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1、年产6000吨木聚糖酶发酵车间的设计 作 者 姓 名 李斌 专 业 生物技术及应用 指导教师姓名 张大伟 目 录摘 要 1ABSTRACT 2 第一章 绪论 31.1木聚糖酶简介 31.1.1木聚糖酶的理化性质 31.1.2木聚糖酶的生产简史 41.1.3木聚糖酶用途 41.1.4木聚糖酶产业发展现状 51.2巴斯德毕赤酵母简介 61.2.1巴斯德毕赤酵母表达系统 61.2.2巴斯德毕赤酵母的优缺点 61.2.3前景展望 7 第二章 木聚糖酶发酵机理72.1重组巴斯德毕赤酵母发酵合成木聚糖酶的代谢途径 72.1.1甘油代谢途径 7 2.1.2甲醇代谢途径92.2巴斯德毕赤酵母发酵生产木聚糖酶过
2、程中的主要影响因素 112.2.1碳源的影响112.2.2氮源的影响112.2.3基础盐和PTM1微量盐的影响 112.2.4添加其它物质,降低蛋白酶降解122.2.5pH的影响122.2.6温度的影响122.2.7溶氧浓度(DO )的影响 132.2.8诱导前菌体密度( CWPT I )与比生长速率(PT I )的影响13 第三章 木聚糖酶发酵的工艺流程 133.1高效分泌木聚糖酶的毕赤酵母工程菌株的获得133.1.1材料 133.1.2黑曲霉木聚糖酶cDNA 的获得 133.1.3表达载体VMANpPIC9K 的构建 133.1.4重组菌株VMANpPIC9KGS115 的获得和高酶活菌株
3、的筛选133.1.5重组毕赤酵母的扩大培养 133.2重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产木聚糖酶 143.2.1原料 143.2.2重组菌株的液体发酵 153.2.3发酵工序 153.3发酵液后处理获得木聚糖酶 163.3.1离心 163.3.2干燥 173.4工艺流程 173.5产品的工艺要求 183.5.1产品的规格与使用方法 183.5.2产品的包装与储运 183.5.3常用饲料原料中木聚糖量 18 第四章 工艺计算 194.1物料衡算 194.1.1原料的物料衡算194.2热量衡算204.3冷却水水耗20 第五章 设备的设计与选型215.1输送设备的设计计算 215.2发酵设备的设计及选
4、型235.2.1发酵罐的设计计算235.2.2种子罐的设计265.3发酵车间相关设备的型号一览表 26 第六章 发酵车间的布置设计 29 6.1概述296.2生产车间工艺布置的原则296.2.1车间布置设计的依据296.2.2生产车间工艺布置的原则306.3发酵车间的设计316.4管路的设计32 第七章 总平面布置与建筑说明337.1设计依据和范围337.1.1设计依据337.2厂址337.2.1厂址地理位置337.2.2厂区基本条件337.3总厂平面设计337.3.1平面设计原则347.3.2平面的总体布置的设计方案347.3.3工厂出入口布置特征357.3.4厂区设计357.3.5坐标系统
5、357.3.6厂区划分要求357.4建筑物得布置位置36参考文献37致谢38摘 要木聚糖酶(-1,4-D-Xylanase, EC3.2.1.78)是一类能够水解-1,4-糖苷键的半纤维素酶，已广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、采油等诸多领域。本设计以一株高效表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为发酵菌株,对年产6000吨木聚糖酶的发酵车间进行设计。发酵工艺采用连续补料培养工艺，选用2个0.8m3一级种子罐和2个8 m3二级种子罐，采用2个80m3发酵罐，发酵罐直径3100 mm。发酵罐罐体厚度设计是6.5mm，制作材料采用1Cr18Ni9Ti耐酸不锈钢。本设计根据确定的工艺流程进行了物料衡算，并绘制了
6、全厂工艺流程图、全厂总平面布置图及三级发酵罐的装配图。关键词：木聚糖酶 高密度发酵 补料培养 发酵罐 ABSTRACTxylanase (-1 ,4-D-xylanase , EC3.2.1.78) are a class can hydrolyze -1 ,4-glycosidic bond hemicellulase, its role in xylan substrate grapes , xylan, galactoxylan and galactoxylan such as grape xylan more widely distributed in nature, most are
7、 renewable resources. hemicellulose resources as the major products of deep processing, -xylanase has been widely applied In food, medicine, feed, paper, oil and many other fields.In this study, using RT-PCR, selection was highly expressed xylanase secreted Pichia pastoris strain MAN22, and the liqu
8、id fermentation. Temperature control during fermentation 30 C, by adjusting the stirring rate to the dissolved oxygen concentration was maintained at 30%, mainly in methanol as carbon source, nitrogen source, ammonia did, by adding ammonia flow control pH 5.5, make every 12 h Add a Methanol, post-fe
9、rmentation to add 5% (NH4) 2 SO4, NH4 + levels were maintained to 150mmol / L or more (2 g / L or so). Seeds with two 0.6m3 and two 6 m3 tank and two second seed containers, with two 60m3 fermenter, the fermentation tank diameter of 3100m. Fermentation Tanks thickness design is 6.5mm, made of stainl
10、ess steel materials used 1Cr18Ni9Ti acid. Selected according to the design of -xylanase production process and the design of computing devices, according to the requirements of the mission statement drawn flow chart of the whole plant, whole plant general layout plans and -xylanase fermentation tank
11、 assembly Fig.朗读显示对应的拉丁字符的拼音字典Key words: xylanase ; High density fermentation; seed pot; fermentation pot 第一章 绪论1.1木聚糖酶简介1.1.1木聚糖酶的理化性质 木聚糖酶（Xylanase）EC 3.2.1.8是指将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。主要包括外切-1，4-木聚糖酶，内切-1，4-木聚糖酶和-木糖苷酶。其中外切-1，4-木聚糖酶EC3.2.1.92是以单个木糖为切割单位，它作用于木聚糖的非还原性末端，使反应体系的还原性不断增加。内切-1
12、，4-木聚糖酶EC3.2.1.8是从木聚糖主链的内部切割-1，4糖苷键，使木聚糖溶液的黏度迅速降低，鉴于其特殊功能，内切-1，4-木聚糖酶多用于食品行业。-木糖苷酶EC3.2.1.37主要作用是切割低聚木糖和木二糖，有助于木聚糖彻底降解为木糖。该酶通过水解低聚木糖的末端来催化释放木糖残基。 不同来源的木聚糖酶在组成和催化性质上各不相同，但它们的理化性质有相似的地方。大多数微生物木聚糖酶为单亚基蛋白，分子量8145kDa，等电点pI值310，最适作用温度为4075。根据对几十种内切-1，4-木聚糖酶的分子量和等电点进行统计分析后发现，70%的酸性-1，4-木聚糖酶分子量在30kDa以上，而碱性-
13、1，4-木聚糖酶分子量则多在30kDa以下。木聚糖酶 中-木糖苷酶有单聚体、二聚体或四聚体等组成形式，分子量为26360kDa，pI值为3.37.3。其它一些特异性酶，如-L-呋喃型阿拉伯糖苷酶多以单体形式存在，也有二聚体、四聚体、六聚体和八聚体等形式，分子量为53495kDa，pI值为2.59.3 ；-葡萄糖醛酸苷酶的分子量一般都大于100kDa，而pI值都小于4.0。粘度：木聚糖酶在水中溶解后变成有粘性的溶液，使消化道中食糜的粘稠度增加。木聚糖在低溶度时，因与水分子直接互作而增加了食糜的粘度。随着木聚糖溶度的增加，分子本身相互作用，从而缠绕成网状结构，这种作用过程的相互作用极大时，可能会变
14、成凝胶。表面活性：木聚糖的表面带有负电荷，在溶液中趋于与其他物质表面结合。在饲料消化时，多糖可以与肠道中的饲料颗粒表面、脂类微团表面及多糖-蛋白质复合物表面相结合。持水性：由于木聚糖具有高的持水性，这在木聚糖溶度较高时变得尤其显著，因为此时可以形成凝胶。这些效应能根本上改变消化物的物理特性，从而改变肠道的生理机能，即增强对肠蠕动的抵抗力。离子、小分子与木聚糖的结合：除了阳离子与一些木聚糖中带负电基团结合外，木聚糖的立体结构也使它与离子发生螯合作用事实上，阳离子能在木聚糖分子间形成离子桥，这将大大影响其粘度和凝胶的形成特性。小分子通过疏水键的相互作用，也可能与多糖发生微弱的结合。1.1.2木聚糖
15、生产简史 木聚糖酶的研究始于20世纪60年代。目前国际上研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表达 等。而我国对木聚糖酶的研究主要集中在产木聚糖酶优良菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质的研究等方面。当前，木聚糖酶主要通过真菌、细菌等微生物发酵生产获得。根据发酵工艺的不同，可分为固体发酵和液体发酵两种。这两种发酵方式各有其优缺点：固体发酵所用培养基相对便宜，主要以农副产品为主。且操作设备简单，整个生产过程中无废物产生，不存在环境污染问题，产率较高。易于在中、小企业推广应用，目前国内木聚糖酶生产主要采用固体发酵方式。但固体发
16、酵同时也存在不易控制，酶系复杂，纤维素等酶含量高，难以精酶化等缺点；相比较而言，液体发酵由于是在液态环境中进行，菌体、底物、产物（包括热）均易于扩散，使得发酵能够在均质或拟均质条件下进行。该方法便于在生产过程中进行实时检测、控制，易于扩大生产规模。同时，由于液体输送方便，便于机械化操作，产品也易于提取精制。液态发酵工艺的缺点主要是对设备有一定要求及生产成本较高，技术要求也较为严格。但随着生物技术的发展和木聚糖酶广泛应用，采用液体发酵生产木聚糖酶将成为今后发展方向。1.1.3木聚糖酶的用途 从上世纪60年代开始，随着木聚糖酶研究的不断深入，其应用领域也不断扩大，在造纸、食品、饲料、纺织、医药、环
17、境和能源等行业被广泛应用，前景十分看好。在造纸行业中的应用：木聚糖酶在造纸工业中的重要作用体现在其取代了有毒化学物质，通过酶法预处理可以回收造纸行业中有用的副产物等方面。造纸工业中通过木聚糖酶的使用，缩短了纸浆的处理时间，增加了纤维的分离度，使氯气等化学漂白剂更好地渗透到纸浆里，从而大大减少了化学漂白剂的用量并且使漂白效果得以提高。木聚糖酶在造纸工业中还应用于废纸脱墨这一重要环节，不仅使脱墨工艺变得容易，而且减少了化学药品的用量。木聚糖酶应用于纸浆生物漂白工艺过程，减少了氯气用量，减少致癌物质的排放，减轻环境污染，显著改善了纸浆的滤过性、脆性，增加了纤维的分离度、纸浆漂白度，降低了生产能耗，降
18、低了生产成本，其诸多优点不断在造纸工业中显现出来。在食品行业中的应用：木聚糖酶在食品行业中的应用主要体现在将天然半纤维素分解后得到低聚木糖这一环节。在面包的生产中，1/3的水分是面团中的戊聚糖吸收的，戊聚糖的高吸水性对面团和面包的质量有明显的影响。在新鲜蔬菜、水果加工成婴儿食品、膏状物、干燥蔬菜粉末和速溶食品时，营养物质通常被一层坚硬的半纤维素、果胶等物质组成的细胞壁所包围，如果对其用含有纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶的酶制剂来处理，就可在比较温和条件下使组织柔化，使细胞破壁，将有效物质充分提取出来。与此同时也降低了提取液的粘度，使生产过程中的浓缩、干燥效率成倍提高，相应降低生产成本。其他应用：据
19、报道，木聚糖酶可与其它酶共同参与使植物降解为戊糖、己糖，再用其它菌株发酵生产乙醇。也有报道发现能把植物纤维直接转化为乙醇的一些菌，如Thermbacteroides acetoethylicus, Clotridium thermosaccharolyticum。另据报道，木聚糖酶在去污洗涤，医药制造，以及在果实成熟、种子萌发、真菌的寄生及植物的抗性等诸多生理过程中都有着重要的应用。1.1.4木聚糖酶产业发展现状我国对木聚糖酶的研究主要集中在产木聚糖酶优良菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质的研究等方面。当前，木聚糖酶主要通过真菌、细菌等微生物发酵生产获得。根据发酵工艺的不同，可分为固体
20、发酵和液体发酵两种。这两种发酵方式各有其优缺点：固体发酵所用培养基相对便宜，主要以农副产品为主。且操作设备简单，整个生产过程中无废物产生，不存在环境污染问题，产率较高。易于在中、小企业推广应用，目前国内木聚糖酶生产主要采用固体发酵方式。但固体发酵同时也存在不易控制，酶系复杂，纤维素等酶含量高，难以精酶化等缺点；相比较而言，液体发酵由于是在液态环境中进行，菌体、底物、产物（包括热）均易于扩散，使得发酵能够在均质或拟均质条件下进行。该方法便于在生产过程中进行实时检测、控制，易于扩大生产规模。同时，由于液体输送方便，便于机械化操作，产品也易于提取精制。液态发酵工艺的缺点主要是对设备有一定要求及生产成
21、本较高，技术要求也较为严格。但随着生物技术的发展和木聚糖酶广泛应用，采用液体发酵生产木聚糖酶将成为今后发展方向。与国外相比，国内在木聚糖酶方面的研究起步较晚，主要集中于海枣曲霉、黑曲霉、木霉菌、青霉菌等真核微生物和短小芽孢杆菌、串珠链孢菌、链霉菌、环状芽孢杆菌、碱性假单胞菌等原核微生物木聚糖酶的研究。目前为止，国内学者报道对木聚糖酶的研究基本上还仅限于对产木聚糖酶天然优良菌株的筛选、酶的纯化和一些酶学性质研究方面，只克隆了少数木聚糖酶基因27。由于木聚糖酶具有重要的应用价值以及在生物工程技术的重要地位，现在己经有越来越多的科研人员致力于木聚糖酶的开发研究，如高产菌株的选育、工程菌的构建、优化培
22、养条件、无纤维素酶污染的木聚糖酶等。1.2巴斯德毕赤酵母简介1.2.1巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母属子囊菌类,为单倍体,由于在其细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径所必需的酶,如醇氧化酶(alcohol oxidase ,AOX) 、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶等 ,所以可利用甲醇作为唯一碳源和能源。由于巴斯德毕赤酵母能够在简单培养基上高密度发酵生长,所以它最初是作为一种工业的甲醇营养型酵母,主要用来生产单细胞蛋白质。 1.2.2巴斯德毕赤酵母的优缺点 经过二十多年的研究和应用发现,巴斯德毕赤酵母具有以下主要优点:(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动
23、子之一； (2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化； (3)在简单合成培养基中可实现高密度培养； (4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合； (5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。它也具有以下缺点:(1)发酵周期长 (2)甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性 (3)筛选高产菌株需用的药物价格比较昂贵 (4)培养基和培养条件不成熟1.2.3前景展望巴斯德毕赤酵母是单细胞低等真核生物, 它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性, 同时又具有适于真核
24、生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统, 还能分泌外源蛋白到培养液中, 利于纯化。近几十年来, 巴斯德毕赤酵母表达系统发展成为一个较为理想的蛋白表达系统。它具有外源目的蛋白表达量高、基因遗传稳定和分泌效率高等优点, 并具有甲醇精确调控的强启动子醇氧化酶启动子( PAOX )及日臻成熟的高密度发酵工艺, 是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一, 越来越受到人们的重视, 被国内外广泛应用于大量生产外源真核或其他结构较为复杂的原核蛋白。目前, 已经有500多种外源蛋白在该系统中进行了高效表达。 第二章 木聚糖酶发酵机理2.1重组巴斯德毕赤酵母发酵合成木聚糖酶的代谢途径 相对而言，对毕
25、氏酵母的报道比较少且多为非结构模型。由于非结构模型多采用经验的 Monod 模型描述菌体发酵动力学，在表达菌体干重浓度和蛋白方面精度较差。考虑到面包酵母和毕氏酵母在代谢行为和菌体形态多方面有很大的相似性，因此面包酵母的很多研究成果可以为毕氏酵母所借鉴。本章以 Bellgardt（1983）建立的面包酵母动力学模型为基础，借鉴文献所报道的甘油和甲醇的代谢途径，对毕氏酵母发酵动力学建模。甘油的主要代谢途径包括磷酸化、糖酵解、三羧酸循环和呼吸链。在甲醇期，甲醇首先被氧化为甲醛，甲醛随后进入分解代谢与合成代谢两个途径。在分解代谢中，甲醛被氧化为甲酸盐和二氧化碳，并以电子NADH的形式释放能量。合成代谢
26、途径与甘油期类似，也包括磷酸化、糖酵解和三羧酸循环等过程。2.1.1甘油代谢途径 细胞外的甘油进入细胞内部，首先被甘油激酶磷酸化为三磷酸甘油 G3P（Glycerol3-phosphate）。G3P 在三磷酸甘油脱氢酶的作用下被氧化为磷酸二羟丙酮。经过糖酵解过程，磷酸二羟丙酮被分解成丙酮酸（PYR）。丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下被氧化为乙酰辅酶 A（Acetyl-CoA）。通常在没有任何反应限制下，乙酰辅酶 A 直接进入三羧酸循环（TCAcycle），在此过程中会有大量细胞物质合成（如氨基酸、核酸等），同时伴随电子载体（NADH）和能量（ATP）的转换。在代谢过程中，如果溶氧或者丙酮酸脱羧反应
27、速率受到限制，代谢将会进入乙醇发酵途径。此时，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成乙醛（Acetaldehyde），乙醛在醇脱氢酶的作用下生成乙醇。而当上述限制解除后，乙醇又可作为基质被利用，这时，乙醇首先被氧化为乙醛，乙醛进而被氧化为乙酸盐，最后转化为乙酰辅酶 A 进入 TCA 循环。伴随着甘油的代谢途径，也有呼吸链的作用。呼吸链的主要作用是为细胞的生长和维持提供能量。关于甘油期内细胞的合成代谢，在此假定细胞物质小部分由 G3P 转化生成，其余大部分在 TCA 循环中生成。乙醇的生成和消耗过程见图 2.1 中的点框，三羧酸循环和呼吸链分别见图 2.1 中的虚线框。图 2.1 给出了简化的甘油在毕
28、氏酵母细胞内部代谢途径。 图2.1毕赤酵母甘油代谢途径其中甘油转化为三磷酸甘油： （2-1）G3P 的糖酵解方程（2-2）以及G3P 合成细胞物质的方程（2-3）如下： （2-2） （2-3）视发酵罐内溶氧水平或者丙酮酸脱羧反应速率是否受到限制，丙酮酸可能直接进入三羧酸循环或者进入乙醇发酵支链。在我们的实验中，溶氧浓度一直保持在 30以上，所以溶氧不受限；同时实时测量表明发酵罐内乙醇浓度在 00.5 g l-1较低的范围内，为此出于模型的简化，本文忽略乙醇的发酵途径，即去掉图2.1中点框部分，认为丙酮酸直接进入三羧酸循环： （2-4） （2-5） (2-6)其中（2-5）是 TCA 循环的简化
29、方程，（2-6）描述了三羧酸循环过程中细胞物质的生成。呼吸链中提供大量的能量转换，见下式： （2-7）甘油代谢过程中产生的 ATP 一部分用于细胞生长过程的能量消耗，另一部分用于细胞自身生命的维持，甘油代谢过程中，细胞物质主要在 G3P 糖酵解过程和三羧酸循环中合成。2.1.2甲醇代谢途径图 2.2 是简化的甲醇期甲醇的代谢途径，甲醇首先被醇氧化酶（AOX）氧化成甲醛和过氧化氢。甲醛随后进入两条代谢途径，小部分进入分解代谢，大部分进入合成代谢。在分解代谢中，甲醛首先被甲醛脱氢酶（FLD1p）氧化为甲酸盐，并进一步被甲酸盐脱氢酶（FDH）氧化为二氧化碳，同时以电子 NADH 的形式释放能量，同时
30、也避免了细胞内部甲醇积累过多而产生毒害作用（Sibirny et al., 1990）。在合成代谢中，甲醛在二羟基丙酮合成酶的作用下与 5 磷木棉糖结合生成三磷酸甘油醛（GAP），GAP 随后进入糖酵解和 TCA 循环。本文假定甲醇期的细胞物质主要从 GAP 和 TCA 循环中转化合成。消耗的甲醇进入分解代谢的比例为 。对于 的大小，文献报道结论不一。Veenhuis et al.（1983）认为，甲醇代谢过程所需的能量主要来自分解代谢，因此进入分解代谢途径的甲醛较多；而 Sibirny et al.（1990）认为，分解代谢的作用主要是保护细胞不因大量的甲醇残留而中毒的，代谢过程中需要的能量
31、主要来自合成代谢，故进入合成代谢途径的甲醛较多。由于碳源主要是在合成代谢途径中消耗的，大量的能量应来自于合成代谢。在本文的实验中，甲醇期比生长速率的控制在较低水平（0.003-0.0085 h-1），甲醇的残留浓度几乎为零，因此不需要进行过多的分解代谢以避免较高浓度的甲醇残留，故此本文 值设定在较低的0.25。不可否认， 的取值未必精确，还需要进一步的实验结果来修正。幸运地是， 引起的误差可以由模型中的其它参数来弥补。图2.2 毕赤酵母甲醇代谢途径在此可以列出甲醇期的化学计量平衡方程：甲醇首先被氧化为甲醛： （2-8）甲醛在分解代谢中被氧化为甲酸欲，最终转变为二氧化碳： (2-9)甲醛在合成代
32、谢过程中被磷酸化。击要指出的是，生成1摩尔的GAP击要消耗3摩尔的甲醛(Lin Cereghino and Cregg, 2000: Lueers et al., 1998)。 （2-10）GAP酵解生成内酮酸以及合成细胞物质的方程分别见下式： （2-11） （2-12）内酮酸被氧化为乙酞辅酶A甲醇期乙酞辅酶A以后的代谢途径以及呼吸链中的代谢途径与甘油期相同，前面有所介绍，这不过多重复，主要反应有： （2-4） （2-5） (2-6)同前所述。2.2巴斯德毕赤酵母发酵生产木聚糖酶过程中的主要影响因素2.2.1碳源的影响 甘油是菌体生长阶段普遍采用的碳源,通过补料加入培养基,其浓度过低或过高会限
33、制或抑制菌体生长,因此,需要优化初始甘油浓度,选择有效的补料方式。葡萄糖也可作为碳源,虽效果不如甘油,但性价比却优于甘油, 以葡萄糖代替甘油将有利于工业化生产。甲醇是诱导表达阶段的碳源,其浓度(CMeOH )和补料方式是关键。CMeOH过低,会限制菌体生长和诱导强度; CMeOH过高,则对菌体产生毒性。甲醇最佳浓度一般在0. 5% 3% ( v/v) ,但有些蛋白高于3%,因此,不同蛋白的最佳浓度不同,需通过实验并结合补料策略确定。CMeOH通过补料调节并保持恒定,其检测控制方法有溶氧反馈控制、甲醇离线控制和在线控制,而甲醇在线控制最优。2.2.2氮源的影响氨水常作为氮源,并用于调节pH,其释
34、放的NH4浓度对菌体生长、蛋白表达和降解有重要影响。浓度过低,限制菌体生长,并增加蛋白的降解;浓度过高,虽可减少蛋白降解,却会抑制菌体生长和蛋白表达。因此, NH4+浓度需要优化,并采用恒浓度或变浓度法调控。谢静莉等在发酵后期添加(NH4 ) 2 SO4 ,使NH4+浓度维持在150mmol/L以上,蛋白表达量提高58. 8%。采用变浓度法调控NH4+浓度后,既促进菌体生长,提高表达量,又降低蛋白酶降解。2.2.3基础盐和PTM1微量盐的影响在表达分泌蛋白时,需降低基础盐浓度。基础盐。浓度过高,会导致菌体死亡,并增加蛋白酶释放,增加蛋白降解。Surribas等以电导率反映基础盐浓度,将初始电导
35、率降为30% ,并在诱导过程维持在20%后,菌体死亡率下降。Zhao等将基础盐浓度降为1 /4时,诱导前后菌体死亡率分别降低83. 3%和48. 6% 59. 2% ,菌体密度增加25% , HAS2IFN22b表达量提高92. 0% ,并保持恒定。PTM1 微量盐溶液成分过于复杂,不能高温灭菌,易形成沉淀且价格较高,不利于大规模发酵,可用低浓度的酵母抽提物来替代PTM1 微量盐,简化工艺,也可用麦芽汁来替代,性价比可大幅提高,即简化工艺又降低成本,有利于工业化生产。2.2.4添加其它物质,降低蛋白酶降解在培养基中添加VitC、VitE可以减少菌体死亡,减少蛋白酶的分泌;添加蛋白胨或酪蛋白水解
36、物等底物,竞争性抑制蛋白酶活性;添加蛋白酶抑制剂或EDTA,抑制蛋白酶活性, 它们都能降低蛋白酶降解。Xiao等添加VitC并维持在410mmol /L后,菌体死亡率降低65. 4% ,水蛭素降解程度降低30. 2% ,完整蛋白的表达量提高56. 8%。Zhao等在诱导前添加2%大豆胨后, HAS2IFN22b只有极轻微的降解。Ayed等添加酪蛋白水解物并维持在0. 1%或EDTA 并维持在10mmol /L后,均能阻止h IFN2b 的降解,前者使产物保持恒定,后者使表达量提高65%。2.2.5pH的影响pH对菌体生长和诱导表达都会产生影响,尤其是诱导时的pH,不仅会影响蛋白表达量和活性,而
37、且会通过影响蛋白酶活性,来改变蛋白的降解程度。如当pH由3升至7时, rHSA的降解逐渐减少。因此,必须选择合适的pH,一般在3. 07. 0,而且在不同阶段,应选择不同pH,采用变pH发酵。pH一般是通过补加氨水来调节,若NH4+浓度过高,则改为补加碱来调节。2.2.6温度的影响 温度升高,有利于生长代谢和蛋白表达,但温度过高反而会使菌体过早衰老,发酵周期缩短,降低蛋白表达量和活性。因此,必须选择合适的温度,而且在不同阶段,应选择不同的温度,采用变温发酵。菌体生长最适温度为30,诱导表达的最适温度应降低,常为20-28,尤其是分泌蛋白,低温更有利于表达。低温可以降低折叠压力,有利于新生肽链的
38、正确折叠;降低菌体死亡率,减少蛋白酶分泌,降低蛋白酶活性;提高AOX酶活性和转录水平,还可以提高蛋白稳定性。2.2.7溶氧浓度(DO )的影响高密度发酵需要消耗大量的氧气,尤其是在甲醇诱导阶段,供氧往往成为限制性因子。若供氧不足,不仅会抑制菌体呼吸作用,限制菌体生长繁殖,而且会积累甲醇及其代谢产物甲醛和过氧化氢,对菌体产生毒害,降低蛋白表达量。因此,必须保证足够的供氧,一般DO20% 30% , DO也不能太高,超过60% ,细胞就会发生氧中毒。2.2.8诱导前菌体密度( CWPT I )与比生长速率(PT I )的影响CWPTI和PTI分别反映菌体生物量和生理状态,提高CWPTI和PTI均能
39、有效提高蛋白表达量。提高CWPTI可以提高诱导阶段的生物量,并使更多的甲醇转向蛋白合成，,从而提高表达量;提高PTI可以增强菌体翻译效率,转入诱导时,可迅速合成酶系代谢甲醇,快速表达出蛋白, 提高比生产速率和表达量。 第三章 木聚糖酶发酵的工艺流程3.1高效分泌木聚糖酶的毕赤酵母工程菌株的获得运用RTPCR 从黑曲霉AN070902 中克隆木聚糖酶cDNA 片段，与载体pPIC9K 相连，构建重组载体VMANpPIC9K，电转化毕赤酵母GS115，筛选产酶最高菌株进行液体发酵。在该项设计中，高效产酶菌株由工厂准备并储存。3.1.1材料3.1.2黑曲霉木聚糖酶cDNA 的获得3.1.3表达载体V
40、MANpPIC9K 的构建3.1.4重组菌株VMANpPIC9KGS115 的获得和高酶活菌株的筛选3.1.5重组毕赤酵母的扩大培养 将可以分泌木聚糖酶的重组毕赤酵母加入到大型种子罐中进行扩大培养，种子罐操作。(1)温度控制：301。(2)(NH4)2S04：添加量：5Kg/m3。(3)罐压：0.05MPa。(4)通风控制：O6h，3640m3/h；711h，渐增至72m3/h；1215h，渐增至144m3/h；1619h，180m3/h；2024h，280288m3/h：24h后，360m3/h；加大风量，可使菌体生长速率加快，但菌体呼吸强度和杂菌生成量可能增加。(5)培养时间：36h。本设计一级种子罐培养时间为20h，二级种子罐培养时间为16小时。(6)搅拌速率：220r/min3.2重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产木聚糖酶3.2.1原料（1）原料的选择1、选来源丰富、质量好、且便于储存运输的原料；2、因地制宜，就近取材，尽量降低成本；3、符合生产工艺要求；（2）菌种:根据实际需要，本次设计用到的重组巴斯德毕赤酵母基因工程菌由本实验室构建（如上所述）并保藏。（3）培养基及所需溶液: YPDs/Zeoein:1og/L酵母膏、Zog/L蛋白陈、209/L葡萄糖、log/L琼脂、100mg/LZeoein。YPD:10岁L酵母膏、20留L蛋白陈，20留L葡萄糖、10留
