiter等人，首次将大鼠的生长激素基因放在小鼠金属巯基蛋白
50、启动子之后，显微注射入小鼠受精卵，获得“超级属”。,具有生长激素的转基因鼠,转基因的方法和技术：,1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。,1985年，转基因植物获得成功。,1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。,1996年，克隆羊诞生。,1996年全世界转基因植物种植面积为170万公顷，1997年为1100万公顷，1998年为2780万公顷，1999年达到3990万公顷，2000年达到4420万公顷，2001年达到5260万公顷，2002年达到5000万公顷。,转基因动物:,与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。,转基因动物：目的基因+载体
