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1、The Central Dogma,by Francis Crick in 1958,DNA的生物合成 和损伤修复 DNA Biosynthesis and DNA Damage Repair,第十五章,第三篇 基因信息传递,染色体DNA复制的一般特征The general features of replication of chromosomal DNA,第一节,一、DNA复制是半保留复制,1958 Meselson-Stahl实验,双螺旋DNA复制时，复制区生长点的结构呈Y形或叉形，称之为复制叉(replication fork)。,二、DNA复制的生长点形成复制叉,目 录,三、DNA复
2、制是双向复制,一个起点，两个复制叉，双向复制。两个起点，两个生长点，单向复制。一个起点，一个复制叉，单向复制。,四、DNA复制为半不连续复制,前导链（leading strand）后随链（lagging strand）冈崎片段（Okazaki fragments)DNA半不连续复制。,复制起点（origin）：,五、复制起点由多个短重复序列组成,原核生物单一复制起点,真核生物多个复制起点,复制子（replicon）从一个DNA复制起点起始的DNA复制区域。,E.coli 复制起始点 oriC,复制起点的一般特征:多个短重复序列;可被复制起始因子所识别;一般富含AT，利于DNA解旋。,Green
3、:initiator binding sitesBlue:unwound regionRed:replication initiation site,六、DNA复制必须有引物,（一）多数DNA复制使用RNA引物（二）个别DNA复制以DNA或核苷酸为引物174等噬菌体以双链环形DNA的一条链上产生切口处的3-OH为引物；腺病毒及某些线性DNA病毒以DNA末端蛋白上的dCTP的3-OH为引物。(三)体外DNA合成采用DNA作引物,Protein priming as a solution to the end replication problem.,DNA聚合酶：催化合成DNADNA解旋酶（he
4、licase）：解开DNA双螺旋，暴露复制模板链引发酶：引发，即合成RNA引物，利用引物3-OH开始延伸DNA连接酶：连结冈崎片段其它酶和蛋白因子,七、DNA复制需要多种酶参与,如：起稳定作用的单链DNA结合蛋白（SSB）和改变DNA超螺旋状态的DNA拓扑异构酶（topoisomerase）等。,DNA聚合酶的合成前误差控制(presynthetic error control)和校正控制(proofreading control)功能。细胞修复系统是DNA复制高度忠实性的重要因素。复制起始利用引物也是确保DNA复制忠实性的重要机制之一。,八、DNA复制具有高度忠实性,DNA聚合酶的特征 Fe
5、atures of DNA polymerases,第二节,一、DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板连接处,dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）,引物-模板复合物/连接处(primer-template junction),Correctly paired bases are required for DNA polymerase catalyzed nucleotide addition.,二、DNA聚合酶的活性中心催化DNA合成,Schematic illustration of WHY rNTP can not be used by DNA polymerase,三、D
6、NA聚合酶半闭合右手结构有3个结构域,聚合酶活性中心，位于手掌上部，即手指和拇指接合部；35外切酶活性中心，位于手掌底部。,手掌结构域手指结构域拇指结构,DNA聚合酶合成的进行性（processivity):DNA夹子（sliding clamp）可增强DNA聚合酶的进行性。,四、可滑动的DNA夹子增强DNA聚合酶的进行性,DNA聚合酶35外切酶活性与校对功能(proofreading).,五、DNA聚合酶还有一个35外切酶活性中心,大肠杆菌DNA复制过程DNA replication in E.coli,第三节,E.coli DNA复制起始,一、在复制起点解旋酶和多种因子形成复合物,识别复制
7、起点；解旋解链,形成复制叉单链DNA形成，SSB结合单链引发体组装及引物合成。,DnaA、DnaB、DnaC、HU、促旋酶（gyrase，即拓扑异构酶）、单链DNA结合蛋白(single strand binding protein,SSB),DNA复制起始需要6种蛋白因子：,E.coli 中DnaB结合引发酶DnaG，催化合成RNA引物，其序列始于pppAG，模板链序列3-GTC-5，引物长度一般1112个碱基。,二、引发酶合成RNA引物,负责切除RNA引物。,三、DNA聚合酶合成DNA，DNA聚合酶切除引物,DNA聚合酶,可利用损伤尚未修复的DNA链作为模板合成DNA，但不能修复损伤。,负
8、责合成DNA。,DNA聚合酶,DNA聚合酶,原核、真核细胞DNA聚合酶的类型和功能,目 录,DNA聚合酶全酶结构,核心酶由、和亚基组成：亚基（130 000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（校正功能）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用complex/clamp loader,在复制叉同时合成前导链和后随链,同一个聚合酶如何同时合成两条链?,在复制叉同时合成前导链和后随链,三、DNA聚合酶合成DNA，DNA聚合酶切除引物,DNA聚合酶切除引物DNA连接酶（ligase）将两个冈崎片段之间的缺口,DNA聚合酶 53外切酶：去除RNA引物35外切酶：起校正作用DNA聚合酶活性：填补缺口,
9、323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段：Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Ter(terminus)Tus(terminus utilization substance).,四、Tus蛋白识别复制终点使复制终止,1)Parent DNA are fully methylated;2)Daughter DNA are hemimethylated3)SeqA quickly binds to hemimethylated sequences;4)Inhibits full methylation and bind
10、ing of OriC by DnaA;,Dam methylase methylates DNA at the N6 position of all adenines within GATC sequences.,五、DNA甲基化保证复制起点在每个复制周期中仅起一次作用,E.Coli DNA replication is regulated by DnaA,ATP levels and SeqA,SeqA sequester DnaA binding of OriC;Additional DnaA binding sites in the chromosome(300,after repli
11、cation it is duplicated)and thus decrease the DnaA level available;ATP level and the replacement of DnaA-ADP to DnaA-ATP is a slow process.,复制过程中产生正超螺旋。拓扑异构酶消除正超螺旋。,六、DNA复制需要两类DNA拓扑异构酶,E.coIi的Topo只作用于负超螺旋DNA，消除负超螺旋。,DNA拓扑异构酶的功能：,E.coli的Topo将前方产生的正超螺旋转变为负超螺旋。,DNA拓扑异构酶的功能,E.coli 的Topo分离连环体,Replication
12、 termination in Eukaryotes:The end replication problem,Page333,Solution 1:Protein priming as a solution to the end replication problem.,Solution 2:Replication of telomeres by telomerase,Replication of telomeres by telomerase,线粒体和噬菌体的DNA复制DNA replication in mitochondria andphages,第五节,一、线粒体DNA按D环方式复制,
13、环形、双螺旋DNA分子、一条H链和一条L链,线粒体DNA分子特点：,两条链具有不同的复制起点和相反的合成方向；,二、噬菌体DNA按滚环方式复制,环形双螺旋DNA分子；一条为模板链，另一条为非模板链?,E.coli 噬菌体DNA的分子结构特点：,滚环复制,DNA polymerase error rates,Initial pairing error=1/105 After proofreading-Final copy=1/107Actual error rates1/109Human genome=3.2 x 109 bp3 errors/replication!,Mutation of D
14、NA,Too fast:harmful to survival and proliferation;Too slow:lack of evolution force.,DNA damage and repair,DNA Damage:Any changes in the DNA molecule is refered to as.Mutation:A permanent change in the nucleotide sequence of DNA is called a mutation.,Importance of DNA Repair DNA is the only biologica
15、l macromoleculethat is repaired.All others are replaced.More than 100 genes are required for DNA repair,even in organisms with very small genomes.Cancer is a consequence of inadequate DNA repair.,DNA损伤修复The Repair of DNA Damage,第六节,一、复制差错和化学/物理因素造成体内DNA损伤,DNA复制产生误差 化学或物理损伤 转座子（transposons）的转座作用自发突变,
16、遗传信息的突变来源：,首先，在基因组中迅速找到错配的核苷酸；然后，准确地校正错配核苷酸。,二、错配修复系统修复DNA复制中出现的差错,错配修复系统（mismatch repair system）能够发现和修复DNA复制中错配的核苷酸，提高复制准确率。,错配修复系统：,E.coli错配修复系统修复复制差错,（一）E.coli依赖Dam甲基化酶识别错配碱基所在的DNA链,模板链的GATC序列甲基化,MutH仅切割新合成的DNA链,MutH仅切割新合成的DNA链,MSH（MutS homologs）蛋白与MutL同源的MLH和PMS蛋白,（二）真核细胞利用冈崎片段连接前的DNA缺口辨别错配碱基所在的
17、DNA链,真核细胞错配修复系统无MutH，也无半甲基化标记母链。错配修复系统利用冈崎片段连接前的DNA缺口辨别错配碱基所在的DNA链。,真核细胞核苷酸修复错配系统：,三、多种化学或物理因素造成细胞DNA损伤,其一，导致复制或转录障碍其二，导致复制后产生基因突变,DNA损伤的结果:,四、DNA损伤修复系统有多种类型,修复对象：将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解。分布：分布广泛，除哺乳动物外均有之。,（一）直接修复（direct repair）系统利用酶简单地逆转DNA损伤,光复活修复系统：,修复对象：DNA中被甲基化修饰的鸟嘌呤（O6-甲基鸟嘌呤，与T配对）。特点：DNA甲基转移酶一旦
18、接受甲基就不再具有催化活性，修复代价高昂。,O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶修复,E.coli碱基切除修复系统切除胞嘧啶自发脱氨基产生的尿嘧啶,（二）碱基切除系统修复切除受损碱基Base excision repair,BER,胞嘧啶脱氨基产生的尿嘧啶；氧化的鸟嘌呤（oxoG）；脱氨基的腺嘌呤；开环碱基；碳原子之间双键变成单键的碱基等。,DNA糖苷酶识别的异常碱基包括：,（三）核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形,nucleotide excision repair,NER,NER识别DNA双螺旋结构变形而非特殊碱基,UvrA识别DNA双螺旋结构变形UvrB负责解链，募集核酸内切酶UvrCU
19、vrC在损伤部位的两侧切断DNA链UvrD去除这两个切点之间的DNA片段DNA聚合酶和连接酶填补缺口,（四）重组修复系统能够修复双链断裂损伤,E.coli 跨损伤DNA合成,（五）跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位合成DNA,第七节 逆转录,概念：在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。,Reverse transcription,RNA肿瘤病毒DNA原病毒（或前病毒）RNA肿瘤病毒,1964年,Temin等提出，原病毒（provirus）DNA是RNA肿瘤病毒在复制过程中的中间物。,逆转录酶的结构与功能,逆转录酶有3种酶的活性：RNA指导的DNA聚合酶活性；DNA指导的DNA聚合酶
20、活性；RNAse H的活性。,逆转录病毒RNA基因组和原病毒,二、逆转录酶以tRNA为引物合成双链cDNA,逆转录酶的发现发展了中心法则。该酶是分子生物学研究中常用的工具酶.,David Baltimore,Renato Dulbecco,Howard Martin Temin,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975,End!,Figure 16.6 Minus strand DNA is generated by switching templates during reverse transcription.,16.2 The retrovirus life cycle involves transposition like events,Figure 16.7 Synthesis of plus strand DNA requires a second jump.,16.2 The retrovirus life cycle involves transposition like events,The Central Dogma,
