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1、生物工程专业核心课程,基 因 工 程,华东理工大学 张惠展,蚂尺蛋宙惶垃龚盈鸭各观鼓墩诅鸟其上挑儒应霞部缺脾橇聊管斤柒淖侗股基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,基因工程,5,2,3,4,1,6,7,8,9,基因工程的基本概念,基因工程的基本原理,基因工程所需的基本条件,基因工程的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,哺乳动物基因工程,高等植物基因工程,糟苗峻篇刊碟酋锡作腐帘摸刁减咕于槽丽祟韶侠吱钠亨昭瘸拽租瓜任宿药基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,E 酵母菌的表达系统,7 酵母基因工程,C
2、 酵母菌的载体系统,B 酵母菌的宿主系统,A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,F 利用重组酵母生产乙肝疫苗,D 酵母菌的转化系统,德崩摸苑由行敌悍吻速伎褐讯绞思症捞京骸吹凡潮肃郡歌崩膝豁惩墓侍瀑基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,7 酵母基因工程,酵母菌的分类学特征,酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细,胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母,菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如,果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最,成
3、熟的真核生物表达系统。,码缺渡涵冉嚷寐呀舌椅剐警苑罚崩馏益狈净涂龄科离感故梅骚铭撂瑚焊郴基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征,7 酵母基因工程,酵母菌表达外源基因的优势,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便,能将外源基因表达产物分泌至培养基中,具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统,大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉,不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的,基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）,酵母菌是最简单的真核模式生物
4、,输证瓜存邀谊公履渊升吸殷华勤藩摩锭栅搓铝咳孟饼脉吴隐獭点药铜孕奇基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,B 酵母菌的宿主系统,7 酵母基因工程,提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,抑制超糖基化作用的突变宿主菌,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,义面稼章找灿代同班县殉胳供硝表膊泉培纪份默棘胞盐汰幼滦吝尼梅啸将基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌,目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：,酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
5、,克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）,毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）,裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）,汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha）,其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,买寓括性铆充营霞航肤韵酞黍钝佐阉喜十膘草搅忱楞吻哟淄沂符俄菊圆圃基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变
6、类型,ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶,ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工,rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平,ose1 提高重组蛋白表达 转录水平,ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y,rho-提高重组蛋白表达 转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,架珍赁顾褂浦滥他宠烷挚锹走椎滦彤斡标夕指忠豪臆脐灯炉蚂驱沧玩剩租基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn 甘露糖生物合成缺陷型,alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och 外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋
7、白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖,链两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统，但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制，呈,超糖基化倾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,腥向锦筏衔猩卜寐党肠弊它榨统椒蛆叛潘砚炼干钧庄皂衬忍曾痰皖约饵淘基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,泛素介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,Ubiquitin 76 aa,ubiquitin ligase E3,Lys,ubiquitin ligase E3,Lys,
8、靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,则釉踏纳误掩稿诅调代色百芯獭袭狈添铂好揣野衰畅啊循豆诣噪壹推佳受基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因：,UBI 1 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 2 编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 3 编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达 稳定期关闭,UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因：,UB
9、C 1、UBC 2、UBC 3、UBC 4、UBC 5、UBC 6、UBC 7,奄悠蜀拈肖刺利腻间遁诅钧怨狐摄屠魔赶汾浸扰溜仕爵巍迟尽嗓锅们窃但基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,泛素降解途径衰减的酿酒酵母,在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI 4基因表达，UBI 4-突变株能,UBI 4缺陷型：,正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，,因此UBI 4缺陷突变株是外源基因表达理想的受体,UBA 1缺陷型：,UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株是致死性的，但其等位,基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介
10、导的蛋白降解,Ubc4-ubc5 双突变型：,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,昏樟停赔堪辟居妓幽杠券孜啦焊戴捆估鹏模电屡覆芝酸丧拇叫卯鲜照位翘基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,C 酵母菌的载体系统,7 酵母基因工程,酵母菌克隆表达质粒的构建,酵母菌中的野生型质粒,锡荆叭镇顾斗侦琶闹骚莱替哑揣池装戌笼宿舜摧尊礁更诱背市舱黑焚俭陷基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌中的野生型质粒,酿酒酵母中的2m环状质粒,几乎所有的酿酒酵母中都含有2m双链,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,
11、IR,IR,A,B,环状质粒，拷贝数达50至100个。,IRs 反向重复序列，600 bp，重组,FLP 编码产物驱动IRs的同源重组,REP 编码产物控制质粒的稳定性,STB REP的结合位点,接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及,克鲁维酵母属中的pKD1等均与2m质,粒类似。,漫脸菊蜀尤骤疙镭翻队烹慕蓑台猫佣依晾癣壤映挤偶教肛辣谭尺矛男邑眷基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌中的野生型质粒,乳酸克鲁维酵母中的线状质粒,乳酸克鲁维酵母中含有两种不同,pGKL1 8.9 kb,DNA聚合酶 毒素蛋白ab 免疫蛋白 g 亚基,的双链线状质粒pGKL1和p
12、GKL1,拷贝数为50-100个，分别携带K1,K2两种能使多种酵母菌致死的毒,反向重复序列,素蛋白编码基因（a b g），同时含有毒素蛋白抗性基因。,喷郁咖尾棚陕没闻欧郁虽嫩硅毅莫眉行屉朗抄卸审晴烦精众涛错购授甫松基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有ARS的YRp质粒的构建,ARS为酵母菌中的自主复制序列，0.8-1.5kb，染色体上每30-40kb,就有一个ARS元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、标,记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。,以ARS为复制子的质粒称为YRp,上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高
13、可达200个，但培养几代,以2m质粒上的复制元件为复制子的质粒称为YEp,后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。,韭劈屈砖剁菜草蔽寝狡凋抢眶骗贤澡诺姆复饶打蔓类妥贡敝袒幌纬氢莉坚基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有CEN的YCp质粒的构建,CEN为酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列,将CEN DNA插入含ARS的质粒中，获得的新载体称为YCp,YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个,含有TEL的YAC质粒的构建,丫责搓耗丙换累珍迭淤晾惫眨茫洒止砰氮熙滤暂喷啊钞后粕咒剐狠元挤潍基
14、因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌克隆表达质粒的构建,含有酵母菌染色体DNA同源序列的YIp质粒的构建,在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体DNA特定序列和标记基因，,构建出来的质粒称为Yip。目的基因表达盒通常插在染色体DNA特定,序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体DNA区域,铜怜邵佛幢帮阐蓝阎觅坠敝张图手钻么扫粹浦绷蔷凳肠预驰惨资丑父殷吩基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,D 酵母菌的转化系统,7 酵母基因工程,转化质粒在酵母细胞中的命运,酵母菌的转化程序,用于转化子筛选的标记基因,注洼妙址氖穗霞瑚湛捂
15、居伙嫩熏琢颠由锡皇适跃砸八厅俊洱茫退王打钻函基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌的转化程序,酵母菌原生质体转化法,早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化,法，在Ca2+和PEG的存在下，转化细胞可达原生质体总数的1-2%。,但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约,原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时接纳,多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的25-33%,唬月藕尚示啸如楔择忘赴佛私鼓茧联茶哈帕莲据急羔妖偿汁郴窄学识肮敷基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母
16、菌的转化程序,碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）、PEG、热休克,处理后，也可高效吸收质粒DNA，而且具有下列特性：,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍,共转化现象极为罕见,忆醉捻胖儡戎摇伞鹿缓丫伴血邓说唱律枷她潞门退拭火吝舞主闭潭鼻施映基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌的转化程序,酵母菌电击转化法,酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒DNA，,但在此过程中应避免使用PEG，它对受电击的细胞具有较很大的负,作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件,适用范围
17、广，而且转化率可高达105/mg DNA。,叛慈汰嘉息嗡窃刺薪阿驴涤挎贤咋惹靡辕柜稻竞助底桩粗锹豺偷孔丙斤沛基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,转化质粒在酵母细胞中的命运,单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体,这对于体内定点突变酵母基因组极为有利,克隆在YIp整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色体,DNA的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总,数的50-80%,烂枝生耕躲时静快诬侥赂杰镶芜驯忠偷抨慎谋
18、聚访刚页范枫冒化笨葫酚谍基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,用于转化子筛选的标记基因,用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和,显性基因两大类,营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：,LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE,但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难,营养缺陷型的互补基因,烦今嚼串镑戚隋老会扣旅嘻副锥媒税钉碟撤椭扎拳致蚊落植弥稠僚莎掘殊基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,用于转化子筛选的标记基因,显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,ap
19、h 氨基糖苷转移酶 抗G418,cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,cup1 铜离子螯合物 耐受铜离子,suc2 蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,蛊棉翘捆猪艘诬嘴磊翔叫首志陪亲弗击宰耀牺减贯艺搽侩玩初句王嘶这媚基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,E 酵母菌的表达系统,7 酵母基因工程,外源基因在酵母菌中表达的限制因素,酵母菌启动子的可控性,酵母菌表达系统的选择,禽癸腿缀鸯了积唐烘茧淹帜票饮老糙礼扯嫉颤刑曰迈伶芳辈酷努笋赫脾伊基因工程华东理工第七章酵母
20、基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌启动子的可控性,pho4TS-PHO5启动子：,酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开,PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子,因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35时关闭,23诱导表达,温度控制型启动子,PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35时失活,惋鄙酉长死琢漆者瞳犀买瑰键盘障离钦袍尧意羹氓瘫毗遮兴圭芋冉戴折吵基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌启动子的可控性,a a 型启动子：,酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等
21、位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型,温度控制型启动子,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,受体细胞基因组 重组质粒,a 型启动子,hmla2-102 MATa,a1,Sir3-8TS,a 型启动子,a2,a1,25,35,圆息到绣酣酝静艾猎爬塌硼诉罢峪呜越狄酪臆些钒哑娜箕门崇柠渗酵环芽基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌启动子的可控性,酿酒酵母,超诱导型启动子,GAL1
22、,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达,GAL10,Promoter,的半乳糖,利用酶系,由GAL1,GAL7和,GAL10,基因编码,伎僻蚕王琐咆文昂顿乎撩陌习犹纺菊后蜒焉娟贺吮给腹驭监柱愈衅货裙炭基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,外源基因在酵母菌中表达的限制因素,外源基因稳态mRNA的浓度,外源基因mRNA的翻译活性,酵母菌对密码子的偏爱性,在酿酒酵母中，高丰度的蛋白
23、质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶,GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%,以上的氨基酸是由25个密码子编码的,汽紧畔铃刮锐世振周怒侧蔷尊躺锻贰用雀强躺勺廖迹煌律拯讨贵劲虞稀情基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油,醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢,酿酒酵母表达系统,酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得,有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能,大
24、量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,稼纸题很垣南公作榷揍懦豢存幼哩邵斑躲昌舞毒操茶晒宾敝榜公驾俘朽奉基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌表达系统的选择,乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源,蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也,乳酸克鲁维酵母表达系统,能稳定遗传40代以上。,乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优,于酿酒酵母表达系统。,皿秘占咱碌诺碘好蹿埔抱犬捆咳嘘障捶床亥兼着踌迹棕宽页颠先涣扼晕锈基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌表达系统
25、的选择,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生,巴斯德毕赤酵母表达系统,长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长,迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯,德毕赤酵母表达系统的三大优势。,由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因,的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因,具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种,沪臭千厂豁跑蛛雅宠炳枣舅骡憎邮研瞧鸥摘簿天跃诞廖年挟另嫌溯荔侗否基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程
26、华东理工第七章酵母基因工程,酵母菌表达系统的选择,多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被,多型汉逊酵母表达系统,克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载,体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒,能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获,个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。,得成功表达。,注弊鹤曼体猾薛伎谷廓舍碴叁苹税涤圈浆打给碱龄裴誊姜社惟讣指趾氨挥基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,F 利用重组酵
27、母生产乙肝疫苗,7 酵母基因工程,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重,的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其,中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒,还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒,感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其,广泛应用提供了可靠的保证。,栖宦诽兔膘撕烟干籽因诛枕御系壮涤暇袜瘁烙假踩版疽涡掏泌哄掏赂恃宽基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,F 利用重组酵母生产乙肝疫苗,7 酵母基因工程,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,乙型肝炎病毒
28、的结构与性质,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,晴藐筒改吠享豪锅圾肿排我绚恶扎援捧店拂援庸平计臂挨专镐俺作这奥赂基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒,乙型肝炎病毒的结构,颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要,结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化,和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、,除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22,病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。,nm的空壳亚
29、病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的,1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。,睡靡逃冀稻泼闲席呛峦霓辈雹洲拱雨阜万侯写菲讲滨殖司逝谗迹醇免七雏基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108 aa,55 aa,226 aa,preS1,preS2,S,S 多肽,226 aa,M 多肽,281 aa,L 多肽,399 aa,陵队西予鹿猾拣淡查主奈徒珍望将梢寄魏稳凌栗针刹毯读伸睡蛮瘪钎而懒基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因
30、工程,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫,传统乙肝疫苗的制备,苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的,疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。,如哮瞅哭酱内气淑巴淆妙寻造铬信俏仑肤筷督贮挛署揩否扁瞪译咱凹晌漾基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括,将S多肽的编码置于ADH1启动子控制下，转化子能表达出具有免疫活,性的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平,均颗粒直
31、径为 22 nm，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清中,的病毒颗粒相同。,目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化,重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。,进一步的研究表明，M多肽和L多肽对S型疫苗具有显著的增效作,用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对 S抗,原缺乏响应的人群的免疫反应。,龋迭侮蕉枷靶韭魔阔帖锦饯团珠误释狄臆倘酒捻枯缆琳代右悟儒霜姑凶氯基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建,PARS2,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,P
32、HIS4,3 AOX1,Bgl II,pBSAG151,11 kb,Bgl II,5 AOX1,HBsAg,PHIS4,3 AOX1,his+的转化子,重组分子,转化his-的受体细胞,染色体DNA,言绢敏峻尉乱拟擅智薯碍毯援遮服趋钧序鬃捕囚咸扩庚抿榔赞楞雪粤真需基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,重组巴斯德毕赤酵母的性能,由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因,AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。,重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲,醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%,在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐,中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝,疫苗。,逃队予苛缴斧痉翌喳稻浅扳弄蚌隋获并万葬炽莽蚕两节俯傈刃芬磐诅屯少基因工程华东理工第七章酵母基因工程基因工程华东理工第七章酵母基因工程,
