自考生物技术制药(复习整理).doc

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1、1. 现代生物技术包括?2. 现代生物技术的发展趋势?3. 新型生物反应器?4. 生物技术药物分类5. 生物技术药物的特点6. 生物技术在制药中的应用7. 基因的概念与特性8. DNA的复制与表达9. 基因工程制药 医用活性蛋白和多肽类10. 基因工程技术生产药品的优点11. 基因工程药物生产的过程12. 目的基因的获得、克隆真核基因常用方法13. 人工化学合成基因的限制14. 基因筛选的新方法、对已发现基因的改造15. 最佳的基因表达体系16. 适合目的基因表达的宿主细胞应满足哪些要求17. 大肠杆菌中的基因表达18. 原核细胞的基因组特点19. 基因克隆载体的定义、特点20. 质粒的分类2

2、1. 真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件22. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素23. 基因工程菌生长代谢的特点（菌体的生长与能量、前体供应的关系）24. 基因工程菌的不稳定性（质粒、分裂、结构不稳定）、其主要机制25. 常见分裂不稳定的两个因素、提高质粒稳定性的方法26. 基因工程菌的培养方式27. 影响发酵的因素有28. 高密度发酵特点、影响因素29. 实现高密度发酵的方法30. 基因工程药物的分离纯化31. 分离纯化的方法、基本原理32. 分离纯化工艺应遵循的原则33. 基因工程药物的质量控制、保存34. 动物细胞的形态、生理特点35. 动物细胞来源的药物的种类36. 动物细胞的

3、培养条件、培养基37. 动物细胞大规模培养的方法、特点、培养方式38. 动物细胞生物反应器的类型、理想反应器的基本要求39. 动物细胞产品纯化方法、动物细胞制药的前景40. 单克隆抗体及其制备41. 基因工程抗体及其制备42. 噬菌体抗体库技术的基本方法、特点43. 基因工程抗体表达44. 抗体诊断试剂的类型45. 抗体治疗药物的种类46. 植物组织和器官的培养47. 次级代谢产物特点、作用48. 植物细胞培养的培养基的组成、固定化反应器49. 影响植物次级代谢产物生产和累积的因素50. 植物细胞大规模培养生物反应器的类型、性能比较51. 植物细胞固定化培养优缺点52. 植物细胞大规模培养程序

4、53. 植物生物反应器选择标准54. 植物细胞制药的进展与展望55. 酶的特点、来源56. 酶工程的研究内容57. 利用微生物生产酶制剂的优点58. 固定化酶的特点59. 酶和细胞固定化方法与制备技术60. 固定化细胞的特点61. 固定化细胞反应器的类型和特点62. 模拟酶的的概念及分类63. 酶的化学修饰的目的和意义64. 酶化学修饰的方法65. 修饰酶的特性66. 酶化学修饰的应用及其局限性67. 酶的化学修饰的前景68. 有机相酶反应的优点、有机溶剂、影响69. 酶工程优点70. 发酵工程的研究内容71. 优良菌种的选育72. 诱变育种的方法和原理73. 营养缺陷型的作用74. 发酵类型

5、、特点75. 发酵工艺控制76. 细胞破碎的方法及其优缺点77. 理想的微生物细胞生物反应器基本要求78. 基因工程在发酵工程中的应用79. 基因工程菌的遗传不稳定性的两种主要表现形式是什么? 主要机制是什么 ?80. 在人胰岛素AB链分别表达法中,为何将AB链编码序列与b-半乳糖苷酶基因融合？81. 阐述基因工程药物研制有那些主要过程？82. 对鼠源性单克隆抗体进行改造的目的是什么？鼠源性单克隆抗体改造后的小分子抗体类型？83. 抗体治疗药物有哪些？1.现代生物技术包括:重组DNA技术细胞和原生质体融合技术酶和细胞的固定化技术植物脱毒和快速繁殖技术动物和植物细胞的大量培养技术动物胚胎工程技术

6、现代微生物发酵技术现代生物反应工程和分离工程技术蛋白质工程技术海洋生物技术2现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面：基因操作技术日新月异，不断完善。新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。转基因植物和动物取得重大突破现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向，基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。蛋白质工程是基因工程的发

7、展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来，形成一门高度综合的学科。信息技术的飞跃发展渗透到生命科学领域中，形成形成引人注目、用途广泛的生物信息学。3新型生物反应器有:1.气升式生物反应器2.流化床式生物反应器3.固定床式生物反应器4.袋式或膜式生物反应器5.中空纤维生物反应器4.生物技术药物分类1.重组DNA技术制造的多肽、蛋白类药物2.基因药物，包括基因治疗药、基因疫苗、反义药物、核酶3.来自动、植物、微生物的天然药物4.合成与半合成的生物药物 按照医学用途分类：1.治疗药物，治疗疾病是生物药物的主要功能。2.诊断药物，具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。3.预防药物，对于许多传

8、染性疾病来说，预防比治疗更重要。5.生物技术药物的特性 1.分子结构复杂2.具有种属特异性3.治疗针对性强，疗效高4.稳定性差5.基因稳定性6.免疫原性7.体内t1/2短8.受体效应9.多效性和网络性效应10.检验的特殊性6.生物技术在制药中的应用（1）基因工程药物品种的开发；（2）基因工程疫苗；（3）基因工程抗体；（4）基因诊断与基因治疗；（5）应用基因工程技术建立新药的筛选模型；（6）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物；（7）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用；（8）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。7.基因的概念与特性 概念:DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,

9、是遗传物质的最小功能单位。特性：基因可自我复制，基因决定蛋白质结构，基因可突变。 基因按功能分为：结构基因 调控基因 DNA的结构与性能DNA的结构：四种核苷酸（A T C G）连接一级结构、DNA二级结构（，），双螺旋结构。DNA的性质与功能:吸收光谱260电场中泳动变性、复性、杂交8.DNA的复制与表达 基因表达转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。2.翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程。(1)分为三个阶段：起始延长终止(2)翻译后的肽链加工:羟基化糖基化磷酸化乙酰化9.基因工程制药 医用活性蛋白和多肽类包括：免役

10、性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。激素，如胰岛素、生长激素、心钠素。酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物岐化酶等。10.基因工程技术生产药品的优点1.利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用建立有效的保障。 2.可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。 3.利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。 4.内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过

11、基因工程和蛋白质工程进行改造。 5.利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。11.基因工程药物生产的过程（步骤）目的基因的克隆构建DAN重组体DAN重组体转入宿主菌构建工程菌工程菌发酵表达产物的分离纯化产品的检验等基因工程药物制药的主要程序获得目的基因组建重组质粒构建工程菌（或细胞）培养工程菌 产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装12.目的基因的获得 克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。逆转录法 ：逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 mRNA的纯化 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA的克

12、隆 将重组体导入宿主细胞： cDNA文库的鉴定：抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法 目的cDNA克隆的分离和鉴定：核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法化学合成法 ：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。再按相应的密码子推导出DNA的核甘酸序列。用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。13.人工化学合成基因的限制有： 不能合成太长的基因 目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 5

13、060 bp，因此只适用于克隆小分子肽的基因。遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。费用高。14.基因筛选的新方法1.编码序列富集法2.岛屿获救PCR法3.动物杂交法4.功能克隆法5.构建cDNA文库6.差异显示技术的应用 对已发现基因的改造应用基因修饰技术和点突变技术提高目的基因表达产物的稳定性、t1/2、提高表达量，降低毒性或免疫原性。15.最佳的基因表达体系：;目的基因的表达产量高;表达产物稳定;生物活性高和表达产物容易分离纯化16.宿主细胞的选择 适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:1.容易获得较高浓度的细

14、胞；2.能利用易得廉价原料；3.不致病、不产生内毒素；4.发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5容易进行代谢调控；6.容易进行DNA重组技术操作；7.产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。17.大肠杆菌中的基因表达 载体：是基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载体把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。 基因工程载体分为：克隆载体,转录载体,表达载体;DNA(克隆载体）DNA(转录载体）RNA蛋白质（表达载体）18.原核细胞的基因组特点：染色质为环状双股DNA分子 具有操纵子结构 结构基因多为单拷贝 特定区域分布特异DNA顺序

15、，因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段19.基因克隆载体定义：基因克隆载体是一类能够承载外源基因并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子。2）目前经常使用的载体，有质粒和病毒两类。各种不同的载体，尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异，但是作为载体，它们应该具备一些共同的特性。 特点：具有复制子有单一限制内切酶切位点或多克隆位点有选择性遗传标记如抗药基因拷贝数高生物安全性好20.质粒的分类 按复制型式严紧型 松弛型 按基因转移性传递性质粒 非传递性质粒 按遗传性状产物分类:抗生素抗性限制酶、修饰酶系统21.真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件载体能够独立复制。

16、载体本身是一个复制子，具有复制起点。应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。22.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的拷贝数：外源基因是克隆到载体上的，因此载体在宿主菌种的拷贝数就直接关系到外源基因的拷贝数。外源基因的表达效率启动子的强弱核糖体接合位点的有效性SD序列和起始密码ATG的间距密码子组成表达产物的稳

17、定性：组建融合基因，产生融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌，有可能减弱表达产物的降解。细胞代谢负荷：工程菌的培养条件：外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关，必须优化基因工程菌的培养条件，进一步提高基因表达水平。23.基因工程菌生长代谢的特点 菌体的生长与能量的关系 碳源物质是组成培养基的主要成分。碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时

18、，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。提高pH，可减少乙酸的抑制作用。分批培养中选择不同的碳源，连续培养中控制稀释速率等都能一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生，减少它的抑制作用。加入甲硫氨酸和酵母提取物都能减少乙酸的产生。大肠杆菌中克隆携带氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌体生长速率。采用磷酸乙酰化酶缺陷株作为宿主细胞，阻止乙酸产生，可提高产量。 菌体生长与前体供应的关系 在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。质粒存在对菌体代谢的影响：中等拷贝质粒

19、（56拷贝）的工程菌中与前体合成有关的酶增加，这些酶的基因大多受终产物的反馈调节。如：三羧酸循环关键酶、天冬氨酸转酰基酶等。高拷贝质粒的工程菌（240拷贝）中，生长速率和菌体总蛋白合成均减少。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。“严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。24.基因工程菌的不稳定性、主要机制 质粒不稳定:基因工程菌在传代（25代以上）过程中常出现的现象。分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 产生机制：1受体细

20、胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解。2外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢。3重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配，这是重组质粒逃逸的基本原因。4受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排。25.常见分裂不稳定的两个因素：含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（质粒丢失率）；这两种菌（含质粒菌和不含质粒菌）比生长速率差异的大小。 提高质粒稳定性的方法1.合适的宿主：宿主菌2.合适的载体:质粒拷贝数3.选择压力：抗生素4.分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度； 再诱导外源基因的表达5.控制培养条件：温度、pH值、培养基组分、溶氧6.固定化：卡拉胶26.基因工程菌的培养方式

21、：1分批培养；2补料分批培养；3连续培养；4透析培养；5固定化培养27.影响发酵的因素有：培养基接种量温度溶解氧诱导时机诱导表达程序7.pH 28.高密度发酵特点 ：菌体高密度，总表达量高；生物反应器体积小；单位体积生产能力高；生产周期短，分离成本小 影响因素1.培养基：C源、N源种类和含量；C:N含量比值；微量元素；无机盐（磷影响表达质粒的复制速率）2.溶氧浓度：空气分离系统提高氧分压；透明颤菌血红蛋白基因克隆到菌体中，提高氧传质能力；菌体与小球藻混合培养，藻细胞光合作用产氧供菌体呼吸。3.pH值：大肠杆菌产酸、CO2必须加碱调节pH值4.温度：控制菌体生长，温控诱导表达（诱导时机和持续时间

22、，对数生长期，2min）5.代谢副产物： C源物质供应超过三羧酸循环或电子传递链能力，产生乙酸，抑制菌体生长和蛋白表达。采取流加补料法，或加入甘氨酸、甲硫氨酸抑制乙酸生成。29.实现高密度发酵的方法 1.发酵条件的改进（1）培养基的选择：（2）建立流加式培养方式；（3）提高供氧能力2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻断乙酸生产的主要途径：（2）对碳代谢流进行分流：（3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流；（4）引入血红蛋白基因。3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌30.基因工程药物的分离纯化 一.细胞破碎1.物理破碎法（1）高压匀浆法（2）高速珠磨法（3）超声破碎法（4）高压挤压法2.化学破

23、碎法（1）渗透冲击（2）增溶法（3）脂溶法3.生物破碎法：酶溶法二.固液分离1.离心沉淀法2.膜过滤法3.双水相萃取 三、重组蛋白的分离纯化技术技术条件温和能保持产物生物活性。选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。收率要高。两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理。纯化过程要快，满足高生产率的要求。目的产物的分离纯化 蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。31.分离纯化的方法：色谱分离方法 离子交换层析（ IEC）离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作

24、容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。反相色谱和疏水色谱反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。疏水层析的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。亲和层析（AC）是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附。配基：在亲和层析中起可逆性

25、结合的特异性物质。载体：与配基结合的支撑物。亲和层析可分三步：配基固定化吸附目的物样品解吸凝胶过滤层析凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。主要应用两个方面：脱盐和更换缓冲液蛋白质分子的分级分离。在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。32.分离纯化工艺应遵循以下原则：具有良好的稳定性和重复性尽可能减少组成工艺的步骤各技术步骤间要相互适应和协调工艺过程中尽可能少用试剂工艺所用

26、时间要短工艺和技术必须收率高、易操作、能耗低具有较高的安全性33.基因工程药物的质量控制 产品的鉴定、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。产品的保存液态保存低温保存在稳定pH条件下保存高浓度保存加保护剂保存固态保存：冷冻干燥（预冻、升华、解吸干燥去除吸附水）34.动物细胞的形态和生理特点 离体培养细胞类型贴壁细胞生长须有贴附的支持物表面，自身分泌或培养基 中提供的粘附因子才能在该表面上生长。两种形态： 成纤维细胞型（来源于中胚层组织的细胞）；上皮细胞型（来源于内、外胚层组织的细胞）悬浮细胞生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。兼性贴壁细胞生长不严格依赖支持物。 动物细胞的

27、生理特点（） 动物细胞的分裂周期长：（）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。（）正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。（4)动物细胞对周围环境十分敏感：对理化因素敏感，()动物细胞对培养基要求高：必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。()动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。35.动物细胞来源的药物的种类() 动物细胞多肽与蛋白质类药物()动物酶与辅酶类药物()动物核酸类药物()动物糖类药物：()动物脂类药物动物细胞生产的药物特点优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰蛋白糖基化，与天然产品一致。缺点:培养条件高、成本贵、产量低，安全性问题。36.动物细胞

28、的培养条件和培养基细胞体外培养基本条件:无菌营养充足,防止有害物质氧气随时清除代谢有害物质良好的生存外环境：pH、渗透压、离子浓度及时分种，适当的细胞密度动物细胞的培养基的种类和组成天然培养基：血清、羊水、腹水等。成分复杂、成分不稳定，来源少。2.合成培养基（常用培养基成分及配方）氨基酸 维生素 糖类 无机盐 其它成分添加小牛血清的作用提供生长因子和激素提供贴附因子和伸展因子提供结合蛋白（识别离子、激素、维生素、脂质）提供必需脂肪酸和微量元素3. 无血清培养基优点：提高重复性（细胞）减少微生物污染（病毒）供应充足稳定细胞产品易纯化避免血清因素对细胞的毒性减少血清中蛋白对生物测定的干扰动物细胞培

29、养的基本方法 细胞分离、细胞计数、细胞传代、细胞的冻存和复苏37.动物细胞大规模培养的方法1.悬浮培养：悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。优点是操作简便，培养条件均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模。缺点是由于细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度一般较低 2.贴壁培养：贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞（贴壁细胞），也适用于兼性贴壁细胞。优点是适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；缺点是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培

30、养条件不均一，传质和传氧较差。3.贴壁-悬浮培养（假悬浮培养）：微载体培养既可创造相当大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，满足了绝大多数细胞的基本要求，载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。 操作方式1.分批式操作2.半连续式操作3.灌流式操作:取出、补充培养基，细胞仍保留在反应器内。优点：1.营养好，代谢废物少。2.细胞密度高（107108个/mL）产量高。3.产品罐内停留时间短。4.培养基比消耗率低。38.动物细胞生物反应器的类型搅拌罐式生物反应器气升式生物反应器中空纤维式生物反应器透析袋或膜式生物反应器固定床或流化床式生物反应器 基

31、本要求1.生物反应器的材料无毒2.生物反应器的结构：满足传质、传热、混合的功能3.密封良好，避免污染4.自动检测、调节控制精度高5.长期连续运转 6.容器内表面光滑，无死角7.拆装、连接、清洁方便，能耐高压蒸汽消毒8.设备成本低39.动物细胞产品纯化方法1.离心2.离子交换层析3.凝胶过滤4.亲和层析5.盐析和有机溶剂沉淀6.透析7.高压液相层析 动物细胞制药的前景（一)、改进表达载体，提高表达水平和产量 (二)、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本 (三)、抑制细胞凋亡，延长培养周期( 四)、采用糖基化工程，提高产品质量 (五) 转基因动物的研究 （六）、组织工程的研究 单克隆抗体具有高

32、度特异性、均一性、来源稳定、可大量生产等特点，40.单克隆抗体及其制备 制备单克隆抗体（McAb）是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。 抗原与动物免疫 制备特定抗原的单克隆抗体，首先要制备用于免疫的适当抗原，再用抗原进行动物免疫。有的抗原可以用化学合成：地高辛。多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。为使杂交瘤细胞稳定，采用免疫动物和骨髓瘤细胞供体同一品系动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫动物也采用相应的品系。41.基因工程抗体及其制备杂交瘤单抗为鼠源性，应用人体

33、产生人抗鼠抗体及毒副作用。对鼠源性的单抗进行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相对分子量。人-鼠嵌合抗体、改形抗体 、小分子抗体。基因工程抗体的类型：人鼠嵌合抗体、改形抗体、Fab与Fv抗体、单链抗体、单域抗体和分子识别单位（最小识别单位）42.抗体工程 噬菌体抗体库技术的基本方法 获取目的基因 抗体库技术的载体（噬菌体 phagemid）淘筛 表达与鉴定 特点（）模拟天然全套抗体库（）避开了人工免疫和杂交瘤技术（）可获得高亲和力的人源化抗体43.基因工程抗体表达（）原核细胞表达(融合表达，分泌表达)（）真核细胞表达(分泌表达)（）转基因植物表达（）转基因动物表达44.抗体诊断试剂的类型

34、： 一、血清学鉴定用的抗体类试剂 二、免疫标记技术用的抗体类试剂 三、导向诊断药物 四、CD单克隆抗体系列45.抗体治疗药物的种类：以抗体为载体的导向治疗药物一、放射性同位素标记的抗体治疗药物：抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便，用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。二、抗癌药物偶联的抗体药物：常用的抗癌药物氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性提高二倍。抗体类药物逆转耐药性。3.抗体导向酶-前药疗法（antibody directed enzyme prodrug ther

35、apy,ADEPT）关键是选择适当的活化酶前药对。三、毒素偶联的抗体药物第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。 第二代免疫毒素是利用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。 第三代免疫毒素：重组免疫毒素用基因克隆方法改造毒素基因和小分子抗体基因重组表达。特异性好、稳定性强、渗透性佳、免疫源性低、可大量制备。制备方法：先克隆毒素基因，再利用基因重组技术去除毒素中非特异性细胞结合部位基因。经改造的毒素基因，再与载体基因重组，转入受体菌中表达，形成融合蛋

36、白，再经过纯化就得到重组免疫毒素。46.植物组织和器官的培养 ：植物无菌培养：（1）幼苗及植株的培养（2）愈伤组织培养（外植体，细胞聚集体）（3）悬浮培养（单细胞或小细胞团的液体培养）（4）器官培养（5）胚胎培养 初级代谢产物：核酸、蛋白质、糖类外植体 (脱分化)愈伤组织（再分化）生长点（形态发生）芽、根小植株47.次级代谢产物:1.有明显的分类学区域界限2.其生物合成需要在一定条件下才能发生3.缺乏明确的生理功能4.是生命活动的多余成分主要有：生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素、皂苷类、多元酚类 次级代谢作用是由特异蛋白质调控产生的内源化合物的合成、代谢及分解作用的综合过程。48.植物细胞

37、培养的 培养基的组成（1）无机盐（2）碳源（3）植物生长调节剂（5种天然激素：生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯 ）（4）有机氮源（5）维生素。固定化反应器：网状多孔板；尼龙网套；中空纤维膜 优点：细胞位置固定，易于获得高密度细胞群及维持细胞间理化梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。49.影响植物次级代谢产物生产和累积的因素：1.生物条件：外植体，季节，休眠，分化2.物理条件：温度，光（光照时间，光强，光质），通气（O2），pH和渗透压3.化学条件：无机盐（N,P,K），碳源，植物生长调节剂，维生素，氨基酸，核酸，抗生素，天然物质，前体4.工业培养条件：培养罐

38、类型，通气，搅拌和培养方法50.植物细胞大规模培养生物反应器的类型、及其性能比较 1.机械搅拌式培养系统 ：根据植物细胞的特性，机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的。优点：易于控制温度、 pH、溶氧及营养物质浓度，混合均匀。2.鼓泡塔生物反应器：反应器底部的喷嘴及多孔板实现气体混合分散。优点：适于对剪切敏感的细胞的培养，无运动部件，不易染菌，相对高的热量和质量传递，放大相对容易。缺点：流体流动形式难以确定，混合不匀，缺乏非牛顿流体的流动与传递特性的数据。3.气升式培养系统是最适合培养植物细胞的反应器之一。优点：低剪切力，较好的混合，较高的氧传递效果。无运动部件，不易染菌，

39、操作费用低。缺点:高密度培养时混合不均匀。4.转鼓式生物反应器通过转动促进反应器内氧及营养物的混合。优点：在高密度培养时有高的传氧能力。缺点：放大困难，大规模操作困难。5.固定化细胞生物反应器：指固定在载体（惰性基质）上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。采用固相培养，细胞有一定程度的分化发育，从而刺激调控代谢物合成的基因表达，促进次级代谢产物的产生。方法：吸附法（共价交联，表面固定化，膜固定化）；包埋法（多孔载体，凝胶包埋）；材料：聚氨基甲酸乙酯泡沫，中空纤维素固定化植物细胞培养系统：平床培养系统立体培养系统51.植物细胞固定化培养优缺点：1.可保护细胞免受剪切。2.细胞可长时间重复使用

40、，更换培养基带走代谢物。3.易于实现细胞的高密度培养。4.细胞间接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成。5.减少细胞的遗传不稳定性。6.易于实现连续化操作。缺点：固定化培养的植物细胞其代谢产物必须分泌到细胞外，多数植物细胞次级代谢产物存在于细胞内或分泌到液泡中。52.植物细胞大规模培养程序： 选材： 培养器官、组织的选择：取有药效成分的部位，且该部位较易成愈伤组织。 细胞株系建立：建立悬浮细胞繁殖体系（液体培养）。 大量培养：将选出的优良细胞株扩大繁殖后，可作为细胞工厂化培养的生产“种子”，进行大量培养。 产品提取与纯化：从植物细胞培养物中提取和纯化有用的产品。应用：大规模培养植物细胞；

41、生产有用物质。53.植物生物反应器选择标准供氧能力及气泡分散程度 剪切力大小及对细胞的影响高密度培养时培养液的混合程度 温度、pH及营养物质的控制能力 细胞团大小的控制能力易于放大54.植物细胞制药的进展与展望：诱导子在植物细胞工程研究中的应用 前体饲喂 两相法培养 转基因技术在次级代谢产物生产中的应用 植物生物转化技术与生物制药55.酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。 特点：催化效率高专一性强反应条件温和催化活性受到调节和控制 来源：（1）化学合成法，（2）从微生物中提取分离56.酶工程的研究内容：（1）酶的分离、纯化、大规模生产和应用（2）酶和细胞的固定化及酶反应器

42、的研究（传感器，检测器）（3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究（4）酶的分子改造与修饰，结构与功能的关系的研究（5）.有机相中酶反应的研究（6）酶的抑制剂、激活剂的研究（7）抗体酶、核酸酶的研究（8）.模拟酶及酶分子的人工设计研究57.利用微生物生产酶制剂的优点：1.微生物种类繁多，酶的种类齐全2.生长繁殖快，生产周期短，产量高3.培养方法简单，原料来源丰富，价廉经济效益好4.微生物又较强的适应性，可通过基因工程培育新的高产菌株58.固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。优点：可多次使用。反应后，酶、底物、产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高

43、。反应条件易控制，可实现转化反应的连续化和自动控制。酶的利用效率高。比水溶性酶更适合于多酶反应。缺点：固定化时，酶活力有损失。初始投资较大。只能用于可溶性底物，而且分子量要小。胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。与完整菌体相比不适宜多酶反应，特别时需要辅助因子的反应。59.酶和细胞固定化方法与制备技术 方法：载体结合法、交联发、包埋法、选择性热变性法 制备：吸附法制备固定化酶技术包埋法制备固定化酶技术界面沉降法界面聚合法交联法制备固定化酶技术共价结合法制备固定化酶技术60.固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：无须进行酶的分离纯化保持酶的原始状态，酶回收率高细胞内酶比固

44、定化酶稳定性高细胞内酶辅助因子可自动再生细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应抗污染能力强缺点：利用的仅是胞内酶，酶多副产物多细胞膜、细胞壁和载体都存在扩散限制作用载体形成的空隙大小影响高分子底物的通透性61.固定化细胞反应器的类型和特点间歇式搅拌罐反应器：用于游离酶,反应后随即放料,不回收游离酶。连续流动搅拌罐反应器：连续进料、连续出料 填充床反应器：固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流（活塞流）流形。流化床反应器：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。流速使固定化酶颗粒不下沉又不溢出。循环反应器：部分反应液流出和新加入底物流入液混合

45、，在进入反应床进行循环。连续流动搅拌罐-超滤膜反应器：连续流动搅拌罐的出口处装有超滤膜，产物和未反应的底物可通过，酶被截留反复使用。其它反应器：62.模拟酶的的概念及分类 概念：人造的具有酶性质的催化剂（分子模拟立体结构，化学结构）特点：相对结构简单，高效，高催化性，蛋白质或非蛋白质 分类：1.主-客体酶模型：2.胶束模拟酶 3.肽酶：4.半合成酶：5.印迹酶： 制备过程：1.使蛋白部分变性，扰乱起始蛋白的构象2.使印迹分子与之结合3.用交联剂交联印迹的蛋白质4.透析除去印迹分子63.酶的化学修饰的目的和意义：创造天然酶不具备的优良特性，扩大应用领域。提高生物活性，增加稳定性，扩展底物范围64

46、.酶化学修饰的方法：1.酶的表面化学修饰：（1）大分子修饰。（2）小分子修饰 。（3）交联修饰。（4）固定化修饰。2.酶分子内部修饰 ：非催化活性基团的修饰。蛋白主链的修饰。（3）催化活性基团的修饰（4）与辅助因子有关的修饰：（5）肽链伸展后的修饰：3.结合定点突变的化学修饰。65.修饰酶的特性热稳定性提高 抗各类失活因子能力提高 抗原性消除 体内半衰期延长： 最适pH改变 酶学性质变化 对组织分布能力改变 。66.酶化学修饰的应用及其局限性 1.酶化学修饰的应用（1）酶结构与功能的研究（2）在医药方面的应用（3）在工业方面的应用 2.酶化学修饰的局限性（1）某种修饰剂对某一氨基酸侧链的化学修

47、饰专一性是相对的。（2）化学修饰后酶的构象多少有些改变。（3）酶的化学修饰只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行。（4）化学修饰法可以在酶结构与功能的研究方面提供信息，但是还不 够准确和系统。67.酶的化学修饰的前景1.化学修饰可以改变天然酶各种活性,扩大酶的应用范围。化学修饰法是改造酶分子的有效方法，而且已有了一定的规律性和普遍性，具有广泛的应用前景。2.化学修饰法并不适用于所有的酶，基因工程法，蛋白质工程法，人工模拟法，和某些物理修饰法可弥补不足。68. 1.有机相酶反应的优点：（1）增加疏水性底物或产物的溶解性。（2）热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成（蛋白水解酶）。（3）可抑制有水参与的副反应，如酸酐的水解等。（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。（6）酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大。（7）无微生物污染。（8）能测定某些在水介质中不能测定的常数。（9）固定化酶方法简单，可以只