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1、艾滋病实验室检测管理与设备维护,河北省疾病预防控制中心 性病艾滋病预防监测中心赵翠英,HIV抗体检测的目的,监测:以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势而进行的检测，检测的人群包括各类高危人群和一般人群。,诊断:以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况而进行的检测，包括临床检测和自愿咨询检测、术前检测、根据特殊需要进行的体检等。,血液筛查:以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV而进行的检测，包括献血员筛查和原料血浆筛查。,HIV抗体检测的要点,筛查试验阳性不能出阳性报告。严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。严格按照试剂盒说明书操作。注意防止样品间交叉污染。,
2、常规程序初筛-复检-确认复检：对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。,HIV抗体筛查试验流程图,HIV抗体确认试验流程图,一、HIV抗体诊断,临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认两个方面。HIV抗体一般在感染后几周逐渐出现，可延续至终身，是重要诊断依据，但是从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1到3个月，还有一小部分比例的HIV感染者出现迟缓反应，95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内。,常用样品,主要
3、为血液此外还可用唾液检测HIV（Orasure，如Salivacard），尿液检测HIV抗体。,常用方法,酶联免疫吸附试验（ELISA）明胶颗粒凝集试验（PA）斑点免疫试验（或免疫层析）：胶体金或胶体硒,双抗原夹心ELISA试验原理,此类试验比较敏感和特异，可检测血清中的IgA、IgM、IgG抗体。将HIV-1/2混合抗原包被在微孔板底部。“一步法”-实验时加入待检血清和辣根过氧化物酶标记HIV-1/2混合抗原“二步法”-实验时先加入待检血清，温度处理后，再加酶标记HIV-1/2混合抗原,双抗原夹心ELISA试验原理,温度处理后洗涤。待检血清中如有特异性抗体，即将包被抗原和酶标记的抗原桥联在一
4、起，如无抗体，通过洗板而洗去酶标记的混合抗原。加入的底物同被桥联抗原上的酶发生颜色反应，指示抗体存在，如无抗体参与则无显色。实验中设阴性对照和阳性对照。,明胶颗粒凝集试验(PA)原理,以HIV抗原致敏粉红色明胶粒子(载体)。这种致敏载体和血清中HIV抗体相遇被桥联而出现肉眼可见的凝集反应,非致敏的明胶粒子因无抗原参与,则不发生凝集。如果试验中的未致敏粒子对照出现凝集，即提示血清中含非特异性凝集因子，需用未致敏粒子吸附处理，重新做试验。,目前已有HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA试剂（AFD HIV 1/2 PA）和HIV-1、HIV-2抗原分别致敏的PA试剂（AERODIA-HIV-1/
5、2）。前者可用于HIV1/2的筛查，后者可用于区分HIV-1型和HIV-II型。其缺点是判定结果用肉眼观察，无法保存。目前这问题已得到解决，为了保存试验结果，试剂盒可配备数码相机。,雅培Determine（硒标）快速试剂试验原理,雅培Determine HIV1/2快速测试试剂是一种用免疫层析法原理,定性测定血样中HIV1/2抗体。,加样本入反应条，当样品通过硒胶体-抗原结合物时，与硒胶体-抗原结合物混合重组结合，此混合物继续迁移通过固相包被的合成肽和重组抗原的结果窗。如果样品中含有HIV1/2抗体，其抗体将会与硒胶体-抗原结合，并在窗口处被固相包被的合成肽和重组抗原所捕获固定，形成一条红线。
6、如果样品中不含HIV1/2抗体，则无红线形成。为了保证结果有效，在反应条中含有质控条带。,金标快速试剂试验原理,CHEK HIV-1+2（EY）将HIV抗原吸附在基膜上，加入待检标本后,如果标本中有HIV-1或HIV-2抗体，抗体便被吸附在基膜的抗原上，加入P-A金标记溶液，而其Fc部位则和P-A金标记物结合,形成如三明治般的粒子，出现肉眼可见的粉红色圆点。,窗口期和残余危险度,1、窗口期：HIV感染后至抗体检出前的一段时间称为窗口期。2、残余危险度(residue risk)：在目前条件下，筛查后仍具感染性的机率。影响残余危险度的主要因素包括窗口期、试剂质量、实验室质控以及人群感染率等。各国
7、的残余危险度不一，美国1985年是1/2500,随着检测试剂完善，包括“O”亚型的检出、IgM和p24抗原的检测，到1995年降至1/44-66万；据报道非洲为5/1000,泰国1/775,肯尼亚 1/50。,二、艾滋病病毒的抵抗力,HIV抵抗力,HIV一旦离开宿主在外界环境中生存能力便很快消失，HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱，比乙肝病毒（HBV）的抵抗力低得多。因此，对HBV有效的消毒和灭活方法均适用于HIV。,HIV抵抗力-物理因素,HIV对热很敏感，对低温的耐受性强于高温。因此，可以用高温灭活HIV，在低温条件下保存HIV。对紫外线不敏感：用紫外线、射线不能灭活HIV。,
8、HIV抵抗力-物理因素,HIV灭活：美国疾病控制中心证明，在干燥环境中的HIV 浓度在几小时之内降低9099%（即降低12 log）。在室温（2227）液体环境下HIV可存活15天以上；经56处理30分钟，可使HIV在体外对人T淋巴细胞失去感染性，但不能完全灭活血清中的HIV；血清中HIV经过603小时或8030分钟作用后不能检出感染性HIV。目前，世界卫生组织推荐的逆转录病毒灭活方法是10020分钟。,HIV抵抗力-物理因素,HIV保存：在-70不加保存剂冷冻保存，其感染性可丧失。但若在-70保存于35%山梨醇或50%小牛血清（FBS）可存活3 个月以上，在液氮中（-196）HIV可存活数年
9、以上。因此，毒种必须置于液氮中方可长期保存。,HIV抵抗力化学因素,HIV耐碱不耐酸：在pH3.0条件下HIV滴度在10分钟可下降4个对数级，而pH值高达9.0时，HIV滴度下降甚微。对含氯消毒剂敏感。0.5次氯酸、2戊二醛溶液、3碘酒、6过氧化氢可在35分钟内灭活HIV。,实验常用的消毒办法,高压蒸汽灭菌(121 20分钟)干烤 170 2小时煮沸 20分钟消毒剂浸泡30分钟，常用消毒剂为5可用氯(次氯酸钠、次氯酸钾、氯氨T)、6过氧化氢、2戊二醛等。70%酒精1分钟可灭活HIV。,三、HIV实验室检测管理,艾滋病检测工作规范要点,实验室设置 国家艾滋病抗体检测参比中心 艾滋病抗体确证实验室
10、-卫生部批准 艾滋病抗体初筛中心实验室-卫生厅审批 艾滋病抗体初筛实验室-卫生厅审批各级实验室承担相应的任务,确证实验室职责,对初筛实验室人员技术培训对初筛实验室考评或验收对初筛实验室进行年度质控血清考核评估省内所使用的HIV抗体检测试剂省内各级初筛实验室的质控管理艾滋病抗体初筛实验阳性标本的确证向上级部门报告检测工作,艾滋病抗体初筛中心实验室职责,本地区初筛实验室的技术指导和管理本地区初筛实验室人员的技术培训和咨询本地区初筛实验室的质量管理和质量控制对初筛实验可疑阳性或阳性标本的复检承担艾滋病抗体的初筛实验和咨询汇总本地区艾滋病检测结果并上报,初筛实验室的职责,艾滋病抗体初筛实验和检测前后的
11、咨询及时向中心实验室送检初筛实验阳性或可疑阳性标本以及需做确证实验的标本作好本实验室的各项管理，如标本登记、实验记录、安全记录等。按规定向上级报告实验室工作和检测的阶段总结,初筛实验室的基本条件,房屋-清洁区、半污染区、污染区，控温设备-酶标仪、洗扳机、冷藏，微机，高压灭菌器、生物安全柜、洗眼器等人员-3名以上技术人员，含1名中级以上 技术职称。全部须经专业技术培训质量保障措施安全保护措施-环境、个人具备各项规章制度,HIV抗体检测实验室结构示意1,HIV抗体检测实验室结构示意2,HIV抗体检测实验室结构示意3,人员防护的基本装备,隔离衣（一次性）帽子口罩眼镜（依据个人视力配置，不准移出实验室
12、能保护脚面的、便于消毒、清洗的实验室用鞋,生物安全柜,微生物安全柜 microbiological safety cabinet(MSC)生物安全柜biological safety cabinet（BSC）操作危险性微生物时所用的箱形空气净化安全装置，保护使用者和环境不受因为操作产生的有害危险物质和微生物气溶胶的伤害。生物安全柜按防护水平分为I级、II级、III级。,为什么使用生物安全柜,1.生物安全柜主要用于各种微生物,特别是有害微生物的操作和基因工程操作。2.根本目的是保护工作人员健康和柜外环境安全。3.根据保护对象和程度的不同，生物安全柜分为I、II和III级。,生物安全柜的分级,1.
13、I级生物安全柜：保护工作人员和环境。2.II级生物安全柜：保护工作人员、环境和样品。3.III级生物安全柜：采用手套箱更严格地保护工作人员、环境和试样（产品）。,II级生物安全柜分类,1.II级A型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出，无连接法蓝2.II级B1型生物安全柜:30%柜内循环，3.II级B2型生物安全柜:100%空气排出4.II级B3型生物安全柜：70%柜内循环，30%空气排出，有连接法蓝。5.II级A/B3型生物安全柜：兼顾A型和B3型,生物安全柜的选用,1.凡进行有害微生物和转基因操作，均应使用生物安全柜，不可用净化工作台。2.根据工作性质和防护要求，选用适当级别和型号的
14、生物安全柜。3.产品质量。4.售后服务。,微生物防护性能,1.对工作人员的防护性能2.对样品防护性能3.交叉污染防护性能,初筛试剂要求,*HIV1/2混合型*卫生部批准文号*卫生部药政局检定所批批检,并贴有防伪标签*进口初筛试剂要有我国的注册证明*敏感性高、操作简便、价格低廉和相对好的特异性,*常用初筛试剂:酶联免疫吸附试验、凝聚试验、免疫斑点试验等。,艾滋病抗体检测结果的报告,初筛试验结果:*初筛实验室HIV抗体检测的阴性结果，可以出据试验阴性的报告单，并标明所用试剂名称、试剂效期、试验者等内容。可通过咨询通知本人。*初筛HIV抗体阳性，只视为HIV抗体可疑阳性，初筛实验室无权向个人或送检单
15、位报告阳性结果。可出据“HIV抗体待复查”报告。需再次采血送确认实验室作确认试验,艾滋病抗体检测结果的报告,确认试验结果:*阳性结果，只有卫生部批准的HIV抗体确认实验室有资格出据阳性报告，同时按照疫情报告程序和要求呈报有关部门，并经充分分析具体情况决定通知受检者*阴性结果，将阴性结果报给送检单位，可以通知受检者,HIV抗体检测情况报告,艾滋病抗体初筛实验室，每月5日前将上月的检测情况报初筛中心实验室；艾滋病抗体初筛中心实验室，每月10日前将本实验室和辖区内各初筛实验室上月的检测情况汇总后，报省艾滋病确认实验室；统一使用“HIV抗体检测数月报表”，参照全国艾滋病检测技术规范(2004年版)的附
16、表6（由季报改为月报）。,报告方式,首选电子邮件方式：以电子版的形式按时发送到 路新利 收,另外-补充说明,对于“自愿咨询检测月报表”，要求县（区）级疾病控制机构于每月5号前报市级CDC，市级CDC每月10号前报省级CDC。报告方式：首选电子邮件方式：以电子版的形式按时发送到 路新利 收,四、HIV检测实验室常用设备的维护和校准,不同级实验室的必备条件,人员条件 初筛实验室：有3名以上的医技人员，其中中级卫生技术职称人员1名以上，从事病毒血清学检测技术工作2年以上，接受过国家或省级HIV抗体确认中心举办的HIV抗体检测学习班培训，并获得合格证书。,确认实验室：有5名以上的医技人员，其中高级卫生
17、技术职称人员1名以上，中级卫生技术职称人员2名以上；担任确认试验的操作人员，需从事病毒血清学检测技术工作5年以上，HlV抗体筛查工作3年以上，受过国家或省级HIV抗体确认中心举办的HIV抗体确认试验学习班培训，并获得合格证书,设备条件,初筛实验室：有独立的实验用房，污染区和清洁区要分开。包括酶标读数仪和洗板机、精确的移液器、专用的普通冰箱、低温冰箱、离心机以及各种消毒与污物处理设施、安全防护用品和恒温设施。生物安全柜,确认实验室：有单独的实验用房，设清洁区、半污染区和污染区三个区域.包括专用的普通冰箱、低温冰箱、水浴箱、温箱、离心机、酶标读数仪、全自动洗板机、旋转震荡器、摇床、精确的移液器、贮
18、存或分析资料用的专用电脑和必要的摄影器材、必需的消毒和污物处理设施、具有初筛和确认试验所需的安全防护条件和有关设备，以及实验室恒温设施，并要建立血清库。,影响检测质量的一些重要因素,人设备环境,目前HIV检测实验室常用设备,检测设备 酶标读数仪和洗板机、精确的移液器、普通冰箱、低温冰箱、离心机、摇床、水浴箱、成像仪、病毒载量检测和流式细胞仪 安全设备 生物安全柜、高压灭菌器、护眼器,有关设备需关心的问题,选购使用维护、保养检定、校准,设备需配备的档案资料,仪器设备档案的内容应包括：(1)仪器设备产品使用说明书(2)仪器设备验收记录(3)仪器设备检定或校验记录(4)仪器设备检定或检验合格证书(5
19、)使用记录(6)检测前后仪器设备情况记录(7)故障及维修记录,仪器使用登记表,开机、关机时间仪器运行状况检测样品状态及数量使用人,仪器维护登记,维护人员维护项目结果时间,HIV实验室的设备维护,日常维护定期检定和校准,设备对环境的普通要求,电源：电压一定要匹配，插线板合适，专用的.经常停电或电压不稳的实验室，建议配备稳压器和不间断电源环境：清洁，温、湿度合适良好通风长时间不用的设备，注意特别容易坏,酶标仪日常维护-最常用的设备,酶标仪的日常维护,常规维护和保养,使用符合仪器规范要求的电压避免接触仪器的光学部件保持光学系统清洁，以保证正常的功能和结果无误防止液体溅入仪器注意仪器的防尘，不使用时罩
20、上罩子定期对酶标仪进行校准可使用中性实验室清洁剂对仪器的按键和外部进行清洗,洗板机的注意事项,每天操作注意事项：1、每天打开机器后 用蒸馏水进行一至两次的冲洗洗板机内部操作；倒空废液瓶中的废液；检查洗液瓶的洗液是否充足；酶标条在酶标仪板中是否放置水平，不到一排应补足一排；洗板之前，先用所需的洗液对洗板机内的其它液体进行冲洗，避免洗板时液体混用。2、当运行时 随时检查废液瓶中的废液，控制在三分之二以下；随时检查洗液瓶中的洗液，控制在三分之一以上；3、在关机前 用蒸馏水进行一至两次的冲洗洗板机内部操作；倒空废液瓶中的废液；将洗液瓶内的洗液移出，避免结晶；注意防尘。,洗板机的日常维护,请勿将试剂或液
21、体洒在洗板机上！万一不小心将试剂或液体洒在洗板机上，请立即用干布或吸水纸将液体擦干，以防止液体侵蚀仪器表面。日常的仪器表面清洁 日常工作中，请注意保持洗板机表面的清洁。可以使用温和的家庭用清洁剂进行清洁。而酶标板传送系统的周围，请用干布擦拭。警告：请勿使用强腐蚀性或其它清洁力很高的清洁剂。,每天对洗板机的内部清洗 由于洗板用的洗液都包含有盐的缓冲液，容易凝结成晶体（固体）而阻塞洗板机内部的管子或连接处。因此请每天对洗板机进行内部冲洗。不进行工作时，请勿将洗液充满洗板机内部管子很长时间。警告：在长时间不使用洗板机时，请多运行内部冲洗程序几次，以保证在重新使用时洗板机能正常工作。警告：造成洗板机不
22、能正常工作或其精密度降低（如加液不准、洗涤不充分等）的常见原因是洗板机内部结晶问题。因此切记，应经常对洗板机进行内部冲洗。,洗板机的日常维护,洗板机的日常维护,如何清洁洗头造成洗头不能正常工作（如不加液、不吸液等）的原因是洗板机内部的结晶问题。如出现结晶问题，请反复用蒸馏水冲洗管道或使用洗板机自带的维护工具进行清洁维护。,最常用却最易被忽视的常规维护，每天进行用70%的酒精擦拭表面定期校验，六月一次,移液器维护和保养,维护和保养,用70%的酒精经常擦拭用随枪配备的工具拆卸、装配，简单易行,移液器的校准,所有移液器在出厂前均已校准通常不需校准,移液器的校准,通常推荐6月一次需校准的原因-经常使用
23、-要求高的准确性-要高压灭菌-用于移高粘稠性、高密度溶液-温度变化大,厂家校准,两点法校准-在最小量程体积处校准，在最大量程处核对校准证书(包括)型号、管嘴和序列号校准人员、时间、温度有关天平的信息,实验室自行校准,校准设施和测试环境 十万分之一或万分之一的分析天平 蒸馏水或去离子水 无通风房间，温度在20-25C，相对湿度55%以上,实验室自行校准,检查校准 检查移液器的最大和最小容量值（最大值的10%）新管嘴预湿3-5次，对两个容量进行各十次移液测试 计算两组的准确度和精确度，并将结果与说明书所列的限定值范围比对结果在限定范围内为准确，在之外则需用维修工具顺时针或逆时针调节,超低温冰箱注意
24、事项,定期清理箱体内左下角温度传感器，保证传感器不被样品及霜覆盖（建议每月一次）定期清理箱体右上方真空泄压阀（建议每月一次）定期清理密封条（建议每月一次,超低温冰箱注意事项,如需停机长期不用，在关掉主机开关后应同时把电池开关关闭,超低温冰箱注意事项,定期清理灰尘过滤器（建议每月一次）,超低温冰箱注意事项,要求环境温度控制在28度以下空间的清洁稳定的电源供应不宜放得太挤,生物安全柜,HEPA-过滤装置容纳有害生物气体。需提供人员保护也为产品提供保护(按等级而定),二级生物安全柜,II级生物安全柜的细分及特征,HEPA 过滤器带动气流的电机和鼓风机电机/鼓风机速度调节器合适的入气量、管道工作和空气
25、平衡控制器,生物安全柜主要组成部分,生物安全柜的维护,每年检定一次安全柜保持所有操作在窗扇4英寸以内清洁物质和污染物隔离开，减少相互干扰使用后及时清理柜内不宜放太多的物品，不能储藏化学物质,Class II 生物安全柜操作程序,清洁程序,用70%的乙醇或其它消毒剂清洗内部表面避免用强腐蚀性的清洗剂,Class II 生物安全柜操作程序,关机,移去无关物品打开 U.V.灯，照射半小时,离心机的维护,转头、套桶,使用离心机的注意事项,离心力、离心速度平稳的仪器台不用时，松转头；使用时，拧紧转子保持平衡使用安全：盖子要严使用后要擦干或开盖至晾干防止液体泄漏到腔内,高压灭菌器,大部分为立式高压、高温,
26、双扉高压灭菌器,在p3和p4实验室使用,灭菌样品的类别,液体样品：液体、培养基、发酵液等固体体样品：器械、玻璃器皿、有金属或玻璃制成的简单设备、滤器架、发酵罐、塑料等多孔类材料：纺织材料、滤器、加样器和加样器头、注射器（空）等混合材料：液体、固体、多孔类材料等的混合物。对于含水量高的材料，推荐分开灭菌废物/垃圾：该类可能以生物或基因工程材料的方式出现，包括固体、多孔类材料或混合物包装：包裹或未包裹，或放置于金属或塑料的容器中。,生物安全实验室高压灭菌器的验证和再验证,灭菌器的维护,压力表需要定期检验等气压和温度下降到正常后,再开阀高压时,放入指示纸,以便判定灭菌效果,溯源和校准程序,对检验的准
27、确性和有效性有影响的仪器设备必须进行检定和校准。有国家计量检定规程的仪器设备，由法定计量检定机构或经计量行政部门授权的技术机构进行检定；没有国家检定规程的，可以由厂家、自行检定和校准。,每年制订仪器设备周期检定计划。经检定的仪器设备均应按检定或校验结果贴上标志，合格标志为绿色、准用标志为黄色、停用标志为红色。凡检定不合格或超过检定有效期的仪器设备，一律不得用于检验工作。对超过检定期，但暂时不用的仪器设备，贴上停用标志。,计量仪器（量具除外）在两次检定和校验之间，应根据其使用程度及仪器的具体情况安排运行检查。计量负责人负责制定运行检查规程和相关原始记录表。规程应至少包括以下内容：运行检查周期、检
28、查项目及方法、合格判定指标。,所有检定计划、运行检查计划、仪器设备检验规程、运行检查过程及检定证书、测试报告或校验记录、运行检查记录等资料应及时存档。,在实际工作中应当分析检测设备和计量器具对分析测试结果的影响，特别要注意“用于检测的所有设备”和“辅助测量设备”两点。1）如果承担分析检测工作的主要仪器设备对环境有特殊要求，并且该要求会对检测结果有重要影响，则环境检测设备的检定和校准就很重要，如温度计、湿度计、及实验室洁净度检测仪器等。,2）检测结果要可追溯，也就是检测、检定和校准可以链式溯源，必须保证不能断链。不仅大型仪器设备需要定期检定校准，特别要注意小型设备、计量器具、标准物质和标准样品都
29、要有可溯源的校准链。,测量溯源性,ISO/IEC17025（检测和校准实验室认可准则）:1999标准要求“用于检测和（或）校准的所有设备，包括对检测、校准和抽样结果的准确性或有效性有显著影响的辅助测量设备（例如用于测量环境条件的设备），在投入使用前应进行校准”。实验室应制定设备校准的计划和程序。设备检定和校准对分析测试结果有非常重要的影响，大型设备通常都有较完备的计划和程序。,强制检定的工作计量器具目录,HIV检测强制检定仪器：天平、加样器、酶标仪、温度计、水浴箱,在仪器设备档案中应有仪器设备一览表(内容包括仪器设备名称、技术指标、制造厂家、购置日期及保管人等)、仪器设备检定周期表(内容包括仪
30、器设备名称、编号、检定周期、检定单位、最近检定日期、送检负责人等)、仪器设备档案总目录和仪器设备档案借阅记录等。,检定和校准的法律依据,使用强制检定的工作计量器具的单位或者个人，必须按照规定将其使用的强制检定的工作计量器具登记造册，报当地县（市）级人民政府计量行政部门备案，并向其指定的计量检定机构申请周期检定。当地不能检定的，向上一级人民政府计量行政部门指定的计量检定机构申请周期检定。,强制检定的周期，由执行强制检定的计量检定机构根据计量检定规程确定。属于强制检定的工作计量器具，未按照本办法规定申请检定或者经检定不合格的，任何单位或者个人不得使用。,谢 谢！,9、静夜四无邻，荒居旧业贫。23.
31、4.323.4.3Monday,April 3,202310、雨中黄叶树，灯下白头人。11:24:4911:24:4911:244/3/2023 11:24:49 AM11、以我独沈久，愧君相见频。23.4.311:24:4911:24Apr-233-Apr-2312、故人江海别，几度隔山川。11:24:4911:24:4911:24Monday,April 3,202313、乍见翻疑梦，相悲各问年。23.4.323.4.311:24:4911:24:49April 3,202314、他乡生白发，旧国见青山。2023年4月3日星期一上午11时24分49秒11:24:4923.4.315、比不了
32、得就不比，得不到的就不要。2023年4月上午11时24分23.4.311:24April 3,202316、行动出成果，工作出财富。2023年4月3日星期一11时24分49秒11:24:493 April 202317、做前，能够环视四周；做时，你只能或者最好沿着以脚为起点的射线向前。上午11时24分49秒上午11时24分11:24:4923.4.39、没有失败，只有暂时停止成功！。23.4.323.4.3Monday,April 3,202310、很多事情努力了未必有结果，但是不努力却什么改变也没有。11:24:4911:24:4911:244/3/2023 11:24:49 AM11、成功
33、就是日复一日那一点点小小努力的积累。23.4.311:24:4911:24Apr-233-Apr-2312、世间成事，不求其绝对圆满，留一份不足，可得无限完美。11:24:4911:24:4911:24Monday,April 3,202313、不知香积寺，数里入云峰。23.4.323.4.311:24:4911:24:49April 3,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。2023年4月3日星期一上午11时24分49秒11:24:4923.4.315、楚塞三湘接，荆门九派通。2023年4月上午11时24分23.4.311:24April 3,202316、少年十五二
34、十时，步行夺得胡马骑。2023年4月3日星期一11时24分49秒11:24:493 April 202317、空山新雨后，天气晚来秋。上午11时24分49秒上午11时24分11:24:4923.4.39、杨柳散和风，青山澹吾虑。23.4.323.4.3Monday,April 3,202310、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。11:24:4911:24:4911:244/3/2023 11:24:49 AM11、越是没有本领的就越加自命不凡。23.4.311:24:4911:24Apr-233-Apr-2312、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。11:24:4911:24:4911:2
35、4Monday,April 3,202313、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。23.4.323.4.311:24:4911:24:49April 3,202314、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。2023年4月3日星期一上午11时24分49秒11:24:4923.4.315、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。2023年4月上午11时24分23.4.311:24April 3,202316、业余生活要有意义，不要越轨。2023年4月3日星期一11时24分49秒11:24:493 April 202317、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。上午11时24分49秒上午11时24分11:24:4923.4.3,感谢您的下载观看,专家告诉,
