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1、10.2 体细胞无性系变异的来源,10.3 体细胞突变体的筛选方法,10.5 体细胞无性系变异筛选实例,10.4 突变体的鉴定,1,10.1 体细胞无性系变异的基本概念,2,遗传是指上下亲代之间遗传信息的传递。变异是遗传信息在传递过程中发生变化,表现为外观性状的改变。Evolution,Heredity and variation,遗传和变异是生物界普遍存在的生命现象。,10.1 体细胞无性系变异的基本概念,3,遗传变异与后生遗传变异,Genetic variation,Epigengtic variation,变异体（variant)指一些新的细胞或个体表现型出现了变异，但不能确定基因型是否
2、也发生了改变。,遗传变异(genetic variation)指由DNA数量和结构变异造成的，能通过有性繁殖过程而传递的变异。,可遗传的变异就是突变，能产生突变体。,4,后生遗传变异（epigenetic variation)后生遗传变异是指在细胞的发育和分化过程中，由于基因表达调控所发生的变化而引起的表型变异，并不涉及基因结构的变化。这些变化在诱发条件消除以后，也能通过细胞分裂在一定时间内继续存在，但不能通过再生植株的有性生殖传给后代植株，也不能继续表现在由再生植株产生的二次培养物中。,5,6,生理适应变异（physiologic adaptation)是指由某种外界条件存在而引起的生理饰变
3、，一旦这种外界条件不存在时，变异也就自行消失。,突 变（mutation）,指遗传物质（DNA）在一级结构或数量上发生的一种相对稳定的可遗传的变化，最终的结果是基因型的改变，形成突变体（可以是细胞，也可以是完整的个体）。,7,mutant,wild type,野生型是指在自然种群中占绝大多数常被视为正常的基因型或个体。,8,形成多倍体或单倍体,染色体突变,基因突变（核、胞质）,碱基置换、移码、缺失、插入突变，碱基修饰，基因扩增，基因重排，转座子激活，逆转座子的转座等,结构变异,数目变异（最常见）,形成非整倍体,染色体断裂、缺失、易位、倒位、重复、双着丝粒染色体、环状染色体,细胞突变,单基因突变
4、与多基因突变,显性突变与隐性突变,9,整倍体变异：指在正常染色体数（2n）的基础上，体细胞中染色体数目按染色体组（x）成倍数增加或减少的现象。非整倍体变异：在正常染色体数（2n）的基础上，体细胞中的染色体数目增加或减少1条至数条的现象。,10,11,Inversions:ACBDEFDuplications ABCDEEFDeletions:ABCD-FInsertions:ABCDSEFSubstitutions:ATCDEF,Types of point mutations,Types of multisite mutations,体细胞无性系变异（somaclonal variation
5、）指由离体培养条件下获得的培养物或再生植株中所产生的变异。,12,Larkin and Scowcroft(1981)提出,细胞水平的变异与个体或再生植株水平的变异并不完全一致。,注意！,13,Provide a novel source of variability for crop improvement.,The genetic variation occurring in in vitro cultured cells,tissues and plants.,14,体细胞无性系变异的特点在细胞、组织和再生植株水平上都可能发生变异变异频率高变异范围广单基因或少数基因变异较多,适合于对作物
6、或植物的各种性状进行改良,15,植物体细胞无性系变异的应用 1、抗病育种 2、抗非生物胁迫（耐盐、耐铝、耐旱、抗除草剂、抗虫；种子品质改良；外源基因的整合）3、遗传研究 4、发育生物学研究 5、生化代谢途径研究,10.2 体细胞无性系变异的来源,外植体本身是嵌合体,在离体培养中自发产生,16,人为诱变,17,10.2.1 Genetic variation arising from source plant The component cells of the primary explants used to initiate cultures are likely heterogeneous
7、 with respect to the state of differentiation,ploidy level,and age.The callus arising from such a group of cells with diverse genetic makeup will inevitably lead to a mixed population of cells.Plants regenerated from such genetically mosaic callus will undoubtedly be of different genetic makeup.,18,
8、Genetic Variation arising during culture(naturally occurring),10.2.2 在离体培养中自发产生,离体培养条件下的自发变异要远远高于活体或植株水平。,培养物在培养、继代、分化过程中，由于生理状态的差异、培养条件或其它外界条件的影响造成较高的变异频率。,19,引起自发变异的因素当植物的组织和细胞脱离有机体，进入离体培养的环境中，细胞分裂的不规则性显著增加，导致在染色体水平和基因水平的变异。2.遗传物质结构 在离体条件下不稳定（基因组结构发生变异，核DNA与细胞质DNA都存在变异热点，会发生基因重组和碱基的插入与缺失等）,20,3.使用
9、植物生长调节剂（特别是一些人工合成的生长素类物质，如2，4-D，被认为是 引起离体变异的主要来源）4.培养基中的其它组分（例如磷和氮的含量与形态，MgCl2的含量等）5.培养条件（温度、光照等）,后生遗传变异频率增加（常常由于基因复制、DNA甲基化、转座元件的激活。),转座因子的活化（transposible elements)转座子（Transposons)逆转座子（Retrotransposons）转座子就是DNA转座因子，例如玉米Ac因子、Ds因子、Spm因子、Mu因子和金鱼草的Tam因子。能够在转座酶的作用下从DNA 的一个位置脱离，然后在DNA的另一个位置整合，达到转座的目的。许多不
10、稳定的突变就是由这类因子的作用引起的。,21,用转座子可以解释无性系变异的发生特点：可以解释为什么有时无性系变异频率会很高，达到百分之几几十。高等植物中已经发现10余种转座子，可以造成基因表达的广泛变化。2.转座子使不活动的结构基因活化，可以解释显性基因的突变。3.转座子使多拷贝基因中那些不表达的拷贝活化，提高基因表达的强度，造成基因放大。,22,23,在玉米的再生植株中，发现Ac因子有3%的转座活性，而在原始植株中Ac是没有活性的。在苜蓿再生植株中也观察到由转座子活化所引起的花色变异。,逆转座子的转座需要通过RNA为中介,24,通过DNA转录为RNA后,再经逆转录成为cDNA，并插入到基因组
11、的新位点上的因子。,逆转座子是植物中主要的转座因子，在植物中的拷贝数一般会比转座子高。已经有许多受逆境（如组织培养，病毒侵染等）激活的逆转座子被分离。,在水稻中已经发现20种不活化的逆转座子，已经证明其中的3种在组织培养中被激活。水稻组织培养中，逆转座子Tos17的9个插入位点中至少有5个是基因的编码区，导致所在基因的变异。,25,26,10.2.3 人为诱变,诱发突变会进一步提高变异频率,Physical mutagensChemical mutagensBiology mutagens,Mutagenic effects of radiation on plants has been kn
12、own since the 1920s，still used today to generate variation in crop cultivars.,27,物理诱变,紫外线电离辐射（x-ray,-ray,激光，低能离子束，宇宙射线等）,化学诱变剂,烷化剂,叠氮化合物,DES（硫酸二乙酯）,碱基类似物,5-溴尿嘧啶（5-Bu）,5溴脱氧尿嘧啶（5-BudR）,叠氮化钠（NaN3）,亚硝基胍(CH5N5),EMS（甲基黄酸乙酯）,MMS（甲基黄酸甲酯）,EES（乙基黄酸乙酯）,马来酰肼、重氮丝氨酸、丝裂霉素C、链霉素、亚硝酸钠等,2-氨基嘌呤（2-AP）,5-氟尿嘧啶(5-FU),28,5-
13、溴尿嘧啶核苷(5-BudR),29,甲基璜酸甲酯（MMS),甲基璜酸乙酯（EMS),5-溴尿嘧啶（5-Bu),30,5溴尿嘧啶(5BU)、5氟尿嘧啶(5FU)、2氨基腺嘌呤(2AP),由于其结构与正常的碱基相似，进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成。,31,32,生物学方法,1.花粉植株的无性系变异,2.胚胎挽救3.原生质体融合（离体受精）,4.农杆菌介导的基因重组,5.T-DNA插入建立突变体库,花粉植株的无性系变异 花粉植株可以从游离的花粉或花药离体培养获得。从理论上讲，花粉植株应为单倍体，但实际上许多植物的花粉植株中有一部分染色体数目发生变化，主要是染色体倍性的增
14、加，包括二倍体、多倍体和混倍体。,33,1973 Cohen&BoyerThe Gene Pool becomes a Gene OceanAny organism on earth is a source for genes for use by breedersRecombinant DNA Technology is one of the most powerful tools ever invented.,34,Gene Splicing,T-DNA插入突变体库,农杆菌介导的遗传转化能够把T-DNA序列随机地、稳定地整合（插入）到植物基因组中。如果插入位点是一个功能基因，就能造成基因的
15、插入突变，在整个基因组中，就有可能使所有的插入基因都被破坏。,Electron micrograph of Agrobacterium tumefaciens infecting plant cell University College Worcester,UK,36,37,离体条件下，可以通过自发变异与人工诱变获得大量的突变个体，但只有通过认真地筛选才能获得可以利用的新的种质资源。,10.3 植物离体培养物突变体的筛选 Selection of variants in culture,38,体细胞突变体的筛选 指通过不同手段，从体细胞无性系变异中筛选出优良的可供人们利用的个体或品系。,体细
16、胞突变体筛选的方法,再生植株水平上的选择 可以直接通过田间实验筛选我们所需要的农艺性状，如早熟，品质好，丰产，花瓣、子粒色泽等，缺点是周期长，效率低。,细胞或组织水平上的选择 在培养基中加入选择压力直接选出突变体，适于抗性突变体的筛选。,39,选择时应考虑以下方面,所选的性状是单基因还是多基因控制；能否保证细胞水平与整株水平的一致，能否稳定遗传；除突变性状外，能否保持母体其它优良性状.,40,细胞水平或组织水平的筛选,直接选择法,外植体水平上进行选择，再通过离体培养获得突变体,间接选择法,负接择系统,正选择系统,一步选择法,多步选择法,41,直接选择法 在一定的选择压力下，使新的突变型能优先生
17、长，或使突变体能与野生型明显区别开，从而把突变体分离出来。,间接选择法 借助与突变型有某种相关的特性作为间接选择指标的筛选方法 用病菌毒素类似物可以选择抗病植株。,42,43,直接选择法,负接择系统,正选择系统,一步选择法,多步选择法,正选择系统 在培养基中加入某种对正常细胞有毒的化学物质，突变细胞能正常优先生长，野生型细胞不能生长或生长受到抑制，从而把突变体筛选出来的方法。一般用于筛选抗性突变体。,44,一步选择法 如果加入培养基的选择剂的剂量较高，可以一次性地抑制或杀死所需突变体以外的其他细胞，适用于单基因控制的性状。多步选择法 若开始时加入培养基的选择剂剂量较低，然后依次增加选择剂的浓度
18、，进行第二轮、第三轮的筛选，最后得到抗性细胞。适用于选择遗传背景不清或是多基因控制的性状。,45,负选择法：用特定的培养基使突变体细胞处于不能生长状态，而正常型的野生型 细胞则可以正常生长，然后用一种能促使生长中的细胞中毒死亡的选择剂淘汰这些细胞，最后使突变细胞恢复生长并分离出来。,主要用于分离营养缺陷型突变体和温度敏感型突变体。,46,温度敏感型突变体的筛选,一般植物细胞生长温度是2030，温度敏感型突变体是放在高温28 下不长，而在低温下23 生长的生长的突变体。,将诱变处理过的细胞群放在28，正常细胞生长，突变体不长,28 下用5-BUdR处理12天，杀死活细胞,放在23 低温下进行光照
19、,选出能生长的细胞即所要筛选的低温突变体.,47,R1 代的田间观察,再生植株水平的选择,从愈伤组织再生的植株叫做R1代。田间生长的R1代植株少数会出现形态学上的或农艺性状上的变异，这些变异主要是由染色体变异或显性基因突变引起的，那些由隐性基因突变引起的变异要等到R2代才会表现出来。R1代植株需要分株留种，以便在R2代观察隐性性状的变异和统计突变性状的分离。,48,在R2代选择有用变异株,R2代选出的变异株经过23代的自交，在R4或R5代即可获得稳定的株系。,在R2代的各类变异，包括显性和隐性变异都得到充分显现，就可以在田间选择具有优良农艺性状的变异株。,49,10.4 突变体的鉴定,为了区别
20、可遗传变异与后生遗传变异，消除适应性变化，需要对得到的突变体进一步鉴定。,50,突变体鉴定的原则,1.变异性状能否通过再生植株有性传递；,2.突变体发生的频率一般较低；,3.突变体不仅在含有选择压力的培养基上始终保持抗性，在无选择压力的培养基上继代培养多代后性状不消失；,4.由再生植株所产生的次生愈伤组织培养物应当表现出同样的性状.,51,突变体鉴定的方法形态鉴定细胞学鉴定分子生物学鉴定（DNA是否突变）,52,10.5 体细胞无性系变异筛选实例,抗病性突变体选择,抗除草剂突变体的选择,抗逆性突变体的选择（耐盐，耐旱，抗重金属离子，耐高温、低温突变体等）,53,营养缺陷型突变体的选择,抗病性突
21、变体选择,可以利用植物病原菌、病原菌毒素或毒素类似物以及病菌培养物的有毒滤液等筛选植物抗病突变体。,54,现在，已经筛选出了烟草抗野火病、烟草抗黑径病、马铃薯抗晚疫病、番茄抗早疫病、油菜抗黑径病、玉米抗小斑病、水稻抗稻瘟病、小麦抗根腐病、小麦抗赤霉病等多种抗病突变体。,小麦抗赤霉病突变体筛选路线,外植体(小孢子、花药、幼胚),愈伤组织继代培养（毒素含量逐渐增加）,离体培养（赤霉菌毒素处理）,分化培养（毒素处理）,再生植株抗性鉴定（接种处理）,抗病突变体（抗病鉴定）,抗病新种质,理化诱变,离体筛选,离体筛选,幼苗筛选,田间筛选,田间筛选,55,含有病菌粗毒素培养基的制备 将病菌接种在MS液体培养
22、基上，黑暗28培养2周，过滤，将滤液pH值调到5.8，然后过滤灭菌，即得到粗毒素原液。用粗毒素原液与等体积的水混合配制的固体MS培养基就是筛选培养基。,56,抗盐性 抗旱性,抗非生物胁迫突变体的筛选,对高浓度铝的抗性 我国南方酸性土壤中，对植物危害的主要因子是由于在低pH情况下，存在大量的游离铝离子及锰离子，会引起细胞生理性毒害。这种研究已在番茄、胡萝卜上获得了初步成功，从抗铝愈伤组织分化成的植株，其自花受粉获得种子的后代仍有抗性。,57,小麦耐盐突变体筛选,将小孢子处于单核中、晚期的小麦穗以60 Co-射线诱变,取出花药接种在含有0.3%NaCl的愈伤组织诱导培养基上，用不含盐的培养基做对照,将含盐培养基上的愈伤组织转接到去盐培养基上继代13次,58,再转接到含0.3%NaCl的分化培养基上分化成苗，并以不含盐的分化培养基做对照,将分化植株转移到含盐土壤中再次检测耐盐性,用秋水仙素溶液进行染色体加倍处理，并进行遗传稳定性鉴定,获得具有耐盐性、农艺性状好、且能稳定遗传的新品系,连续进行3个世代的选择,59,60,本章要点：体细胞无性系变异的基本概念与来源 体细胞无性系变异在细胞水平上的选择方法,
