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1、1,第7章 食药用菌与酶 Section 7 Edible fungi and Enzyme,酶与食药用菌的生长发育纤维素酶 cellulase半纤维素酶 hemicellulase木质素酶ligninase,2,一、酶与食药用菌的生长发育,（一）酶(Enzyme)的定义：酶是由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质。,Beadle Center,University of Nebraska,3,（二）食药用菌的生长特点：利用树木（包括树枝、树叶）、秸秆、棉籽壳等；这些原料的主要成分是纤维素、木质素、半纤维素和果胶质等。,4,不同原料的木质纤维素含量（%）,5,图1 木质纤维素结构示意图,6,图2
2、纤维素的结构示意图,纤维素（cellulose）、是由许多葡萄糖基相互以糖甙键连接而成的线性高分子，纤维素的重复单元是纤维素二糖（cellobiose）,7,图3 半纤维素的结构示意图,半纤维素（hemicelluloses）是由木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖等多糖基组成的一种聚合物。具有多而短的支链，主链上一般不超过150200个糖基。,8,图4 木质素的基本组成单元,木质素（lignin）是一种具有芳香族特性，以苯丙烷为结构单元，非结晶性的，三维高分子网状化合物。重复结构单元缺乏规律性和有序性。,9,果胶(Pectin)是一组聚半乳糖醛酸。它具有水溶性,工业上即可分离,其分子量约5
3、万一30万。在适宜条件下其溶液能形成凝胶和部分发生甲氧基化（甲酯化，也就是形成甲醇酯）,其主要成分是部分甲酷化的a(l,4)一D一聚半乳糖醛酸。残留的羧基单元以游离酸的形式存在或形成铵、钾钠和钙等盐。,10,（三）食药用菌的酶系统：纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶,11,二、纤维素酶 cellulase(1)组分：,纤维素酶,内切-1.4葡聚糖水解酶，俗称Cx酶随机内切纤维素大分子中的-1.4糖苷键，产物为纤维糊精，纤维寡糖,外切-1.4葡聚糖水解酶，俗称C1酶,-1.4葡聚糖葡萄糖水解酶作用于纤维素分子非还原性末端的-1.4糖苷键，产物为葡萄糖,-1.4葡聚糖纤维二糖水
4、解酶作用于纤维素分子非还原性末端的-1.4糖苷键，产物为纤维二糖,-1.4葡萄糖苷酶，俗称C1酶水解纤维二糖，纤维寡糖的-1.4糖苷键，产物为葡萄糖,12,13,cellobiose,Cellulose crystal,14,（2）结构和性质：,15,胞外酶pH：酸性纤维素酶：木腐菌。pH4.5-5.5 碱性纤维素酶：鬼伞、草菇等。pH 7-10温度：40-60分子量：45000-76000；,16,（3）作用方式：各组分酶协同作用,结晶纤维素可反应的纤维素=葡萄糖n葡萄糖n纤维二糖葡萄糖,图4 纤维素的作用机理,-葡萄糖苷酶,内切葡聚糖酶,内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶,17,（4）纤维素酶活力
5、的测定方法,酶活力单位（国际单位）：在特定条件下，每1min催化1mol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。滤纸糖化力法：测定总纤维素酶活力CMC糖化法：测定外切-1，4-葡聚糖的活力和内切酶活力的总和。CMC液化力法：测定内切-1，4-葡聚糖酶的活力。祥见：酶制剂生产技术，科学出版社，孙俊良，2007年1月,18,（5）纤维素酶的生产菌株：绿色木霉、康氏木霉 成分主要为内切-1.4葡聚糖水解酶Cx和C1外切-1.4葡聚糖水解酶，俗称C1酶,(6)纤维素酶的应用大豆加工中作用：促进大豆脱皮，增加水溶性蛋白的得率；淀粉加工中的作用：缩短加工时间，增加得率；果汁加工中的作用：促进汁液澄清；
6、饲料添加剂：提高饲料的利用率；,19,半纤维素酶 hemicellulase,（1）半纤维素的组成：木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖和糖醛酸等混合组成的杂多糖；木聚糖是主要成分；（2）半纤维素酶主要酶种：内切1，4-木聚糖酶、外切-1，4木糖苷酶等；（3）作用方式：多种酶协同作用。先由内切1，4-D-木聚糖酶切成木寡糖，再由外切-木糖苷酶分解成木糖；同时需要-L-阿拉伯糖苷酶、-D-葡萄糖醛酸酶、乙酸酯酶和 阿魏酸酯酶等的参与木糖与侧链取代基之间的糖苷键，以提高降解效率。,20,（4）木聚糖酶(xylanase)的结构与性质,木聚糖的结构,21,22,性质,Xylanase structi
7、on,23,内切1，4-木聚糖酶：单亚基蛋白质,24,-木糖甘酶：单体、二聚体或四聚体；分子量：26000-360000；等电点：3.3-6.3；是一种多功能酶，可酶切木糖苷键、-阿拉伯糖苷键、-葡萄糖糖苷键和-半乳糖糖苷键，还具有1，4-木糖苷转移酶和1，3-木糖苷转移酶活性。,木聚糖的完全降解需要各种酶与底物分子有完全的立体配位才能高效进行,25,（5）木聚糖酶活力的测定方法,1）DNS法：常用2）Somogyi-Nelson法：试剂有一定毒性，少用3）RBB-Xylan法：简单、灵敏度高、较准确，但价格贵。,（6）生产菌株：木霉和曲霉，固体发酵,26,(7)木聚糖酶的应用,造纸工业：纸浆
8、用木聚糖酶预处理后，减少漂白过程中有毒化学药品的使用量，并且改善漂白效果；食品行业：作为食品增稠剂、脂肪替代物或冷冻食品添加剂。低聚木糖是很好的肠道保健品；饲料行业：提高饲料的利用率。,27,木质素酶ligninase,28,（2）木质素酶系：主要有：木质素过氧化物酶（lignin peroxidase,Lip)；锰过氧化物酶（Manganese peroxidase,MnP）；漆酶（laccase,Lac)。其他：芳醇氧化酶(aryl-alcohol oxidase,AAO);乙二醛氧化酶（gyoxal oxidase,GLOX）；葡萄糖氧化酶（glucose-L-oxidase）；酚氧化酶
9、、过氧化氢酶等。,29,漆酶（laccase,Lac),（1）基本结构和性质漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(polyphenol oxidase)，与植物抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同属于铜蓝蛋白家族。是一类细胞外的糖蛋白。,30,分子量：60-100KDa;存在多种同工酶，如从平菇中分离的漆酶至少有3种同工酶；催化底物：各种酚类化合物，如：1）简单的二酚，包括对苯二酚、邻苯二酚等；2）甲氧基取代酚，包括愈创木酚、2，6-二甲基苯酚等；3）氨基酚、多酚等；4）ABTS（2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic,2，2-连氮-双-（3-
10、乙基苯并噻唑-6-磺酸）；5）各种染料；,来源：大型真菌、木霉、细菌。,31,（2）漆酶菌株的筛选,32,漆酶菌株的初筛,33,漆酶高产菌株培养条件的优化,34,摇瓶和静止培养对灵芝TR6号菌株漆酶分泌的影响,35,铜离子对灵芝TR6号菌株产漆酶的影响,不同铜离子浓度对灵芝TR6号菌株漆酶活性的影响,36,铜离子对灵芝TR6号菌株产漆酶的影响,铜离子加入时间对灵芝TR6号菌株漆酶分泌的影响,37,氮源对灵芝TR6号菌株产漆酶的影响,不同氮源对灵芝TR6号菌株漆酶分泌的影响,38,碳源对灵芝TR6号菌株产漆酶的影响,不同碳源对灵芝TR6号菌株漆酶分泌的影响,39,碳源对灵芝TR6号菌株产漆酶的影
11、响,不同淀粉添加量对灵芝TR6号菌株漆酶分泌的影响,40,诱导剂对灵芝TR6号菌株产漆酶的影响,诱导剂对灵芝TR6号菌株漆酶分泌的影响,41,灵芝TR6号漆酶分离纯化,DEAE Sepharose Fast Flow 柱层析,灵芝TR6号漆酶的DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子柱层析图,42,Sephadex G100凝胶柱层析,灵芝TR6号漆酶的Sephadex G100凝胶柱层析图,灵芝TR6号漆酶分离纯化,43,灵芝TR6号漆酶的表观分子量,灵芝TR6号漆酶SDS-PAGE图谱,灵芝TR6号漆酶酶学性质研究,44,灵芝TR6号漆酶的同工酶组成,灵芝TR6号漆酶Native-PAGE图谱a：粗酶液 b：纯化漆酶,灵芝TR6号漆酶酶学性质研究,a b,45,灵芝TR6号漆酶对三苯甲烷类染料降解,灵芝TR6号漆酶对溴甲酚绿的降解,灵芝TR6号漆酶对溴甲酚绿的降解图a:降解前 b:降解后,46,灵芝TR6号漆酶对蒽醌类染料降解,灵芝TR6号漆酶对活性艳蓝KN-R的降解,灵芝TR6号漆酶对活性艳蓝KN-R的降解a:降解前 b:降解后,
