现代分离方法与技术第7章 制备色谱技术课件.ppt

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1、第7章 制备色谱技术,7.1 制备薄层色谱技术7.2 常规柱色谱技术7.3 加压液相色谱技术7.4 逆流色谱法7.5 超临界流体色谱法7.6 模拟床移动色谱法7.7 制备气相色谱法7.8 径相色谱法7.9 顶替色谱法7.10 离子交换与吸附,制备色谱的特点：最有效的制备性分离技术；实验室规模、小批量生产、产业化制备；不同领域产品量不一样，阐明化学结构和生物活性，3050 mg足够，分析用标准品100 mg以上，有机合成通常需要g级以上；,薄层色谱柱色谱,设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高；切割谱带更加方便；自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联用技

2、术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。,7.1 制备薄层色谱技术,常规制备薄层色谱PTLC薄层板制备 为了增大上样量，增加了吸附剂用量。固定相：硅胶、氧化铝、纤维素、C2、C18等反相健合硅胶支撑：玻璃板或铝箔,平均25 m,540 m硅胶H、硅胶G、硅胶F254、硅胶F365、硅胶P,硅胶粒径范围影响：越细越均匀，分离度越高，但流速？粒径范围宽，分离效率低，怎么办？,-薄层厚度的渐变薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂的速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富集，可保持较窄的谱带。,薄层板的制作方法：常采用湿法：平铺法和涂铺法。,煅石膏或羧甲基纤维素钠水溶液,薄层色谱条件选择,开放型,操作不

3、连续,点样,样品溶液的制备点样设备和技术,样品溶液的制备,a纯品溶解-用溶剂溶解至一定浓度b样品的提取与净化 单一溶剂提取法 液液萃取法 液固萃取法过柱子 特殊的薄层板带浓集区的薄层板分离，得到浓集的窄带 衍生化作用 原位反应法,点样设备和技术,点样方式、点样量及点样设备的选择取决于分析的目的、样品溶液的浓度及被测物质的溶解度。溶剂的粘度不宜过高，以便于点样，溶剂的沸点要适中，太低会改变溶液的浓度，太高不易挥发易残留导致改变展开剂的选择性，溶剂必须全部除去后方可进行展开，但避免高温加热。,点样设备和技术,点状点样 管口平整毛细管点样，样点直径不超过5 mm;d1=1-1.5 cm;d2约2 c

4、m；定量时用定容管点样；,展开剂,薄层色谱条件：依据被分离物质的性质（溶解度、酸碱性及极性）、吸附剂（活性、非活性）及展开剂三种因素决定。展开剂千变万化，可以是单一溶剂、更多的是应用二元、三元或多元的混合溶剂作为展开剂。展开剂也称为溶剂系统、流动相或洗脱剂。,常用溶剂(1)电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2)质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙醇等；(3)强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4)质子受体溶剂：三乙胺、乙醚等；(5)偶极作用溶剂：二氯甲烷(6)惰性溶剂：环己烷、正己烷等。,溶剂的极性大小顺序：水甲酸 二甲基亚砜 甲醇 乙醇 正丙醇丙酮 乙酸 乙酸乙酯

5、蓖麻油乙醚氯仿 植物油四氯化碳 液体石蜡。,溶剂强度,(1)吸附薄层色谱法(2)分配薄层色谱法和纸色谱法(3)聚酰胺薄层色谱法(4)离子交换薄层色谱法(5)凝胶薄层色谱法,溶剂强度,(1)吸附薄层色谱法 底剂：展开剂中比例较大的溶剂极性相对较小，起溶解物质和基本分离的作用。调节剂：展开剂中比例较小的溶剂极性相对较大，对被分离物质有较强的洗脱力，帮助化合物在薄层上移动，可增大Rf值，但不能提高分辨率，可称为极性调节剂。,溶剂强度,(1)吸附薄层色谱法 抑制剂：展开剂中加入少量酸、碱，可抑制某些酸碱化合物或其盐类的解离而产生斑点的脱尾，称为拖尾抑制剂。其他：展开剂中有时加入丙酮等中等极性溶剂，主要

6、是促使不相混合的溶剂混溶，并可降低展开剂的粘度，加快展速。,溶剂强度,(2)分配薄层色谱法和纸色谱法水作固定相亲水有机相作固定相反相分配色谱,溶剂强度,(3)聚酰胺薄层色谱法氢键作用展开剂洗脱能力顺序：水乙醇甲醇丙酮稀氢氧化铵（钠）溶液 甲酰胺二甲基甲酰胺,溶剂强度,(4)离子交换薄层色谱法缓冲溶液盐溶液蒸馏水上述溶液加入一些有机溶剂,溶剂强度,(5)凝胶薄层色谱法在Sephadex-100，150，200凝胶薄层色谱板上，用磷酸缓冲液作展开剂分离蛋白,选择展开剂的方法,a三角形法b点滴试验法c展开室法,a 三角形法,按照展开剂、固定相及被分离物质三者的相互影响，设计了三因素的组合。,Rf=0

7、.20.8,b 点滴试验法,将被分离物质的溶液间隔的点在薄层板上，待溶剂挥发后，用吸满不同展开剂的毛细管点到不同样品点的中心，借毛细管的作用，展开剂从圆心向外扩展，这样就出现了不同的圆心色谱，通过比较就可以找到最合适的展开剂和吸附剂。,上样和展开先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质；低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此选用挥发性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶剂极性尽可能小。样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜，5-10%；带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极性溶剂展开至点样带上方2 cm处进行浓缩，然后将铺板干燥后再用展开剂展开。？,样品检测有色物质直接观察斑点；荧

8、光物质在紫外灯下观察；无色无荧光可在荧光板分离，紫外光下显示暗斑；喷显色剂，结构稳定且不易氧化物质可以用碘蒸气显色，可逆；,常用显色剂：硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，喷后110烤5分钟，不同有机物显不同的颜色；0.05%高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，背景淡红色；酸性重铬酸钾：5%重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150烤薄层；5%磷钼酸乙醇溶液：喷后120烤，还原性物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。,样品收集：切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器；回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常1 g吸附剂用5 mL溶剂，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常用。4型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用0.2

9、-0.45 m滤膜过滤。硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质，可用Sephadex LH-20过滤纯化。,常规制备TLC速度慢，效率低，如何提高？加压离心,加压制备OPLC 弹性气垫，外压使没有气相存在，展开剂强制流动，展开速度加快,更细的固定相颗粒、更长的薄层板,离心制备CTLC 离心力加速流动相，分离速度快，操作简单，占用空间小，使用溶剂少，可反复使用，可进行梯度洗脱，进样量大，一次分离量0.1-0.2 g.,不同制备TLC方法的比较,可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相，因此样品量可以更大；分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；不适合小颗粒的吸附剂？改进方法：减压、加压等,7.2 常规柱色谱技

10、术,柱色谱常用固定相(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构体的分离选择性远大于其他色谱方法。烷基 卤素（F Cl Br I）醚 硝基混合物 腈 叔胺 酯 酮 醛 醇 酚 伯胺 酰胺 羧酸 磺酸掺杂硅胶：如硝酸银处理，对不饱和烃有好的分离效果。1%-10%的添加剂的水或丙酮溶液与硅胶混合，稍干后110干燥即可。,(2)健合硅胶,(3)氧化铝碱性氧化铝：其水提取液为pH9-10，常用于碳氢化合物的分离，从碳氢化合物中除去含氧化合物。中性氧化铝：5%乙酸处理，水提取液为pH7.5，适用于醛、酮、醌、某些苷以及酸碱溶液中不稳定成分如酯、内酯等化合物的分离。酸性氧化铝：2MHCl溶液处理，水提取液p

11、H为4-4.5，适合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。,(4)活性炭：分离水溶性物质吸附作用在水溶液中最强，用有机溶剂洗脱。对芳香族的吸附力大于脂肪族；对大分子吸附力大于小分子；对极性基团多的分子吸附力大于少的；易吸附气体“中毒”，用前需活化，120加热4-5小时；,(5)聚酰胺：又称为锦纶或尼龙同时具有良好的亲水性和亲脂性；可溶于浓盐酸、甲酸，不溶于常见溶剂；含有丰富的酰胺基，与酚类、黄酮类、醌类、脂肪酸类物质形成氢键；还含有非极性脂肪链，双重保留机理；,(6)大孔吸附树脂：苯乙烯和丙烯酸酯骨架结构决定树脂的极性：非极性、弱极性-苯乙烯或二乙烯基苯聚合而成；中等极性-甲基丙烯酸酯；极

12、性、强极性-含氧硫基、酰胺基、氮氧等基团；吸附和分子筛分离相结合：网状结构，大比表面积,大孔吸附树脂使用：用前需预处理除去杂质：回流法、水蒸气蒸馏法；渗漉法-乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡12 h后洗脱2-3倍柱体积，再浸泡3-5 h后洗脱2-3倍柱体积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，2-5%盐酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脱，水洗。,(7)凝胶：交联葡聚糖Sephadex-葡聚糖和3氯-1，2环氧丙烷以醚健交联形成的三维空间多孔凝胶 交联度大，孔小，吸水膨胀小 型号以其吸水量的10倍命名，如S

13、ephadex G-25表示每克干胶吸水2.5 g；引入羟丙基，为LH型烷基化葡聚糖凝胶，不仅可分离水溶性成分，还可分离亲脂性成分，常用于最后的纯化，除去微量固体、盐类和其他外来杂质，纯化过程中样品损失极小。,甲基丙烯酸酯共聚物ToyopearlHW系列-乙二醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚而成 稳定性好，pH2-12；机械强度高，常用于加压柱色谱；在蛋白质、酶、核酸、多糖的纯化处理中应用较多；ToyopearlHW40可用于小分子物质的分离纯化，与SephadexLH20有相似的效果。,琼脂糖凝胶-D-半乳糖和3,6位脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，100时呈液态，45

14、 下互相连接成线性双链单环的琼脂糖，再凝聚成琼脂糖凝胶。与1,3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，生成CL型交联琼脂糖，稳定性更好，pH3-14（一般的琼脂糖pH4.5-9.0）；由于葡聚糖机械强度和筛孔的稳定性，流速较快。,凝胶柱使用一般注意事项：(1)交联度决定凝胶孔径大小，孔径决定排除下限；(2)颗粒粗细很重要，细颗粒分离效果好，但流速慢，宜采用大直径柱，粗颗粒流速快，但分离效果差，宜采用小直径柱；(3)干胶用量需考虑溶涨度,(4)干胶使用前需在5-10倍的去离子水中充分溶涨，倾倒掉小颗粒，减压排气。也可用煮沸的方法溶涨，速度快，可灭菌排气。(5)填充均匀，无空隙和气泡；(6)多次使用后，床

15、体积减小或污染，可再生处理，即用水逆向反复冲洗，再用缓冲溶液平衡。,(8)离子交换树脂-阳离子交换和阴离子交换 价态高，交换能力强；价态相同，原子序数大能力强；两性物质的交换取决于物化性质和特定条件下的离子状态；,离子交换树脂的一般原则-选择取决于被分离物质的电荷性质；强的使用范围宽，弱的分离生物大分子时，活性不容易失去；反离子，为了提高交换容量，选择结合力小的反离子；亲疏水性选择，一般分离大分子时，选择疏水性的基质，活性易保持；,常规柱色谱的操作(1)装柱：干法和湿法；(2)上样：液体上样和拌样上样，样品带尽可能窄；(3)洗脱：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面，可梯度洗脱；(4)流分收集：常采

16、用固定体积收集法，结合TLC检验；(5)样品回收：减压蒸馏或重结晶,干柱柱色谱 干吸附剂，待分离样品配成浓溶液或吸附于少量填料上上样，洗脱液接近色谱柱底部时停止洗脱，挖出或切开色带。,时间短节省试剂玻璃柱尼龙柱,减压柱色谱 减压促进溶剂流动。,与加压相比，变换溶剂更加方便；吸附剂高度一般不超过5 cm；分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶剂的比例，开始阶段增加幅度较小(1%,2%,3%)，随后幅度逐步增大(5%,10%,20%等)，通常收集20-25个流分即可将所有成分洗脱。,(1)快速色谱法：约0.2 MPa；(2)低压液相色谱法：2 MPa；,7.3 加压液相柱色谱技术,加压液相色谱制备分

17、离方法的建立：(1)采用薄层色谱确定分离条件。对于快速和低压色谱，常用薄层色谱选择分离条件。硅胶薄层色谱确定正相色谱条件，反相硅胶薄层色谱确定反相色谱条件，一般选择Rf不大于0.3且具有较好分离效果的展开剂。,(2)采用分析HPLC来确定分离条件。对于中压和高压色谱则需要用分析HPLC条件进行选择。优化条件时，寻求较小的容量因子(k 3)为原则，分离度需高于分析LC所需要的水平，满足制备型LC采用过载模式来提高效率。,进样量的影响 实验室规模的制备，轻微过载，优点：(1)便于回收高纯度目标成分，纯度 99%；(2)纯品几乎完全回收，回收率 95%；(3)分离程序简单，不需要为了得到纯品进一步分

18、析所得到的组分。,过载：低浓度时，进样量增加使得容量因子改变超过10,浓度过载和体积过载,K不变，线性结果可预测,K变化，非线性结果难预测,边缘切割与循环色谱分离 分离不佳时,密闭进样器是将流经检测器的柱流出液通过多通阀连至泵的入口；交替柱循环装置是连接两根色谱柱，通过阀门将第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根色谱柱上循环分离。,中心切割,适当损失组分，但避免色谱峰两端微量组分的污染。,制备加压色谱设备要求(1)泵：流量大，压力不需要太大；(2)进样器：大样品环六通阀，环管细而长而不是短而粗，样品溶液低浓度，大体积；(3)色谱柱：装填均匀常采用柱床压缩技术即径向压缩和轴向压缩；(4)检测器：

19、不需要高灵敏；,快速色谱法 简单易行,低压和中压色谱法,制备HPLC,生产级的HPLC(1)溶剂花费是最大成本，昂贵、毒性、难处理溶剂不使用；(2)填料易得，性能好，重现性好；(3)溶剂回收再用；(4)直径大于5 cm的色谱柱需专门设计，保证床层稳定，避免高压破坏。,7.4 逆流色谱法（CCC）,逆流色谱法（CCC）：基于样品在两种互不混溶的溶剂之间的分配作用，溶质中各组分在通过两溶剂相过程中因分配系数不同而得以分离。这是一种不用固态支撑体的全液体色谱方法。,逆流色谱(CCC)建立在逆流萃取分离的基础之上新型色谱分离技术。逆流色谱可以广义地定义为：(1)任何利用两相不相混溶液的色谱技术；(2)

20、其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管或一系列的腔体中；(3)同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。,逆流色谱的发展历史：（1）逆流分溶法 20世纪50年代，Craig发明的非连续逆流分溶装置，由一系列的分液漏斗连接而成。缺点：设备复杂，易碎，溶剂体系容易乳化，溶剂消耗量大，分离时间长，很快在60年代被液相色谱所取代。,（2）液滴逆流色谱 1972年由Tokyo Rikakikai实现商品化，并广泛用于天然产物的分离。缺点：分离时间长，23天，能够使用的溶剂体系有限，清洗困难，连接处容易渗漏，70年代后期逐渐被淘汰。,典型的装置由300根长度60 cm内径1.8 mm的玻璃管组成

21、，管柱之间用窄内径的聚四氟乙烯管连接。,DCCC(液滴逆流色谱),DCCC(液滴逆流色谱):是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使流动相呈液滴形式在固定相间交换，促使溶质中各组分在两相之间进行分配，达到分离效果。,DCCC(液滴逆流色谱),缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离,（3）旋转小室逆流色谱,旋转小室逆流色谱(rotational little-chambercounter-current chromatography,RLCC):用中心有一小孔的聚四氟乙烯园盘将分离柱管分隔成若干连通的小空间，再将若干根这样的柱管排列在圆形转

22、盘架上，柱管之间用聚四氟乙烯管串联起来。溶剂通过旋转密封接头进出这组分离柱管。所有柱管以一定的转速和倾角绕转盘中心轴转动。,流动相进入第一个小室后，就会取代其中原已注满的固定相的位置，直到流动相液面达到圆盘上小孔的水平时，流动相就会穿过小孔进入下一个小室，并依次从一根柱管进入另一根柱管。随着流动相逐步穿过各个小室，带动样品在各个小室的两相间分配。,（4）离心分配色谱和螺旋管式逆流色谱,利用离心力场实现固定相的保留，大大提高了两相溶剂的混合效率，允许使用较高的流动相流速，极大地缩短了分离时间。根据固定相保留方式和柱体设计的不同，分为两种，一种是流体静力学平衡体系HSES,一种是流体动力学平衡体系

23、HDES。离心逆流色谱法：仪器工作的时分离柱要绕中心轴在设备中高速转动，因为高速旋转产生的离心力可使两相剧烈地反复混合分层，实现快速高效的分离。非行星式逆流色谱仪：主要包括分离柱是螺旋管式和非螺旋管式，主要是匣盒式离心逆流色谱仪。行星式逆流色谱仪：分离柱几乎全是利用聚四氟乙烯管绕成的螺旋线圈。,建立HSES基础上的称为离心分配色谱。它是从DCCC发展来的。,离心力将固定相保留在一系列腔体中。噪声低，绝大部分的两相体系都可以使用。死体积大，不能充分混合，分离效率和相同体积的流体动力学逆流色谱仪差。采用旋转密封接头，易产生渗漏。,Sanki逆流色谱仪,建立在HDES基础上的逆流色谱仪是日本Yoic

24、hiro Ito教授于20世纪70年代发明设计的多层螺旋管式离心分离仪。,螺旋管的行星式运动产生变化的离心力场将固定相保留在螺旋管中，并允许流动相快速通过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配，分离效率较离心分配色谱(Centrifugal Partition Chromatography,CPC)大大提高。,（5）高速逆流色谱和双向逆流色谱 Ito教授在行星运动模式和螺旋管柱在支持体上的几何位置找到一种理想的结合状态，发展出一种特殊的同步行星运动模式（J模式），可在短时间内实现高效分离，并可实现两相流体在管内的双向流动。,高速逆流色谱法(HSCCC),高速逆流色谱技术是一种不用任何同态载体

25、的液-液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离，其分离效率和速度可以与HPLC相媲美。,高速逆流色谱法,混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈混合静置区：两相溶剂分成两层，重相在外部，轻相在内部,以1000转/分的速率进行旋转，在二维力场的作用下分离管柱内混合和传递的频率可达到17次/S，从而实现高效的分离,高速逆流色谱法,K Cs/Cm,高速逆流色谱仪,HSCCC的工作流程,PUMP:恒流泵HSCCC centrifuge:离心机Detecter:检测器,（1）溶剂的选择：最有效的溶剂组合应是样品在其中的分配系数0.2-5，

26、最好接近1，同时，是两相的分层时间尽可能短。选择溶剂种类和配比的方法：a.参比已有的溶剂系统 b.高效液相色谱法 c.薄层色谱法 d.生物活性分配比法（2）样品溶液的制备：样品溶液制备主要考虑样品的溶剂，样品量以及样品体积的大小。（3）分离：两相溶剂系统不需要脱气，但使用前必须互相饱和。（4）检测：目前较为常用的是紫外检测器。重要的是保证基线的稳定。,高速逆流色谱仪实验操作,（6）pH区带精制逆流色谱1993-1994年间偶然的发现，即当在酸性物质的样品中加入一定浓度的有机酸时，可以产生一个非同寻常的窄而尖的峰，收集到的样品仅有几毫升。当样品量增大时，每个组分在柱中形成一个高浓度浓缩的等值pH

27、区带，并以一个矩形峰被洗脱出来。在氨基酸、多肽、染料、生物碱等物质的分离中有很好的应用。（7）pH-区带-提取逆流色谱法：用于有机酸或碱的分离。通过在固定相中加入酸（或碱），将样品各组分保留在柱管内，而流动相中加入碱（或酸）来根据各组分的pKa和疏水性把这些组分逐一洗脱出来。,（8）离心沉淀色谱 逆流色谱技术.利用两相溶剂在一根开管柱中的逆向流动进行分离，由此Ito在1998年联想到是否可以在开管柱的中间加一层半透膜来实现蛋白质的连续沉淀分离。这种方法为生物大分子以及细胞等生物物质的分离开辟了一个新的途径。,2、逆流色谱的应用和发展趋势 以制备为主，既适合小分子，也适合大分子。目前的发展趋势：

28、（1）研制更加适合生物大分子分离制备的高速逆流色谱仪；（2）目前该项技术还没有达到大规模工业化生产的程度，在其放大过程中的一些技术问题需要进一步的研究解决。,3、逆流色谱的基本原理（1）流体静力学平衡体系（HSES）,（2）流体动力学平衡体系（HDES）,螺旋管的行星式运动产生一个强度和方向都变化的离心力场。在离心力高的时候，两相出现倾析，离心力发生逆转时，分开的两相又混合乳化，倾析和混合区域交替地出现在管中。,重力场中旋转螺旋管内流体动力分布,2000多年前，希腊数学家阿基米德利用旋转的螺旋结构将河水提升到河岸，他的这种装置叫做“阿基米德螺旋”。（a）重力作用使气泡处在上端、玻璃珠在下端，随

29、着螺旋管的慢速转动，气泡和玻璃珠都向一个方向运动到螺旋管的一端，这一端通常称为首端，另一端称为末端。,（b）上图是小体积重相的情况，下图是小体积轻相的情况,（c）重相和轻相差不多的情况，螺旋管的旋转使得两相竞争地向首端迁移，不久，两相在首端建立了一种流体动力学平衡，在每一圈管内两相占据几乎相同的体积。任何一相的过量都会被推向螺旋管的尾端一侧。一旦这种平衡建立起来，螺旋管的继续转动，只会使两相在每一圈管内前后混合，两相在螺旋管内的总体分布不变。,进一步的研究表明，流体动力学平衡体系中两相的体积比与螺旋管的转速密切相关。,第一区段：慢速区，两相均衡分布；第二区段：临界转速范围，两相建立起单向性流体

30、动力学平衡，重相完全占据首端一侧；第三区段：临界转速后，重相在首端一侧量迅速减小，进一步提高转速又回复两相均衡分布的状态。,氯仿乙酸水体系,螺旋管内的两相溶剂分配是一个复杂的流体动力学现象，现在还难以准确用数学公式解释。该分配作用与螺旋管不同部位的离心力有关。,1）当转速慢时，离心力可以忽略，重力起主要作用，此时，阿基米德螺旋力同时对两相起作用，竞争性地建立平衡。2）临界范围转速时，由于径向离心力场的加强，使得作用在螺旋管底部的净力场增强，顶部的净力场减弱，在这种不对称力场的作用下，重相向首端的迁移被加速，轻相的迁移受到阻碍，结果在螺旋管内产生一种单向性的流体动力学分配。,3）转速进一步增加时

31、，产生一个更强的径向离心力场，使两相溶剂重新分配，重相占据螺旋管的外层空间，轻相占据螺旋管的内层空间，最终导致在整个螺旋管内每一圈均等分布（开始时注入等体积的两相）。,J型行星式运动螺旋管内，转速750r/min，靠近中心轴的约1/4区域两相剧烈混合，其余区域两相分层，重相占据外部，轻相占据管内部，沿螺旋管形成一个清晰的界面。每个混合区都向螺旋管的首端行进，行进速率与管柱的公转速率相同。流动相恒速通过固定相时，在管柱内任何部位的两相都以极高的速率进行混合和沉积分配过程，频率可达13次/s。,混合区,沉积区,当螺旋管以超过临界速度旋转时，两相溶剂在柱子里面建立一种单向性的流体动力学平衡，这样分别

32、将尾端相从首端引入，首端相从尾端引入，则可以实现双向逆流色谱分离。,4、影响逆流色谱的两相分布的物理参数1）疏水性，对于上相为有机溶剂，下相为水相的体系，增强疏水性有利于上相移向首端，下相移向尾端；2）增大两相界面张力；3）减小溶剂的粘度；4）增大两相的密度差；5）加大值（自传半径/公转半径），可以减小公转半径，或者加大螺旋管半径。,（4）pH区带精制逆流色谱（pH zone refining CCC）Ito在研究高速逆流色谱分离纯化BrAcT3(N-溴乙酰基-3,3,5-三碘代甲腺氨酸）时，观察到产物形成了一个非同寻常的尖峰，其理论塔板数高于2000，而相邻的杂质峰显示正常峰宽，理论塔板数5

33、00左右。,采用由正己烷-乙酸乙酯-甲醇-15 mmol/L醋酸胺缓冲溶液组成的pH值为4的两相溶剂体系。,对收集组分进行pH值测量时发现，pH曲线在溶剂峰后曾出现一段逐渐下降的趋势，然后恰巧在产物尖峰出现的位置急剧增加。样品溶液的质谱分析显示溴乙酸的出现，这是合成反应的副产物。,现在将溴乙酸称为“保留酸”，因为它能将分析物在柱中保留更长的时间。近年来的研究表明，很多有机酸都可以单独或者混合作为保留酸。进一步的研究表明，将保留酸加入固定相中会产生在样品溶液中类似的效果。,由于其非线性等温线，保留酸形成了一个陡峭的缓行边界，该边界在柱中移动的速度比流动相慢。,当酸性分析物出现在位置(1)时，由于

34、低的pH值形成疏水的中性形式，并且随后进入有机固定相的位置(2)。随着陡峭保留边界迁移，分离物暴露与一个较高pH位置(3)，此时失去质子并且转移到水相(4)，在水相中分析物快速传过陡峭边界重复上述循环。因此，分析物总是被限定在保留酸的边界中伴随着保留酸边界洗脱成一个尖峰。,为了将分析物限制在保留边界附近，必须满足一定的条件。,该方法允许使用多重的保留酸为间隔剂（spacer），使不同的被分离物以窄峰的形式出现在保留酸的边界上。,进样量由1 mg增加到100 mg，其余条件与前图相同，可以发现有没有保留酸和间隔酸效果相差十分明显。,与HPLC的比较：简单，相比不一样，达到同样的分离度需要的理论塔

35、板数少。,逆流色谱的应用：制备，特别是中药成分的提取（目前最主要的应用领域）。,长春花生物碱的 HSCCC-UV 色谱图,7.5 超临界流体色谱（SFC）,1 方法原理2 应用,1 方法原理,超临界流体色谱法是以超临界流体作为流动相的一种色谱方法。超临界流体时指既不是气体也不是液体的一些物质，它们的物理性质介于气体和液体之间。（1）超临界流体的特性（2）超临界流体的色谱仪（3）压力效应（4）固定相和流动相（5）检测器,（1）超临界流体的特性,物质的临界点超临界流体的特性,物质的临界点,当处于临界温度下时，其气体和液体具有相同的密度；当处于临界温度以上时，不管施加多大压力，气体也不液化流体。其密

36、度随温度、压力改变。,超临界流体的特性,超临界流体的粘度接近于气相色谱的流动相，传质阻力小；其密度与液相色谱的流动相类似；超临界流体的其它物理性质和化学性质，都是密度的函数。,超临界流体的特性,只要改变流体的密度，就可以改变流体的性质，从类似气体到类似液体，无需通过气液平衡曲线。超临界流体程序升密度相当于气相色谱中程序升温度和液相色谱中的梯度洗脱。其高密度特性，使其具有足够的溶解能力。,（2）超临界流体的色谱仪,（3）压力效应,在SFC中，压力的变化对容量因子k值产生显著影响，以超临界流体作流动相，它的密度随压力的增加而增加，而密度的增加引起流动相溶剂效率的提高，同时可缩短淋洗时间。,（4）固

37、定相和流动相,用于SFC中的色谱柱可以是填充柱，也可以是毛细管柱。毛细管超临界流体色谱（CSFC）由于具有高的分离效率，倍受青睐。流动相一般选择CO2。,（5）检测器,SFC可选择高效液相色谱用检测器，其一主要优点可选择GC中的FID(火焰离子化)检测器，提高对有机物测定的灵敏度。,2 应用,SFC测定分子质量范围与LC相当。广泛用于天然物、药物、表面活性剂、高聚物、多聚物、农药、炸药、火箭推进剂等物质的分离和分析。,通常的色谱存在下列问题：(1)不能连续操作；(2)溶剂和分离材料利用率低；(3)流出组分被高度稀释；SMB同样的分离材料，生产力增加60倍，溶剂消耗量减少80倍。,7.6 模拟移

38、动床色谱(SMB),模拟移动床色谱原理：,色谱对不同组分进行分离，主要是利用各种组分在色谱柱中的迁移速率不同来完成的考虑两种组分A和B的分离，其中B比A更容易在固定相上吸附，因而B在色谱中迁移速率要比A小如果让固定相以一个介于A，B两种组分迁移速率之间的速度与溶剂作反向运动，这样A，B两种组分就会分别由固定相和溶剂携带向相反的方向移动，从而完成A与B的分离这就是移动床色谱的基本构想上图是一个移动床色谱示意图，固定相和溶剂分别向相反的方向循环流动，在进样点处A与B的混合物连续进样，B和 A的纯组分分别在两个采出点连续采出。上图中移动床色谱被进样点、两个采出点以及溶剂进样点分隔成4个分区，,各个分

39、区分别完成不同的功能分区IV主要用来吸附多余的没有采出的组分A；分区皿主要吸附组分B；分区11用来洗脱组分A；分区I主要用来洗脱没有采出的组分B 移动床色谱虽然有可连续操作和分离效果好的特点，但是在实际操作中实现固定相的流动非常困难，而引人模拟移动床思想就能够很好地解决固定相实际流动困难的问题它可以在固定相不动的情况下，通过一定的切换序列，模拟出固定相和溶剂间相对流动的效果。,移动床色谱分离原理示意图,下面这张图片能形象地解释TMB(真实移动床)的原理。乌龟代表样品中跑得慢的组分，兔子代表样品中跑得快的组分。履带代表色谱柱中的固定相。履带不动的话，兔子跑在前、乌龟跑在后。如果履带本身有一个向后

40、的速度，比兔子慢、乌龟快的速度的话，兔子能跑到上样点前面，乌龟被甩到上样点后面。这样就能连续不停的上样（乌龟兔子），连续不停的分离，收集。这就是TMB(True Moving Bed)。,移动床色谱分离原理示意图,思考题：关于加入一只猎兔犬的问题？,模拟移动床色谱把一个长的色谱柱分成若干小的色谱柱，各柱之间首尾相连，由进样点、两个采出点以及洗脱液输入点把所有的色谱柱分成了4组（分区）。t为给定的一个切换时间，选择好进样点、两个采出点和溶剂输入点，在经过了t时间后各点分别沿着溶剂流动的方向，向下一个柱子推移，这样循环往复就形成了固定相向相反方向的虚拟流动，从而实现了与真实移动床色谱相近的分离效果

41、 按照上述模拟移动床色谱的工作原理，把小色谱柱组装成简易的模拟移动床色谱装置，如图所示简便起见，没有画出所有的色谱柱，而是把各分区的柱子合在一起以一个柱子表示，其他柱子的连接方式与其相同。,模拟移动床色谱原理,进料和洗脱液由泵打入系统中，各柱之间由一个开关阀和一个单向阀连接进料和洗脱液通过开关阔在上端进入色谱柱，柱子的下端分别与两条采出线相连。,模拟移动床色谱原理,与真实移动床（True Moving Bed,缩写TMB）不同，模拟移动床（Simulative Moving Bed，缩写SMB）中的固定相实际上是固定不动的，而在模拟移动床（SMB）中,履带（固定相）向后的相对速度靠进样口、出样

42、口向前的切换移动来实现。这是通过阀切换来改变每次上样的位置，以此模拟柱床在空间上向后移动的效果。在模拟移动床分离双组分的龟兔赛跑模型中，跑道实际上是不动的。只是每次每对儿参加比赛的龟兔的起跑位置（相当于SMB中的上样位置）在变化，即总是位于跑道上的龟兔之间的位置，龟兔都向前跑动，只是速度不同。如图所示。这样就相对造成跑道向后移动的空间效果。并且使得龟兔始终能分开。,图 模拟移动床色谱分离原理示意图,模拟移动床色谱应用,工业手性药物大规模拆,7.7 制备气相色谱法,用能处理较大量试样的气相色谱系统。小量制备气相色谱是在一般分析型气相色谱的基础上加上设在柱输出端的样品收集系统而成。其目的在于分离或

43、制备一种或多种纯组分，用于进一步进行定性鉴定、化学合成或高纯标准物的生产。这样的系统一般能处理毫克量级样品或亚毫克量级样品。在需要处理较大量样品时，则需用大直径的色谱柱。气相色谱法得色谱柱有填充柱和毛细管柱。大多数情况下，制备气相色谱采用填充柱气相色谱。,制备气相色谱法仪器装置,1.气流系统：控制载气和检测器用的助燃气与燃料气的阀件、测量计、压力表以及净化用的干燥管、脱氧管等2.分离系统：色谱柱、进样器、色谱柱用的恒温炉有关控制系统。3.检测、记录、收集和数据处理系统：包括检测器、记录仪、收集器、微处理机及有关电器部分。,制备气相色谱法色谱柱,柱长：一般：柱长1-3 m，内径6-10 cm；对

44、于成分复杂样品：柱长10-30 m，内径0.5-1 cm，以提高柱效。填料：35-40目载气流速：100-1000 mL/min,制备气相色谱法操作,进样量:0.1-10 mL自动进样器进样进样方法：闪蒸气法和柱上进样法,制备气相色谱样品收集,7.8 径向柱色谱,径向流色谱法是一种新型色谱分离纯化技术,采用径向流动特殊设计,在生物、食品领域应用逐渐广泛,与传统的轴向色谱相比,该方法具有流速高、操作压力低、线性放大容易及样品处理量大等突出优势。,径向柱色谱结构示意图：,径向柱色谱,当样品溶液从进样口进入后，样品溶液经分布到圆筒状色谱柱的外侧，流动相随后经进样口泵入后，就会带着样品溶液通过色谱柱的

45、多孔滤膜进入填料的填充床进行选择性分离。流动相的的流动方式始终是从圆筒状外围，进入位于中心位置的小通道而流出。径向柱的外表面很大，能承载的样品量大；如果增加柱长，可以呈线性增大色谱柱的制备量，而个组分的分辨率既保留时间没有大的变化；色谱柱的半径较小，色谱柱的压力较小，所以大多数操作在低压下进行。径向柱填充较麻烦，要求也较高。径向柱色谱目前主要采用离子交换和亲和色谱分离原理,在惰性流动相中加入对固定相吸附或者溶解能力比所有组份都强的物质为顶替剂（或者直接用顶替剂做流动相。,适合于制备纯物质或者浓缩分离某一组份，缺点是每经一次使用后，必须更新柱子。,顶替法样品流出曲线,7.9 顶替色谱法,7.10

46、 离子交换与吸附,7.10.1 离子交换法概述7.10.2 离子交换树脂性质7.10.3 离子交换法的基本原理7.10.4 离子交换操作方法7.10.5 离子交换法应用7.10.6 吸附,1.概念与原理,概念：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上，然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，达到分离的目的。原理：基于物质在固相与液相之间的分配。,7.10.1 离子交换法概述,优点：分离效率高 设备简单，操作不复杂 树脂又具有再生能力，可反复使用，应用广泛。缺点：分离周期长，耗时过多。,2.离子交换分离法的特点,1805年英国科学家发现了土壤

47、中Ca2+和NH4+的交换现象；1850年，确认离子交换现象；1876年Lemberg 揭示了离子交换可逆性和化学计量关系；1900s，人工合成的无机离子交换剂问世，如用人工泡沸石来软化水；1935年人工合成了有机离子交换树脂；1940年应用于工业生产；1951年我国开始合成树脂。,3.离子交换分离法的发展史,按“骨架”成分分：,无机离子交换剂,离子交换剂,有机离子交换剂,按物理结构分类,碳质：煤或木质素经化学处理的产品,有机合成：大分子聚合物,4.离子交换法分类,天然(粘土、沸石类矿物)合成(合成沸石、分子筛、水合金属氧化物、多价金属酸性盐类、杂多酸盐等),根据树脂所含有的活性基团分类,聚苯

48、乙烯型阳离子交换树脂,强酸性,阳离子交换树脂,酚醛型阳离子交换树脂,弱酸性,强碱性,有机离子交换树脂,阴离子交换树脂,弱碱性,高选择性的离子交换树脂,螯合树脂,特殊的离子交换树脂,大孔吸附树脂,萃淋树脂,按合成的树脂所用原料单体分类：,苯乙烯系,酚醛系,丙烯酸系,环氧系,乙烯吡啶系,离子交换剂,几种离子交换树脂（1）,几种离子交换树脂（2）,5.离子交换树脂的命名和型号,1、命名 2、型号 离子交换产品的型号以三位阿拉伯数字组成，第一位数字代表产品的分类，第二位数字代表骨架的差异，第三位数字为顺序号用以区别基因、交联剂等的差异。,离子交换树脂的命名方法,离子交换树脂命名法中分类代号和骨架代号,

49、带有活性基团的网状高分子聚合物,1.离子交换树脂的结构,7.10.2 离子交换树脂性质,2.离子交换树脂的构成,具有三维空间立体结构的网络骨架 联接在骨架上的活性基团 活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）,3.树脂的特性,外观 形状：透明或半透明的球状珠体。颜色：白、浅黄、赤褐色。,含水率 树脂孔隙内所含的水分，一般在40%69%。与树脂的交联度有关，交联度低，空隙率高，含水率高。,物理性能,密度 干密度：干燥状态下，树脂材料本身具有的密度。湿密度：在水中充分溶胀后湿树脂本身的密度。表观密度：树脂在水中充分溶胀后的堆积密度(视密度)。单位均为mg/L.,一般离子交换树脂：表观密度为0

50、.6 0.9 g/mL;真密度为1.2 1.4 g/mL.,交联度 交联度为树脂合成时交联剂的用量，一般为7%10%。交联度越高，孔隙度越慢，密度越大，对半径较大的离子和水合离子扩散速度越低，交换量越小。在水中浸泡，形变小，较稳定。,溶胀性 吸水后体积增大的现象。溶胀程度用溶胀率表示：,溶胀的原因 水扩散到树脂交联网孔发生溶胀；活性基团离解形成水合离子。影响因素 树脂交联度：交联度越大，溶胀率越低。活性基团：离解程度越大，溶胀率越大；可交换离子：水合半径越大，溶胀率越高。,交换容量总交换容量：单位体积湿树脂(容量表示法)或单位重量干树脂(重量表示法)所有交换基团的总数。容量表示法 EV：mmo