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1、BSL-2实验室生物安全风险评估一、检验职业感染的现状 经血、呼吸道、粘膜传播疾病直接危害着检验工作者身体健康。我国是HBV感染的高发区,约有1.3亿人携带HBV,HBV表面抗原(HBsAg)的携带率为8%-20%;自90年代以来HCV感染也呈上升趋势,其感染率为3%。目前艾滋病感染在我国的流行已进入增长期。在无偿献血人群中检出乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病等病毒感染占有一定的比例。经调查显示,针头和玻璃碎片是主要锐器致伤因子,经常接触针头者发生锐器伤的危险是不经常接触者的23倍。多种传染病是通过血液传染的,而血液检验中的职业暴露大多数来自实验室工作人员在实验操作和标本采集过程中,意外被带病
2、原体的血液污染破损的皮肤或被病原体感染的针头、血常规采血针、采血玻璃管、吸头等锐器刺破皮肤，呼吸道吸入气溶胶也是传播方式之一。因此,检验人员面临着严峻的职业暴露危险。1.传播途径检验人员感染疾病的一般传染途径有: （1）皮肤破损:带有HIV、HBV、HCV、梅毒等病原体的血液,长时间接触小伤口、溃疡、擦伤等破损皮肤,将会造成机体的感染。（2）穿刺:由于针头、刀片等对皮肤的意外损伤,使带有病毒的全血、血清或血浆进入皮下或循环系统,造成感染。这种针头意外损伤是职业性HBV和HIV感染最重要的原因。带有HIV的针头意外穿刺皮肤后,HIV感染的可能性在0-0.9%之间,平均为0.4%。而对于HBV,这
3、个可能性在6%-30%之间,平均为18%。有学者进行了相应的统计推算,每1000个艾滋病病人,每年会产生1例由于针头意外造成的职业性HIV感染;而每1000个乙肝患者,每年会产生45例类似职业性HBV感染。由于HBV在人群中的感染率比HIV高得多,在一定人群中,每年产生的因针头意外造成的职业性HBV感染比HIV多得多。（3）粘膜:由于试管未封闭、离心意外等造成的血液飞溅,带有病原体的血液与口腔、鼻腔黏膜或眼结膜等接触,可以造成感染。还有被HIV、HBV、HCV、梅毒等病原体污染的电话、仪器、工作台面等接触,也可以造成感染。（4）吸入含病原体的气溶胶引起感染:在采血窗口或发放化验单时,直接与病人
4、面对面接触交谈,易感染呼吸道疾病。此外,能引起气溶胶的操作或事故有离心、溢出或溅洒、混合、混旋、研磨、超声以及开瓶时两个界面的分离等。2.危害因素 （1）血源性危害:调查研究发现,检验人员被针刺伤占第2位。最常见危害较大的职业传染病有以下3种：1）乙型肝炎: HBV是检验人员面临传播危险性最大的血源性疾病,HBV在血液中的浓度可以高达108-109拷贝/ml,检验人员感染率较高。HBV主要传播途径是经血液的传播,病毒携带者血液中HBV的浓度很高,针刺伤时,只需0.004ml，带有HBV的血液足以使受伤者感染HBV。2）丙型肝炎:丙肝病毒(HCV)在血液中的浓度在102-103/ml左右,主要经
5、血液传播,因此通过注射、针刺、含HCV血液污染的伤口和其他密切接触传播。丙型肝炎大多数患者的症状不明显,往往不容易被发现,可表现为流感样症状,有时会造成比HBV更严重的后果。3）艾滋病(AIDS):近年来我国AIDS的流行对检验人员造成了日益严峻的职业性感染威胁。HIV在血液中的浓度通常在100-104拷贝/ml,被HIV污染的锐器刺伤而感染的比率为0.3%。美国疾病控制中心最新资料显示,截止到2000年底美国医护人员中已有57人被确诊感染了HIV,其中实验室技术人员19人。 （2）呼吸道、接触及节肢动物叮咬危害因素病原微生物感染：病原微生物实验室、特别是高致病性病原微生物实验室内操作的任何疏
6、忽、失误都可能造成难以弥补的损失。常见感染：结核分枝杆菌、肠道致病菌等。3防护措施（1）增强检验工作人员的防护意识及防护行为：为了最大限度地减少危害,检验工作人员应主动地从多方面了解关于HBV、HCV、HIV等相关的知识,了解各种病毒的传播方式,使自己知道采取什么样的防护措施。医院和检验科应高度重视,定期加强教育,让检验工作人员都意识到自我防护的重要性,自觉地养成良好的习惯。（2）规范操作程序：各类医疗废物、垃圾必须分类放置,及时消毒后,再由卫生清洁人员取走。特别注意对损伤性医疗废物的及时处理。严格防止感染或致病因子外泄而污染环境。要严格规章制度,养成良好的工作习惯。检验科应制定一套有关卫生防
7、护的规章制度,人人都应自觉遵守。如在实验室内禁止吸烟、吃东西、接听手机;在免疫学检验室和细菌室工作,要戴口罩和手套。防止各种液体飞溅,必需避免手或皮肤直接接触,若有意外污染应及时消毒、冲洗并擦干飞溅出的液体。在离心机停止转动前时,不要打开顶盖,以减少气溶胶的产生。更不要用手去使离心机减速,避免机械损伤的发生。（3）避免锐器损伤,熟练掌握锐利器械的使用：感染性的各种针管、吸管、吸头、试管、玻片等用后及时放在专用容器内;用过的针头不要套回针帽,避免刺伤。锐器损伤后立即挤出伤口处的血液,用肥皂水和流水清洗伤口,2%碘伏消毒后纱布包扎,可套橡皮指套(或橡皮手套),下班前洗手再重新消毒包扎,并准确记录上
8、报,确认损伤器械是否来自有传染性疾病的患者,以使受伤者及时得到监测和治疗。（4）重视手部清洁：院内感染病原体传播最主要媒介是污染的手。戴医用乳胶手套可以为医务人员提供很好的保护。乳胶手套尽管不能避免针头造成的机械损伤,但可以在很大程度上减少皮肤与血液的接触。而且,当针头造成意外损伤后,乳胶手套还可以起到一种阻挡、封闭作用,减少进入伤口的血量,从而降低感染。正确的洗手方法可使手表面的暂居菌减少1000倍,用普通肥皂和清水擦揉15s以上,可清除暂居菌或降低其在皮肤上的密度,搓洗15s,手表面的金黄色葡萄球菌可下降77%,洗2分钟可降低85%;对铜绿假单胞菌效果更好,搓洗12s便可去除92%,洗2分
9、钟可去除97.8%。（5）职业暴露的局部处理：工作中职业暴露后现场急救处理非常重要,若黏膜暴露应用生理盐水或清水反复冲洗干净;皮肤意外接触到血液等污染物,应立即以肥皂和清水冲洗;若被血液污染的针头或仪器等锐器刺伤,对伤口进行轻轻挤压,尽可能挤出损伤处的血液,用肥皂和流水清洗伤口,用70%酒精、0.2%-0.5%过氧乙酸、0.5%碘伏等浸泡或涂抹消毒,并包扎伤口、带手套等,发生意外伤害暴露后要立即进行伤口局部处理,并立即报告预防保健部门,受伤者及患者进行HBV、HCV、HIV和梅毒等检测。依据检测结果尽快采取相应的补救措施,减少职业感染率的发生。二、实验室风险评估目的 风险评估的目的就是确定实验
10、室防护等级，建立生物安全防护机制，配备适当的防护用品，采取相应的防护措施 。评估的范围是科室所有涉及到的病原微生物，以及对化学、物理、辐射、电气、水灾、火灾、自然灾害和噪音等进行风险评估。科室管理机构要统筹安排。评估的结论要十分明确，包括危险程度极低的微生物。可以根据实验室工作特点、仪器使用，打包评估。危害性评估始于实验室设计建造之前，实施于实验活动之中，在使用之后还需进行定期的阶段性再评估。当发生实验室意外，或新发传染病，或严重疫情时，应特别注意要安排此项工作。紧急、意外事故应对方案提供以下操作规范： 1. 防备火灾、洪水、地震和爆炸等自然灾害 2. 意外暴露的处理和污染清除 3. 意外事故
11、发生时的继续操作、人员紧急撤离4. 人员暴露和受伤的紧急医疗处理，如医疗监护、临床处理和流行病学调查。三、风险评估内容（一）生物因子危害评估生物因子（biological agents）概念：可能引起感染、过敏或中毒的所有微小生物体，包括基因修饰的、细胞培养的和寄生于人体的。（1）危害评估内容包括生物因子已知或未知的特性，如生物因子的种类、来源、传染性、传播途径、易感性、潜伏期、剂量效应关系、致病性、变异性、在环境中的稳定性、与其他生物和环境的交互作用、流行病学资料、预防和治疗方案等。（2）制定评估报告：各种因素的风险发生概率程度、针对这些风险采取的预防措施以及风险发生后的补救方法。依据200
12、6年1月11日中华人民共和国卫生部颁布的人间传染的病原微生物名录，对医院检验科可能接触的病原体进行评估。实验室主要实验活动序号实验室活动涉及的病原微生物危害程度分类活动类别生物安全级别7抗酸染色结核分枝杆菌第二类样本检测BSL-211细菌培养鲁氏不动杆菌第三类大量活菌操作BSL-212细菌培养鲍氏不动杆菌第三类大量活菌操作BSL-273细菌培养大肠杆菌第三类大量活菌操作BSL-283细菌培养产酸克雷伯菌第三类大量活菌操作BSL-284细菌培养肺炎克雷伯菌第三类大量活菌操作BSL-290细菌培养摩氏摩根菌第三类大量活菌操作BSL-2107革兰染色淋病奈瑟菌第三类大量活菌操作BSL-2121细菌培
13、养奇异变形菌第三类大量活菌操作BSL-2123细菌培养普通变形菌第三类大量活菌操作BSL-2124细菌培养产碱普罗威登斯菌第三类大量活菌操作BSL-2125细菌培养雷氏普罗威登斯菌第三类大量活菌操作BSL-2126细菌培养铜绿假单胞菌第三类大量活菌操作BSL-2130细菌培养肠沙门菌第三类大量活菌操作BSL-2132细菌培养甲乙丙型副伤寒沙门菌第三类大量活菌操作BSL-2133细菌培养伤寒沙门菌第三类大量活菌操作BSL-2137细菌培养粘质沙雷菌第三类大量活菌操作BSL-2138细菌培养志贺菌属第三类大量活菌操作BSL-2139细菌培养金黄色葡萄球菌第三类大量活菌操作BSL-2142细菌培养肺
14、炎链球菌第三类大量活菌操作BSL-2147抗体检测梅毒螺旋体第三类样本检测BSL-245抗体检测艾滋病毒第二类样本检测BSL-2107抗体检测甲型肝炎病毒第三类样本检测BSL-2108抗体检测乙型肝炎病毒第三类样本检测BSL-21.艾滋病抗体样本检测的风险评估一， 一般生物学特性1.起源1981年6月5日美国亚特兰大市疾病控制中心在当天出版的发病率与死亡率周刊中刊登了一篇只有几页的报告，简要介绍了5位病人的病史。这5个人本来很健康，但他们得了一种十分罕见的威胁生命的疾病。第一位病人是33岁的美国人。他以前很健康，1981年1月突然发烧，再加上干咳，呼吸困难。3月份，他被洛杉矾一家医院接收。医生
15、诊断认为，这种新的流行病是典型的肺炎，是由对健康人没有危险的病原体卡氏肺囊虫引起的。此外，医生肯定，这种病是巨细胞病毒传染的，化验结果是白血球数目减少。尽管用最现代化的方法进行治疗，但这位33岁的美国人仍然于1981年5月3日死了。这5位病人的共同特点是：大约30岁左右，发烧、咳嗽，患卡氏肺囊虫肺炎，被认为是由巨细胞病毒传染的。这种病的最终定名，还得感谢法国里昂的巴斯德研究所。以蒙特尼尔为首的研究小组在过去研究的基础上设想：分离病毒最好的时机不是在病情已深人发展的时候，而是在病之初期，先兆症状刚刚出现之时。接着他们从一患者身上取出淋巴结组织进行培养，并采取有利于病毒繁殖的措施。15天后，漂浮在
16、培养液上层的淋巴结细胞中发现了具有特征的逆转录酶。不久，又在电子显微镜下观察到了这种新病原。1983年5月，他们在科学杂志上报2.基因组及其编码产物HIV呈20面体立体对称球形颗粒3，表面有刺突状结构的糖蛋白，直径约为100nm，分为包膜与核心两部分，包膜以脂质双层结构为框架，gp41蛋白横跨脂质双层，gp41外端连接gp120，包膜下有一层基质蛋白p17，附着脂质双层膜的内层，起稳定作用。病毒的核心呈锥形，核衣壳由核心蛋白p24组成，和其它逆转录病毒基因组一样为二倍体基因，核心内有两条相同的单股RNA链，由氢键将两个RNA分子连接成70sRNA，重要的蛋白质有逆转录酶(p66/51)和整合酶
17、(p34)(见图1)。HIV基因组又称HIV RNA，由约9200个碱基组成，其RNA中含有gag、env 和pol三种结构蛋白的基因以及6种调控基因(tat，vif，vpr，vpu(在HIV-2型为vpx)，nef，rev)。gag基因先编码一个55KD的前体蛋白(p55)然后在蛋白酶作用下裂解形成衣壳蛋白(CA)p24和基质蛋白p17，p24形成病毒蛋白的锥体核。pol基因一部分与gag重叠，表达融合蛋白p160，然后水解成3个片段，从5到3 分别是p11, p66/51和p32。p11是蛋白水解酶，从前体裂解后获得活性，是蛋白酶抑制剂的抗病毒位点，p66/51是逆转录酶，具有逆转录酶、核
18、糖核酸酶H、DNA多聚酶活性，p32是整合酶。env基因编码包膜糖蛋白，先编码一个88KD的蛋白，经糖基化后分子量增至160KD，即包膜糖蛋白的前体gp160，该前体蛋白在蛋白酶作用下，裂解成gp120和gp41。p24、gp120、gp41及p55是HIV免疫学诊断的主要检测抗原。调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成和复制3。tat等6个基因被称为调控基因，分别表达6种蛋白质，对病毒复制起调控作用，它们分别是tat(transactivator)反式激活因子，rev(regulator of expression of virion proteins)毒粒蛋白表达调节因子，nef(nega
19、tive regulatory factor)负调控因子，vpr(viral protein r)病毒r蛋白，vpu(viral protein u)病毒u蛋白，vif(virion infectivity factor)病毒感染因子。3.形态特征HTLV-III的病毒粒子是直径约1000埃（长度单位，0.0000000010厘米）的圆球。粒子外包裹着由两层脂质组成的膜。这种脂质取之于清主细胞的外膜。由糖蛋白（附有糖链的蛋白质）拴住这层膜。每个糖蛋白有两种组分：覆盖着膜的GP41和伸出膜外的GP120。这种由膜和蛋白质组成的被膜包裹着一个由蛋白质P24和P18组成的核。病毒RNA被携带在核内。
20、此外还有逆转录酶的几个挎贝，其功能是催化病毒DNA的装配。4.培养特性以经植物血凝素激活的正常人外周血T淋巴细胞为滋养细胞，与含有HIV的淋巴细胞共同培养，同时加白细胞介素2以支持T细胞的生长，加聚宁胺胶以促使病毒的吸附，加氢化可的松以抑制细胞的免疫反应。这是，HIV便可在培养的细胞内大量繁殖，然后进行病毒检测。5.流行特性不管怎么说艾滋病是20世纪下半叶最严重的一种传染病。至今全世界已有4000多万人感染了艾滋病病毒。至1997年6月30日，全世界艾滋病患者已达1644183名，预计未来10年将超过1亿。目前全球每分钟有11人感染艾滋病病毒。截至1998年9月底，我国感染HIV者为11170
21、人，艾滋病患者338例，死亡184例。实际上感染者已超过30万，预计两年后超过120万二、致病性和感染剂量1、致病性一定量的病毒进入体循环中的淋巴细胞、单核细胞以及周围淋巴结，病毒迅速复制和繁殖，病毒量急剧猛增，每毫升血浆中病毒RNA可达10万至100拷贝（10的5次方-10的6次方拷贝/ML血浆），因此急性期在血清中可以发现相当高水平的HIV抗原，但抗体不能被检测到。大约50%-70%的感染者会出现临床症状，主要表现为发热、皮疹、咽炎、淋巴结肿大、恶心、呕吐、腹泻等症状。这些症状一般都很轻微短暂，持续2-4周左右，经对症处理甚至不经治疗即可恢复正常。随即机体的免疫系统迅速进入战斗状态，产生相
22、应的抗体，由于免疫系统的防卫功能，在短短几个星期内，病毒RNA会降低，降低程度与免疫能力有密切关系，免疫能力越强病毒RNA降低越多，预后越佳。末梢血检查，白细胞总数正常或减少，单核细胞增加。急性HIV感染期后，有一个较长的没有任何临床症状，能够维持正常的免疫状态的时期，即为无症状期，又称临床潜伏期，多为7-10年，平均8年。在潜伏期内，HIV在人体内一直维持着高度复制平衡状态，也就是病毒每天大量产生，但同时也大量的被清除，不断的感染和杀伤T淋巴细胞，也不断的突变来逃避免疫系统的追击，结果HIV感染者身上会整体表现出在长时间的无症状期后，病人可出现不明原因的进行性消瘦，乏力，这个时期感染者开始出
23、现艾滋病相关综合征（ARC）和较轻微的感染，继而发生“机会性感染”，大多数表现为卡氏肺囊虫肺炎或中枢神经系统的感染，这是大多数AIDS病人死亡的直接原因。血浆病毒载量开始上升，CD4+减少速度明显加快。HIV病毒不仅进入淋巴细胞，同样也进入血液循环中的其他细胞，比如单核细胞。同时亦可进入人体各个脏器包括脑、胃肠道、肝、脾、肾及其他部位患者表现出严重的细胞免疫缺陷，发生各种致命的机会性感染和/或恶性肿瘤，CD4+细胞记数200个/L。2.感染剂量主要与感染的途径有关三、感染途径及潜在暴露结果人是唯一的传染源，包括AIDS患者和HIV感染者。人体受HIV病毒感染后直到发病死亡，体内一直携带病毒。感
24、染者的血液、精液、唾液、眼泪、尿、脑脊液、羊水、乳汁、宫颈及阴道分泌物中均能分离到HIV病毒，但在自然传播中起主要作用的是血液、精液和宫颈及阴道分泌物。因此，实验室工作者应穿工作服、戴手套，防止皮肤划伤，并严格按照规程操作，做好自我保护和对污染物的消毒。性接触是主要传播途径，其中男性同性恋的性接触最易感染。美国成年AIDS有63%是同性恋男人，10%是通过异型性生活的男人和女人。在某些地区妓女在AIDS的传播中起主导作用。输注带病毒的血液或血液成分是另一种主要传播途径，使用未经消毒的注射器和针头是静脉注射毒物者中传播AIDS的主要途径。与血液有关的另一种传播方式是器官或骨髓移植。母婴传播是婴幼
25、儿感染HIV的主要方式，可通过血液经胎盘感染、产道羊水感染和哺乳时的母乳感染。到目前为止还没有发现HIV通过空气、食物、饮水、食具或日常生活接触而传播的报道。四、环境中的稳定性HIV能耐受低温而对高温敏感，煮沸可迅速灭活，室温下液体环境中HIV可存活15天，被HIV污染的物品至少3日内有传染性，液体中的HIV加热5610分钟即可灭活。干燥状态下外界蛋白质对HIV有显著保护作用，真空冷冻干燥的血制品加热6872小时才能保证所含HIV被灭活，HIV对甲醛、戊二醛、乙醇、卤族化合物敏感。37时，以下消毒剂处理10分钟，可灭活HIV，常用的消毒剂如70%酒精、10%漂白粉、2%戊二醛、4%福尔马林、3
26、5%异丙醇、0.5%来苏和0.3%过氧化氢等均能灭活病毒。消毒效果受以下因素制约：温度、消毒剂浓度、作用时间、病毒数量、病毒株别、有无其它蛋白质及杂质。HIV对紫外线不敏感五、被操作微生物的浓度和剂量的影响在进行HIV抗体检测时要防止血清污染。六、自然宿主和易感人群非洲丛林中，有人患怪病死去，其症状与那5个人很相似。于是人们把过去50年冷冻保存的叨万份血样进行化验发现：在非洲绿猴的血液里存在一种病毒猴艾滋病病毒，这种病毒与人艾滋病病毒很相似。因而猴艾滋病病毒可能是人艾滋病病毒的祖先。但是绿猴只带毒，不发病。后来人们又在猫、牛体内发现了猫艾滋病病毒和牛艾滋病病毒。因此有人推测艾滋病病毒是由于人与
27、猴在玩耍中不小心被抓伤，猴艾滋病病毒从小小的伤口进人人体，经过变异在人的体内繁殖、生存、传染。当然，这只是一个推测，也有人持不同意见。究竟艾滋病病毒来自哪里，现在还不十分清楚。都是易感人群七、实验动物研究，实验室感染和院内感染信息云南境内的北平顶猴对人类HIV1病毒可感和易感，并不限制HIV-1在细胞内的复制。该发现表明，在现有的灵长类动物中，北平顶猴是较为理想和合适的艾滋病模型动物。八、实验活动评估1.样品采集HIV抗体检测主要采集血液样品，样品采集的工作人员应掌握相关专业知识和操作技能，能有效地防止病原微生物扩散和感染。样品采集过程中，工作人员必须清楚意识到待检样品的潜在感染性，操作时须戴
28、手套（如果采集已知的HIV感染者或病人的样本时，应戴双层手套），提倡使用真空采血器，若使用普通的注射器，采血后，不得用手摘取针头，不得给注射器重新“戴帽”，避免刺伤手。针筒内的血要小心缓慢地沿管壁注入试管内，防止血液外溅。盛有血液的试管必须及时加盖，并放置于稳妥的试管架上，防止倾侧。试管在注入血液前应认真检查试管底、管壁有否裂纹和破损。使用后的真空采血器或普通注射器及止血棉球都含有待检样本的血液，必须立即放入内含消毒液的容器内，按有关要求消毒一定期限后，作为医疗废弃物处理，或放置于生物废弃袋中，在密封的情况下送去作高压灭菌处理。如果因流行病学调查及疾病监测需要，在现场采集样本时必须注意：（1）
29、大面积采血时，尽可能不污染采血现场，工作台面应采用一次性的台布铺垫；（2）受检人员较多时，可能出现较混乱场面，应有工作人员注意维持工作秩序，防止人群弄翻已采好的血液样本；（3）必须备足消毒液，以便对被污染的环境及时有效地进行消毒处理；（4）工作完毕，应该将所有的样本采集的残余物质用一次性台布包裹集中放置于生物废物袋（注意：针头等锐器应放置于耐扎的容器内）带回单位高压灭菌后作无害化处理；（5）离开现场前，对现场进行一次彻底的消毒处理；（6）采集的血液样本要按照有关规定运输回本单位。2、样品转移.单位内部运输 一般单位的采血点与实验室都有一定的距离，可能是在同一楼，或在另一楼内，采好的样本放在规定
30、的容器内送到实验室，不得徒手拿到实验室内。实验室间远程运输 需利用车、船、飞机等交通工具运输的样品，应采用世界卫生组织（WTO）提出的三级包装系统，根据卫生部2005年第45号令可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定的要求，高致病性病原微生物事先应进行规范合适的包装和标记，办妥必要的运输申请手续，方可实施运输。3、样品接收、开启实验室接收样本应在生物安全柜内开启包装件，并检查盛装样品的试管有无破损或渗出的情况，如发现溢漏应立即将存留的样品移出，对被污染的试管、试管架和盛器均需作严格消毒。4、样品分离离心机分离血清 样品在离心前，最好在实验室自然放置1-2h。在离心时，最好使
31、用带有密封离心桶（安全杯）或者密封转头的离心机分离血清，离心后，应在生物安全柜里开启试管盖。在生物安全柜内分离血清，操作时，尽量避免产生气溶胶，工作人员的手臂动作幅度不能太大，以免影响安全柜内的空气层流。如果是无盖的试管，应在离心完毕后，静止30min后，再开启离心机盖，如发生试管破损，要对离心机进行严格的消毒。血清分离器械的处理 操作完毕后，所有的吸管、Tip吸头、含血球的试管等废弃物应置于规定的已含适当消毒液的容器内，小心的移出生物安全柜，高压和/或焚烧。如使用滤纸片作为载体收集的样本，在实验室内使用缓冲液浸泡、离心收集样本的操作，亦参照上述要求处理。要求工作人员将所有实验操作移至生物安全
32、柜中间进行，安全柜内工作台面由左到右分别为相对清洁和污染区域。消毒 应备有合适的消毒液，以随时清除溅出物及溢出物。5、样品检测HIV抗体筛查检测 （1）手工操作：加样、混匀 用移液器将分离好的血清在生物安全柜内加样至酶联免疫吸附试验（ELISA）或其它试剂的反应孔中，小心混匀，尽可能避免气溶胶的产生，封盖后，用托盘平移至温箱孵育；洗涤、溢出 洗涤仪使用前应检查吸液针孔是否已阻塞，如发现阻塞应尽快疏通，在洗涤过程中要注意洗涤液不能溢出；每次洗涤完毕，用蒸馏水洗涤几次，以免洗液中的成分产生结晶而阻塞针孔，造成实验环境污染；吸入废液瓶中的液体，应按量加入适量的消毒剂，作用规定时间后处置；（2）自动化
33、酶标仪检测:该仪器操作中存在有加样探针及洗涤的废液均应根据每次废液的量加入足够的消毒剂，作用规定的时间后处理。HIV抗体确认检测 （1）手工操作：必须注意，需确认的样品阳性概率非常高。加好样品以后，小心的将反应槽放于摇床上，启动摇床，缓慢地提高转速，直至达到规定的转速，不要启动后马上达到转速，将可能导致液体急促溅出，如摇床失常，液体溢出或泄漏，应及时用消毒剂处理；对每次反应后的废液，应集中收集于容器内，加入足量的消毒剂，作用规定时间后弃之；（2）自动化蛋白印迹仪：仪器使用后收集的废液应按照上述要求处理。6.剩余样品处理如需保藏的血清或血浆样本，应设有专用冰箱、登记造册入档、专人保管。若专库保藏
34、的，必须按照国家高致病性样本管理要求保藏。不需保藏的所有样本，按实验室废弃物处置。7.废弃物处置废弃物处置规范 废弃物处置应符合实验室生物安全通用要求（GB19489-2004）和消毒技术规范（2002年版）。废弃物处置 从实验室出来的所有废弃物，包括不再需要的样品（血球、血清等）、反应板、试剂阴阳性对照、ELISA标记物、试剂包装盒等，均应视为感染性废弃物，应置于专用的密封防漏容器或生物废物袋中，经高压无害化处理后，密封容器或扎紧废物袋口，按环卫部门要求处置。所有废弃物应按照HIV污染物品处理，由专人按特定程序和方法进行清洁和消毒，污染或可能造成污染的材料在带出实验室前均应严格进行消毒。记录
35、 废弃物的处理应做好记录。消毒效果监测 可使用化学、生物指示带/剂法，每次高压灭菌需用化学指示带、每月用生物指示剂来监测灭菌效果。九、重组DNA操作和可能扩大的宿主范围目前，尚未见到对应的操作和文献资料十、预防和治疗措施对于艾滋病，至今尚无根治之术。但科学家经过潜心研究，利用多种技术，取得了不少喜人的成果。其中最引人注目的就是美籍华人何大一推出的鸡尾酒疗法。他认为：多种药物合用疗效远大于单一药物。他将两种逆转录酶抑制剂与一种病毒蛋白酶抑制剂合在一起，使被测者体内艾滋病病毒数量达到测不出来的水平。十一、人员安全状况评估制定和完善烈性传染病实验室生物安全技术操作规程；加强可能暴露于HIV病毒或潜在
36、感染性材料的相关业务人员生物安全知识培训；预防和治疗措切实落实和项管理制度；预防和控制实验室等渠道造成HIV感染和传播，建立实验室工作人员可颖症状报告制度，并保证他们能及时被告定点专科医院收治，以防止实验室感染扩散到社会。禁忌人群：从事HIV研究的实验室工作人员必须在身体状况良好的情况下才能进入HIV初筛实验室进行工作，出现下列情况之一是不宜进入：患发热性疾病；感冒，上呼吸道感染或其他到致抵抗力下降的情况；妊娠，已经在实验室控制区域内连续工作4小时以上左其他原因造成的疲劳状态。实验室工作人员必须持有上岗证进行工作十二、评估结论1. 病原微生物分类分级依据按卫生部可感染人间的病原微生物名录（20
37、06年）（简称名录），人类免疫缺陷病毒（HIV）列为危害程度第2类病原微生物，根据国务院2004年颁布的424号令病原微生物实验室生物安全管理条例，HIV属于高致病性病原微生物。2. 实验活动、实验室级别以及人逐步形成防护要求实验时，未经实验室主任同意，限制或禁止进入实验室。不许在工作区域饮食、吸烟、清洗隐型眼镜和化妆。食物应存放在工作区域以外专用橱柜或冰箱中。所有的操作过程应尽量细心，避免产生和溅出气溶胶。对于污染的锐器，必须时刻保持高度的警惕，包括针、注射器、玻片、加样器等。注射和吸取感染材料时，只能使用针头固定注射器或一次性注射器（即注射器和针头是一体的）。用过的一次性针头必须弯曲、切断
38、、破碎、重新套上针头套、从一次性注射器上去掉，或在丢弃前进行人工处理，要不将之小心放入不会被刺穿的、用于收集废弃锐器的容器中。非一次性锐器必须放置在坚壁容器中，转移至处理区消毒，最好高压杀菌。打碎的器皿不能直接用手处理，必须用其它工具处理，如刷子和簸箕、夹子或镊子。盛污染的针头、锐器、碎玻璃的容器在倒掉前，应按照相关的规定进行消毒。所有的培养物、储存物及其它规定的废物在释放前，均应使用可行的消毒方法进行消毒，如高压灭菌。转移到就近实验室消毒的物料应置于耐用、防漏容器内，密封运出实验室。离开该系统进行消毒的物料，在转移前应包装，其包装应符合有关的法规。溅出或偶然事件中，明显暴露于传染源时，要立即
39、向实验室主任报告。进行适当的医学评估、观察、治疗，保留书面记录。按日常程序、在有关传染源的工作结束后、尤其是传染源溅出或洒出后、或受到其他传染源污染后，实验室设备和工作台面应当使用有效的消毒剂消毒。污染的设备在送去修理、维护前，要按照相关的规定消毒；在离开设施转移前，要按照相关的规定打包运输。安全设备正确使用和保养生物安全柜、最好是二级生物安全柜、或其他合适的人员防护设施、或物理遏制装置。确定可能形成传染性气溶胶或溅出物的实验过程，包括离心、研磨、匀浆、剧烈震荡或混匀、超声波破裂、开启装有传染源的容器、采集感染标本等。涉及高浓度或大体积的传染源时，若选用密封转头或带安全罩的离心机，若转头或安全
40、罩仅在生物安全柜中打开，则可在开放实验室内离心。当必须在生物安全柜外处理标本时，需采取面部保护措施（跟镜、口罩、面罩、或其他防溅装置），以免传染源或其他有害物溅或洒到面上。在实验室内，必须使用专用的防护性外衣、大褂、罩衫或制服。人员到非实验室区域时，防护服必须留在实验室内。防护服可以在实验室内处理，也可以在洗衣房中洗涤，但不能带回家中。能接触潜在传染源、被污染的表面或设备时，要戴手套。一次性手套不用清洗、不能重复使用，不能用于接触“洁净”的表面（键盘、电话等），也不应当戴着到实验室外。要备有带滑石粉的乳胶手套。脱掉手套后，要洗手。3.人员健康和素质要求实验人员上岗前必须接受严格的生物安全培以及
41、该类病毒实验操作技术的全面培训.4.预防和治疗技工施要求目前尚无特效的病苗。感染后具休治疗方案说见卫生部（HIV诊疗方案）由于目前对病毒感染性疾病没有特效的治疗药物，所以对AIDS也没有有效的治疗办法。加之，HIV病毒核酸与宿主染色体DNA整合，利用宿主细胞进行复制，给药物治疗带来了困难。HIV感染的早期治疗十分重要。通过治疗可减缓免疫功能的衰退。HIV感染者患结核、细菌性肺炎和卡氏肺囊虫肺炎的危险性增加，进行早期预防十分重要。 一、 支持疗法、尽可能改善AIDS患者的进行性消耗。 二、 免疫调节剂治疗： （一）白细胞介素2（IL-2）：提高机体对HIV感染细胞的MHC限制的细胞毒性作用，亦提
42、高非MHC限制的自然杀伤细胞（NK）及淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）的活性。 （二）粒细胞集落刺激因子（G-CSF）及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）：增加循环中性粒细胞，提高机体的抗感染能力。 （三）灵杆菌素：激活脑下垂体肾上腺皮质系统，调整机体内部环境与功能，增强机体对外界环境变化的适应能力，刺激机体产生体液抗体，使白细胞总数增加，吞噬功能加强，激活机体防御系统抗御病原微生物及病毒的侵袭。 （四）干扰素（IFN）：-干扰素（IFN-），对部分病人可略提高CD4+T细胞，40%Kaposis肉瘤患者有瘤体消退；-干扰素（IFN-）：静脉给药效果与IFN-类似，但皮下注射，抗Ka
43、posis肉瘤作用较弱；-干扰素（IFN-）提高单核细胞巨噬细胞活性，抗弓形体等条件性感染可能有一定效果。 三、 抗病毒制剂： （一） 抑制HIV与宿主细胞结合及穿入的药物：可溶性rsCD4能与HIV结合，占据CD4结合部位，使HIVgp120不能与CD4T淋巴细胞上的CD4结合，不能穿入感染CD4T淋巴细胞。 剂量：rsCD4临床试验30mg/日，肌注或静注，连续28天。 （二） 抑制HIV逆转录酶（RT）的药物：通过抑制逆转录酶，阻断HIV复制。效果较好的药物有：叠氮胸苷、双脱氧胞苷。5.菌种和实验室活动管理要求该类病原微生物引起人类严重疾病，而且比较容易直接或间接在人与人动物与人动物与动
44、物之间传播，因此，对毒种的操作都必须在BSL-2实验室内进行。6.应急预案和措施要求实验室必须随时备有足够应急使用的消毒剂，消毒剂应在有效期内，保证消毒效果。发生意外事故时，应立即采取相应紧急处理措施，并报告实验室负责人：（1）血液溢漏、倾翻于工作台面或实验地面时，应马上采取消毒措施；（2）操作人员破损的皮肤或黏膜接触了待检样本或含有HIV的血清，发生了职业暴露事故后，应立即用消毒液或清水处理被污染的部分，病原微生物起源尽可能用力挤压皮肤，排出污染物，或使用洗眼装置冲洗眼睛黏膜，然后按卫生部医护人员艾滋病病毒职业暴露处理指导原则认真做好职业暴露危害评估及处理；（3）未破损的皮肤只需立即消毒清洗
45、；（4）工作人员衣物污染时，应马上脱去，高压灭菌后再清洗；（5）如果发生环境大面积污染，工作人员应及时离开实验室；（6）做好意外和事故登记、报告和检测。每次开启后首先检查气流正常与否。每次实验完毕后，使用合适的消毒液（防腐蚀）擦拭安全柜内壁。生物安全柜应定期检查空气的层流、流速、噪音、泄漏、紫外线强度、高效过滤膜的破损等。若生物安全柜出现正压，或不能正常工作报警时，应被视为房间有试验因子污染并对实验室工作人员危害较大，应立即关闭安全柜电源，停止工作，缓慢撤出双手离开工作位置，避开从安全柜出来的气流。在保持房间负压和加强个人防护的条件下进行消毒处理，撤离实验室生物安全柜的高效过滤膜阻塞工作无效时
46、，必须请专业人员在密封状态下用福尔马林熏蒸后再更换，更换下的滤膜应放置于专用塑料袋密封后移出实验室，送到指定地点销毁。2.乙型肝炎病毒的生物危害评估报告一、一般生物学特性概述1、起源乙型病毒性肝炎是常见传染病,在我国广泛流行,人群感染率高,是危害人民健康最严重的常见传染病之一。2、基因组及基编码产物目前，已可从感染HBV病人的血清中及感染肝脏提纯的病毒核心中分离出环状双股DNA，从而确定HBV属DNA病毒。目前，由于克隆化DNA完整核苷酸已经确定，现已证实HBsAg和HBcAg都是由Dane颗粒的DNA所编码，并且二类基因存在同一DNA分子上。有人比较病毒基因编码能力和病毒多少，发现HBV D
47、NA负链能编码全部已知的HBV蛋白质，而其正链开放读码区，不能编码病毒蛋白。HBVDNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X，能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为二部分，S基因和前S基因。S基因能编码主要表面蛋白。S基因之前是一个能编码163个氨基酸的前S基因，编码Pre S1和Pre S2蛋白。C区基因包括前C基因和C基因，分别编码HBeAg和HBcAg。P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。X区可能编码有154个氨基酸的碱性多肽。3、形态特征乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒，有包膜，病毒颗粒为直径42nm的圆球形。在病毒感染者的外周血中还有直径22nm的圆形和管形颗粒。这种颗粒为乙型肝炎表面抗原，没有核酸，无传染性。1大球形颗粒：亦称Dane颗粒，它是一种由一个囊膜和一个含有DNA分子的核衣壳组成的病毒颗粒，直径约42
