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1、链霉菌的基因组 及其抗生素生物合成基因研究 吴雪昌 浙江大学遗传学研究所 Institute of Genetics Zhejiang University,链霉菌是一类主要来源于土壤的革兰氏阳性菌，约占土壤可培养微生物的120%。在系统生物学上它归于链霉菌属（Streptomyces），链霉菌属中的链霉菌，迄今有约500个种。它与其它原核生物相比，链霉菌具有比较复杂的形态结构、生活周期与遗传特性。其重要特点之一是具有丰富的次级代谢多样性。,在已知的微生物所产生的抗生素中，约23由放线菌产生，而其中的80来源于链霉菌，可见链霉菌在医药上的重要性。链霉菌由于它与我们人类健康的密切关系及商业上的重
2、要价值而成为当代生命科学中的研究热点之一。下面择几个较重要问题加以探讨：,这一研究计划共有44位学者参与完成，涉及四个单位。主要完成单位是 Wellcome Trust Sanger Institute,Hinxton,Cambridge，UK.，世界著名的链霉菌遗传学学者D.A.Hopwood 及他所在的John Innes Center(Norwich,UK)也参与了研究，,参与研究的还有 Department of chemistry,University ofWarwich,Coventry,UK.，我国台湾的 Institute of Genetics,National Yang-M
3、ing University 也有一位学者（C.W.Chen）参与了这一计划的研究工作1。已公布的链霉菌的基因组的基本信息见Table 1：,表,从上表可见，链霉菌的基因组是目前已完成测序的原核生物基因组中生物信息量较大的基因组之一，生物信息量排名第二，比大肠杆菌（E.coli K12 4639221bp）的基因组大近一倍；最大的为Bradyrhizobium japonicum（nt.9105828bp）。目前已完成测序94个细菌菌株（涉及51个细菌属）。链霉菌基因组见下图：,二、链霉菌抗生素生物合成相关基因簇 研究已知，链霉菌抗生素生物合成相关基因在链霉菌细胞中有两种存在方式：一是大多数抗
4、生素其生物合成基因存在于染色体上。二是少数抗生素的生物合成基因存在于游离状态的质粒上，如天蓝色链霉菌3（2）菌株中的次甲霉素（Methylenomycin）的生物合成基因位于SCP（1）质粒上。,链霉菌抗生素生物合成相关基因在染色体或质粒上往往成簇排列,构成基因簇（Gene cluster）。包括抗生素的生物合成基因、耐药基因、转运基因和调节基因，而耐药、转运与调节基因三者大多与抗生素生物合成基因紧密连锁并存在一种协同调节机制。,例如目前用于治疗急性白血病(Leukemia)与淋巴瘤(Lymphomas)有良好疗效的阿克拉霉素（Aclacinomycin），它是由Streptomyces ga
5、lilaeus 合成的聚酮类化合物，其合成酶的生物合成涉及13个基因，紧密成簇排列。请见下图与表：,Gene 203：19,链霉菌抗生素生物合成相关基因在染色体或质粒上成簇排列的特性，为我们研究这些基因的结构、调控表达与进行基因克隆提供了方便。但是也带来了一些问题，例如其中某一个基因一旦发生突变，有时往往要影响到邻近基因的调控表达效率甚至关闭表达。这也可能是导致抗生素生产菌株常常表现出生产性能不稳定、效价达到一定水平后，进一步提高其发酵效价就十分艰难的重要原因之一。,三、链霉菌抗生素抗性（耐药）基因（Antibiotic resistance gene）抗生素普遍存在于环境中（尤其是土壤环境中
6、），对细菌的生存造成了压力。在长期的进化过程中，抗生素耐药基因在细菌中已经普遍存在，这是自然选择的结果。在非抗生素产生菌中，抗生素耐药基因的表达主要是为了应对环境的抗生素压力。,而对某些产抗生素链霉菌而言，除了受到环境中的抗生素压力外，还首当其冲地受到自身所产生的抗生素的更强的压力，在长期的进化中，这些链霉菌也被认为是通过自然选择积累了相应的抗生素耐药基因和调节基因，以保护自身免受这些高浓度的致命代谢物的伤害。而这些基因又被认为是病原细菌获得性耐药因子的最初来源。,产抗菌株存在抗性基因，这不难理解。研究发现，产抗菌株不仅存在抗性基因，而且抗性基因还参与了抗生素的生物合成与调控，以确保抗生素耐药
7、性的及时表达，从而免受自身抗生素的伤害。研究还发现，产抗菌株的抗性水平与该菌株自身的产抗水平呈正相关。,这就使研究者们很快设想到，提高产抗菌株存在的耐药水平，就会提高菌株的产抗生素水平。因此，对产抗菌株的抗性基因的结构、表达调控研究，在理论与工农医实践上均有重要的意义而成为研究热点之一。到目前为止，已揭示了一些基本规律，也开展了有一定成效的应用研究。,1、在产抗生素的链霉菌中，耐药基因一般与抗生素合成基因紧密连锁，而大部分抗生素合成基因簇位于染色体DNA上。因而与合成基因连锁的耐药基因也存在于染色体DNA上。到目前为止所发现的抗生素合成基因簇中只有位于SCP1质粒上的次甲霉素基因簇是一个例外，
8、抗生素耐药基因可以脱离抗生素合成基因簇而单独存在于质粒上，随质粒一起转移和扩散。,2、抗生素耐药基因的抗抗生素种类（选择性）与其位置有关。抗生素耐药基因对抗生素的选择性不同，其中具有较强的抗生素选择性耐药基因往往与抗生素合成基因成簇存在，而表达多种抗生素耐药性的基因则不与抗生素合成基因成簇存在。,如始旋链霉菌（Spristinaespiralis）能够合成链阳菌素类抗生素原霉素（Pristinamycin），它是两种结构不同的分子的混合物，即原霉素（环形十六肽）和原霉素（多不饱和大环内酯）。从始旋链霉菌中克隆的原霉素耐药基因 Ptr 能够编码膜转运蛋白，Ptr 在浅青紫链霉菌表达时，不仅可以提
9、高对原霉素和的耐药性，还可以提高利福平耐药性。Ptr 独立于原霉素合成基因簇而存在。,3、耐药基因可能是抗生素合成基因簇的一部分，在抗生素合成过程中起限速作用。在吸水链霉菌（Shydroscopicus）中，与抗生素bialaphos合成基因紧密连锁的耐药基因bar所编码的产物与bialaphos生物合成途径第10步所需的乙酸基转移酶相同，bar可能是bialaphos生物合成途径的一部分。,4、耐药水平与抗生素合成水平呈正相关，抗生素产生能力的提高应该是抗生素合成调控基因的超量表达。这说明表达抗生素耐药性的酶是抗生素生物合成途径的限速酶.Fernandez从普卡霉素产生菌Sargillace
10、us中分离的 2个普卡霉素耐药基因 mtmG和 mtmG，,分别编码普卡霉素生物合成过程中所必需的糖基转移酶和葡萄糖醛酸苷转移酶。分别将这2个基因通过基因置换失活后，高效液相色谱分析发现变异株失去了合成普卡霉素的能力，但积累了普卡霉素生物合成途径中的中间产物。,5、在抗生素耐药机制方面，在细菌中，至少存在以下几种抗生素耐药机制：（1）合成钝化抗生素的酶，如弗氏链霉菌的氨基糖在耐药性主要通过产生催化抗生素共价修饰的酶；（2）改变细菌细胞膜结构，如胰蛋白的缺失或变异、内膜渗透性的改变等；,（3）通过主动排出机制降低细胞内的抗生素积累，如抗生链霉菌（S.antibioticus）oleC 基因所控制
11、的竹桃霉素主动外排；（4）改变核糖体靶位，如从卡那霉素产生菌卡那霉素链霉菌（Skanamyceticus）中分离得到的一种诱导性卡那霉素耐药基因，,通过修饰核糖体，调节蛋白质合成，可以赋子浅青紫链霉菌(S.lividans)、淡紫灰链霉菌（Slavendulae）和微小链霉菌(S.parvulus)卡那霉素耐药性；（5）改变靶酶，如青霉素结合蛋白；（6）过量合成靶酶；（7）存在抗生素抑制的旁路。,四、产抗链霉菌的基因工程随着对抗生素生物合成基因以及调控基因的深入了解，人们已可以在分子水平上改造链霉菌使它们过量合成抗生素或改造抗生素的结构获得新功效抗生素。目前提高产抗链霉菌产抗水平的基因工程所采
12、用的主要策略与有关基因克隆实例：,（一）策略、改善或提高限速步骤相关酶的活性，或增加单位细胞内控制限速步骤相关酶的基因拷贝数，解除或一定程度上解除该酶的限速性；、用强启动子替换相关基因簇中的弱启动子；、增加细胞内携带抗生素生物合成基因簇质粒的拷贝数；,、抑制负调控蛋白的合成或敲除编码负调控蛋白的基因；、将经改造的或筛选获得的强抗生素抗性基因导入低耐药菌，提高产抗菌株的抗生素抗性；6、引入编码抗生素分子结构修饰酶之基因，改变原抗生素分子结构，获得具有新功能的抗生素。,（二）实例,抗 生 素（公司）克 隆 方 法 与 类 型,-内酰胺类 克拉维酸（Beecham）头霉素C（Panlabs）芳香聚酮
13、体类 放线紫红素 榴菌素 土霉素（Pfizer),突变互补 全部生物合成基因克隆在异源宿主中 突变互补 actI基因作为杂交探针 抗性基因,抗 生 素（公司）克 隆 方 法 与 类 型,大环内酯类 泰乐星（Eli Lilly)碳霉素（Eli Lilly)红霉素(Eli Lilly,Abbott)Avermectin(merck),根据O-转甲基酶序列合成的寡聚核苷酸探针，抗性基因选择 抗性基因 抗性基因 突变互补,抗 生 素（公司）克 隆 方 法 与 类 型,氨基糖苷类 链霉素 西索米星(Scheriny),突变互补 抗性基因,抗 生 素（公司）克 隆 方 法 与 类 型,其他种类 诺西肽(Mitsubishi Chemical Industries)次甲霉素 十一烷基灵菌红素 放线菌素D Bialaphos(Meiji Seika,Biogen)嘌呤霉素,抗性基因突变克隆，全部生物合成途径基因克隆于异源宿主突变互补酚口恶嗪酮合成酶活性基因克隆抗性基因选择，突变互补抗性基因,谢谢！,
