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1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质(Separating serum by polyacrylamide gel electrophoresis),实验目的实验原理试剂、仪器实验步骤实验结果与分析注意事项,实验目的,1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离混合蛋白质的原理。2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法和操作技术。,实验原理,带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象，称为电泳。带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。是生化与分子生物学的重要研究方法之一，可用于样品分离、物质纯度分析和分子量的测定等。,在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一
2、定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。,+,-,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。凝胶是聚丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联而成的，催化剂为过硫酸铵，加速剂为TEMED。,实验原理,实验原理,电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同 所致）浓 缩 效 应,凝胶的不连续性缓冲离子的不连续性 pH的不连续性电位梯度的不连续性,凝胶的不连续性：浓缩胶：大孔径。样品在其中浓缩，并按迁移率递 减的顺序逐渐在其与分离胶
3、的界面上积聚 成薄层。分离胶：小孔径。蛋白质分子在大孔胶中受到的阻 力小，移动速度快，进入小孔胶时遇到的 阻力大，迁移速度减慢。由于凝胶的不连 续性，在大孔胶和小孔胶界面处就会使样 品浓缩，区带变窄。,浓缩效应,缓冲离子的不连续性 pH的不连续性 电位梯度的不连续性 制胶缓冲液：Tris-HCl 浓缩胶：pH6.7 分离胶：pH8.9 电泳缓冲液：Tris-甘氨酸 在浓缩胶中，pH环境呈弱酸性，甘氨酸解离少，在电场作用下泳动效率低，而Cl却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子介于二者之间泳动。,浓缩效应,由于导电性与电场强度成反比，这一区带形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起
4、，浓缩为一狭窄的区带。样品进入分离胶（pH8.9）后，由于胶中pH的增加，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随Cl-之后，样品不再受离子界面的影响。,浓缩效应,实验仪器、试剂,1垂直板电泳糟2直流稳压电源3微量注射器4电泳仪,实验流程,制板,制备分离胶,制备浓缩胶,加样,电泳及结果检测,染色和脱色,实验步骤,1、安装夹心式垂直板电泳槽：主要注意：安装前，胶条、玻璃板都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。2、制备凝胶板（1）分离胶制备（10%分离胶，20ml/电泳槽）（2）浓缩胶的制备（5%浓缩胶，10ml/电泳槽）,凝胶配方 浓缩胶5%分离胶10%丙烯酰胺储存液ml 1.5 8.4 浓缩胶缓
5、冲液 3.75 分离胶缓冲液 12.5 双蒸水 0.75 2.5%过硫酸铵 0.4 0.5TEMED 1.0 1.5,3.配置血清样品及加样,将样品梳拔出，用电极级冲液冲洗样品孔。样品与样品缓冲液按一定比例混合好（蛋白含量大约为1-2g/l）。用微量注射器加入加样孔，加样量为5-10l。,4.电泳及染色、脱色,电泳：连接直流稳压电源，矮板连负极，打开电源开关。调节电流，进入分离胶之前为100v，进入分离胶之后为120v。染色:关闭电源，取下凝胶模。在脱色摇床上用考马斯亮兰染色1h。脱色：将胶取出，蒸馏水冲洗数次后，放入脱色液中，数小时换液一次，直至背景清晰为止。,实验结果,注意事项,勿用手碰凝胶勿使胶液产生气泡凝胶聚合后勿倒入水池电极缓冲液回收,
