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1、分类号： 067 密级： 公开硕 士 研 究 生 学 位 论 文论文题目： 水道稻几丁质酶的定向进化 专 业： 生物化学与分子生物学 研究方向： 植物分子生物学 研 究 生： 袁卫生 指导老师： 刘红全 副教授 论文起止日期 2011 年 5 月至 2013 年 6 月水稻几丁质酶的定向进化研究摘 要利用易错PCR和 DNA改组对水稻几丁质酶基因chAB进行随机突变。将突变基因产物克隆到分泌型表达载体pMBP-P，并导入感受态E.coli TOP10F构建突变体文库；利用几丁质平板法筛选到了突变体CHA-P。通过正交试验优化得到CHA-P重组蛋白的最佳表达条件：pH6.5，IPTG浓度0.8m
2、M，33，200rpm，培养5h；CHA-P胞外酶活力为80umol/min, 较野生酶活力提高了2倍。重组蛋白主要以包涵体形式存在。运用尿素梯度透析复性法对包涵体进行复性，复性后的酶比活力为0.24U/mg。对突变体进行序列分析发现：CHA-P的核苷酸序列较野生几丁质酶核苷酸序列发生了318位CT，368位AG，374位AG三个碱基的改变，相应的氨基酸序列发生了天冬氨酸甘氨酸（123位DG），酪氨酸半胱氨酸（125位YC）的改变。在突变序列中也发生了一段 (4位-129位) 碱基缺失和插入 (736位-768位)，插入使得终止密码子提前出现，造成蛋白质翻译的提前终止。关键词：几丁质酶 易错P
3、CR DNA改组 定向进化 酶活 DIRECTED EVOLUTION OF RICE CHITINASE ABSTRACTRandom mutagenesis on rice chitinase gene chAB was conducted by using error-prone PCR and DAN-shuffing strategyThe mutation product was recombinated in expression vector pMBP-P, and transformed into E.coli TOP10F to construct the mutant l
4、ibrary. The mutant strain CHA-P was selected using the method of chitin plate. The optimal expression conditions of the mutant CHA-P recombinant protein were obtained by orthogonal test which involve: 0.8mM IPTG induction, the pH of the medium is 6.5, oscillate fermenting 5h with 200rpm and 33. CHA-
5、P extracellular enzyme activity is 80umol/min, which increased twice times compared with that of the wild-type enzyme. The recombinant proteins mainly existed in inclusion bodies. The inclusion bodies were refolded by urea gradient dialysis refolding method. The enzymatic activity of the renatured r
6、ecombinant proteins is 0.24U/mg. Sequence analysis of the mutant CHA-P showed that three nucleotides substitution 318C/T，368A/G and 374A/G occurred，and caused two amino acids mutation of 123D/G and 125Y/C. Furthermore, the mutation includes the absence of 126 bases (4 to 129) and 2 bases insertion (
7、736 to 738), which makes the termination codon appeared in advance, and causing premature termination of the protein translation. KEYWORDS: chitinase; error-prone PCR; DNA shuffling; directed evolution; enzymatic activity目 录1前言11.1 植物几丁质酶特性11.2 植物几丁质酶的分类21.3 植物几丁质酶基因研究进展21.3.1几丁质酶新发现21.3.2 几丁质酶N-端研究
8、31.3.3 几丁酶农业上应用41.4问题与展望42定向进化62.1 易错PCR72.2 DNA改组72.3 筛选方法82.4 定向进化的应用92.4.1工业领域研究92.4.2 药用蛋白领域研究92.4.3 农业领域研究102.5 定向进化应用前景102.6 研究的目的和意义113 目的基因的体外突变及克隆123.1实验材料123.1.1菌株123.1.2质粒123.1.3试剂123.1.4主要仪器123.2 实验方法133.2.1几丁质酶基因突变及筛选文库的构建133.2.1.1质粒提取133.2.1.2水稻几丁质酶基因chAB的扩增133.2.1.3目的基因纯化回收133.2.2易错PC
9、R143.2.3 DNA改组(DNA shuffling)143.2.4 突变文库的构建143.2.4.1 新鲜感受态细胞的制备153.2.4.2 限制性酶切153.2.4.3 连接153.2.4.4转化153.2.5筛选163.2.6 序列分析163.3结果分析163.3.1质粒提取及PCR鉴定163.3.2体外突变173.3.2.1易错PCR结果173.3.2.2 DNA shuffling结果173.3.3 突变文库鉴定193.3.4 序列分析结果193.4讨论213.4.1易错PCR213.4.2 DNA shuffling213.4.3 突变表达载体构建及筛选224重组菌的诱导表达及
10、酶活力测定234.1 材料及试剂234.1.1 菌种234.1.2 主要试剂与溶液234.1.3 主要仪器234.1.4 胶体几丁质的制备244.1.5 DNS的配制244.1.6 考马斯亮蓝G-250的配置244.2 实验方法244.2.1 几丁质酶活测定254.2.1.2 氨基葡萄糖标准曲线的绘制254.2.2.2 几丁质酶活测定264.2.2 蛋白质含量测定264.2.2.1 蛋白含量标准曲线的绘制264.2.2.2可溶性蛋白含量测定274.2.3菌体沉淀SDS-PAGE电泳鉴定274.2.4 CHA-P突变体的诱导表达284.2.4.1 CHA-P突变体表达条件优化294.2.5 包涵
11、体复性304.2.5.1 包涵体的溶解304.2.5.2包涵体复性314.3结果分析314.3.1突变体CHA-P诱导表达结果314.3.2 CHA-P突变体表达条件的正交优化334.3.3 包涵体复性结果364.4讨论374.4.1突变体CHA-P的诱导表达374.4.2表达条件优化384.4.3可能形成的包涵体原因384.4.2包涵体的处理及复性385小结40参考文献41致 谢471前言甲壳素或甲壳质又称为几丁质，它是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以-1,4-糖苷键连接而成的长链多聚物1。几丁质广泛存在于水生甲壳类动物、软体动物和节肢动物外壳中，如虾、螃蟹等，同时也是大多数真菌细胞壁的主要成分
12、，也存在于一些绿藻中。其在地球上的含量非常丰富，仅次于纤维素，而它又具有比纤维素更加丰富的功能性质。可广泛应用在医药、化工、食品、环境等许多领域。每年自然界中产生数量极其巨大的几丁质，几丁质及其降解产物作为重要的有机碳源和氮源，它们参与生态系统的物质交换和能量流动2。几丁质酶是一种能催化降解几丁质的糖苷酶，主要是水解几丁质中-1，4糖苷键,产生几丁质单糖-N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）。很多植物都可以合成不同的几丁质酶，对于植物几丁质酶来说内源性底物尚未发现，但植物几丁质酶也参与植物与微生物之间的相互作用，从而产生几丁质及其相关的混合物。由于几丁质是很多病菌细胞壁和害虫等生物体的组成成分，所以几
13、丁质酶能通过水解几丁质从而抵御病原菌和害虫的入侵。目前已经从许多微生物中分离到几丁质酶，并全面了解了其中一些几丁质酶的体外水解能力及对温度、pH耐受等生物学性质。尤其是真菌几丁质酶在转基因植物中的应用，对真菌病原菌表现出了较好的抑制作用，降低了病原菌所产生的减产危害。这表明微生物几丁质酶在农业生产中将起到重要作用。当然几丁质酶还有其它的一些重要作用,如抗冻害3、植物发育调节4、生物固氮5等方面都发挥着重要的作用，并与人类有些疾病发生相关6，7、广泛参与了植物光合作用等过程8。几丁质酶水解几丁质后获得的具有生物活性氨基寡糖素在调节植物细胞生命代谢活动中起着重要的作用，其作为植物功能调节剂，不仅可
14、以调控植物基因表达的开放与否，还可以诱导植物产生抗性蛋白质，调节植物的生长和提高植物对病原微生物的防御能力。这些研究均暗示着几丁质酶具有多种生理功能，可应用领域十分广泛。目前对几丁质酶的特性、基因结构、分类、分子进化、生物学作用及转几丁质酶基因的研究越来越深入，近年来已成为作物抗真菌病害的研究热点之一。1.1 植物几丁质酶特性大多数植物几丁质酶的分子量为15-55KD，最适pH为一般低于7，对温度相对稳定；等电点有的偏酸，有的偏碱，所以有酸性和碱性几丁质酶之分,植物体内通常含有1种或几种几丁质酶9。植物几丁质酶的产生主要有组成型的和诱导型。正常情况下，植物几乎不表达几丁质酶，极少数植物会表达几
15、丁质酶但含量很低。当植物受到卵菌、真菌、细菌、病毒和害虫等外来侵害时，植物可以产生大量的不同防御性相关蛋白质（PR）来抵御。特别是在植物被感染的部位PR含量会明显增加，含量可提高到原来的十几倍甚至几百倍，从而避免植物遭受某些真菌、病毒等的侵害，但这种反应对病原菌和害虫抑制效果并不明显。水杨酸、茉莉酸、乙烯、-葡聚糖低聚糖、几丁质、壳聚糖寡糖和脂多糖等信号分子也能分别诱导植物产生防御相关蛋白10-11。 几丁质酶可以水解几丁质中的-1,4糖苷键，将2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖线性多糖水解成甲壳低聚糖。1.2 植物几丁质酶的分类在CAZy数据库中，根据几丁质酶的氨基酸序列将植物几丁质酶归类到
16、GH18和GH19家族中12。这两个家族的酶存在不同的催化反应机制，在进行水解反应时，GH18家族几丁质酶利用底物辅助催化，导致异构体的零捕获量13。GH19家族几丁质酶利用一种反向催化机制，其中的两个酸性氨基酸残基催化反向异构水解反应14。GH18几丁质酶的催化区域是一个由（/）8 组成的桶状折叠结构，而GH19几丁质酶的催化区域则有是由-螺旋构成的。据报道，按照它们的分子组成，植物几丁质酶至少分成五类，Classes I，II和IV几丁质酶含有GH19家族的催化区域。Classes I几丁质酶有三个功能区组成：富含半胱氨酸N-端几丁质结合区，富含脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(
17、Arg)的可变交联区，高度保守的C-端催化区。Class IV的催化区域小于Classes I和II，其中Classes I和IV在N端含有碳水化合物结合模块。Classes III和V含有GH18家族的催化区域，但Class V的催化区域比Classes III的催化区域大；Classes III缺少几丁质结合区且该酶催化区的序列与Classes I有很大差别，Classes V几丁质酶在N端有一个重复的几丁质结合区。Classes I和IV在N端有富含半胱氨酸的几丁质结合区（CBD），但Classes IV在催化区域发生了四个氨基酸残基缺失，且与Classes I催化区的同源性较低。Cla
18、sses II缺少CBD区和交联区，但它的催化区和Classes I该功能区极为相似。几丁质结合区虽然不是催化能力和抗菌活性必不可缺少的，但其能增加抗菌效果15。1.3 植物几丁质酶基因研究进展1.3.1几丁质酶新发现自Brogue16等1991年首次报道菜豆几丁质酶转基因烟草植物提高立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抗性以来，植物几丁质酶基因常作为抗病基因转入受体植物以提高对目的病原真菌的抗性。植物和细菌的几丁质酶对真菌有抑制能力这一事实很早就已被人们所知17，18，但任何单一的植物或细菌产生的几丁质酶都不能表现出合适的抗菌能力。Kana Ishisak19等人对猪笼草分泌
19、液中Class IV几丁质酶研究发现在其活性位点有5个亚位点，这些位点对(GlcNAc)n的水解反应是有利的，但对于高聚底物分子没有作用。催化(GlcN- Ac)n（n=4或5）的水解反应中检测到底物抑制现象。这对于研究猪笼草分泌液中几丁质酶的作用来说是一个很重要的发现。Shaoyun Wang20等人从蚕豆的种子获得的一种新型的几丁质酶，对其抗菌性和热稳定性的研究发现：该酶对菜豆绵腐病菌, 香碗豆萎凋病菌，苹果粗皮病菌，互隔交链孢霉,葡萄孢菌和镰刀菌都有抑制作用；在20，30，40，50和58保持10min，该酶仍保持很高的生物活性。这表明该酶在农业生产中有着重要的抗真菌能力。Haixia
20、Yang21等人从石榴种子中分离纯化得到一种新的有很强钙离子结合能力的几丁质酶。经免疫组化和免疫印迹分析发现这种几丁质酶不像已发现的几丁质酶那样定位于内质网或液泡内，而是存在于石榴种子的造粉体间质中。通过对等电点聚焦实验及氨基酸序列研究结果表明该酶的等电点为4.41；有类似18家族的两个保守区域，序列中富含天冬氨酸和谷氨酸，含有21个天冬氨酸残基,是目前已知的Class中最多的一种几丁质酶，信号肽序列中含有很高比例的疏水性氨基酸。研究发现该酶在种子的发芽过程中起着重要作用,钙离子有利于蛋白三级结构稳定,且不影响酶的活性。1.3.2 几丁质酶N-端研究Naoyuki UMEMOTO22等人对来自
21、于烟草的Class V几丁质酶，通过定点突变法将位于底物结合区的色氨（Trp326）突变成丙氨酸和苯丙氨酸后，该酶的热稳定性降低了5-7，催化活力显著降低。这说明了Trp326残基对于蛋白质结构方面起着很大作用，且在Glu115作为质子供体提供的水解环境存在时对于保持稳定催化活力方面也可能起到一定的增强作用。LysM是一个由45个氨基酸组成的蛋白功能区，最初在少数几种细菌自溶蛋白质中被发现。Shoko Onaga23等人在琉球凤尾蕨类中发现了PrChi-A这种新的几丁质酶，该酶属于Classes III类，N-端有两个LysM功能区域，其几丁质结合能力及抗菌特性研究表明PrChi-A是主要通过
22、LysM实现几丁质的结合，LysM虽然没有催化活力，但却有利于提高植物的抗菌能力。1.3.3 几丁酶农业上应用目前，在植物抗病基因工程研究中，几丁质酶基因主要应用于3个方面：1）把其它来源的几丁质酶基因导入寄主植物中, 以提高寄主植物几丁质酶的表达水平。2）改造植物原有的几丁质酶基因，改换强启动子、导入增强子等，以增加几丁质酶基因的表达量。 3）改造野生生防菌株，通过转基因，使生防菌株获得新的抗病机制。多年的研究结果表明24,25,26,27，不仅单独转化植物几丁质酶基因可获得对病原真菌抗性提高的转基因植株, 而且与其他抗菌蛋白基因如-1，3-葡聚糖酶基因、核糖体失活蛋白基因等共转化，可产生协
23、同作用而对病原真菌抗性进一步增强, 研究结果促进了不同植物来源几丁质酶基因的挖掘和利用价值评价。朱荷琴28等将几丁质酶和葡聚糖酶基因导入抗黄萎病性较差的受体（中棉所24），获得的转基因株系61217-1抗黄萎病性极显著提高，达抗病水平，且能稳定遗传。苦瓜几丁质酶基因McCHIT1基因具有广谱抗菌性,张长伟29等将其遗传转化水稻，采用“逐代增加选择压,抗中选抗”的方法，筛选出了稻瘟病抗性优良、抗谱明显拓宽、产量性状较好的转基因稳定株系。木霉菌产生的几丁质酶在相同的条件下表现出的抗菌能力比目前任何其它来源的几丁质酶抗菌能力都强，木霉菌产生的几丁质酶抗菌范围也更广 30。G V S Saiprasa
24、d31等人利用来自木霉菌的内切几丁质酶基因在CaMV35S启动子的控制下成功导入烟草中，转基因烟草对木霉菌表现出了显著的抑制作用。Linus Moses Kosambo-Ayoo32等人将源自哈茨木霉菌的几丁质酶基因和壳聚糖酶基因同时转入高梁基因组中，成功地获得了对炭疽病有抵抗作用的转基因高梁，从而可以有效降低炭疽病所导致的高梁减产程度。1.4问题与展望植物疾病对全世界范围内的农业都是一个巨大的挑战，含有几丁质酶等病程相关蛋白质的转基因作物可以增强植物抵抗病菌的入侵能力，所以转基因作物的大面积种植被看作应对这一挑战的有效方法。虽然近几年，越来越多转基因植物表现出了抗真菌活性，一些含有抗病虫的转
25、基因植物体内的几丁质酶的活性得到了提高，但这些转基因植物却没有表出相应的抗菌能力。例如，转基因烟草体内虽然几丁质酶的活性得到了显著的提高，但却对生活在其根际的病原真菌没有抵抗能力33。在Arlorio等34进行的研究发现水解酶对于外生菌根和石楠菌根真菌没有抑制作用。有两种可能可以解释几丁质酶对于不同的真菌表现出不同的抗性作用。第一，可能是由于不同的真菌的细胞壁所含的几丁质的比例不同：那些细胞壁中几丁质所占比例低的真菌，不易被几丁质酶发现。第二，可能是在不同的真菌细胞壁几丁质中暴露出的对几丁质酶敏感的键，存在很大的不同：如果几丁质敏感键暴露的较少，那么真病原菌就不会及时地受到几丁质酶的水解。当然
26、几丁质酶在植物体内的表达水平和定位情况也对其能否发挥抗菌性起到很重要的作用。例如，碱性几丁质酶定位于植物的液泡中，不可能对生活在细胞间的丛枝菌根真菌起到抑制作用35。因此，即使在丛枝菌根真菌侵染的植物根部几丁质酶水平得到提高也不影响其在根部的生存。伴随着水解酶在植物体内持续高水平的表达，丛枝菌根真菌也许已经适应了那些水解酶的存在，已经发现其它的真菌在水解酶存在仍能生存的情况36，37。随着对几丁质酶作用机理研究的深入，通过几丁质酶基因工程手段培育出具抗性转基因植物将成为防治植物真菌病害的有效途径。又因其不污染环境、不产生抗药性、基因稳定遗传和对病虫害的抑制作用等特性，所以扩大转入几丁质酶基因植
27、物群体，将成为今后转入几丁质酶基因植物实用化的主要方向38。2定向进化体外随机突变已经成为在产生优化酶或有特定功能蛋白质的常用策略。该策略包括对编码不同蛋白基因的体外突变，突变蛋白质的表达及基于目的特性的蛋白质筛选两个部分。 事实上蛋白质体外定向进化并不是一个新的概念，早在上世纪70年代有关蛋白质定向进化就已经有了比较系统的研究。定向进化一个早期例子是来自大肠杆菌的EbgA酶蛋白，该酶缺少-半乳糖苷酶活性。通过多次筛选以乳糖为唯一碳源的LacZ缺少的大肠杆菌株系，结果表明筛选到的野生型EbgA酶蛋白进化成了具有-半乳糖苷酶活性，从而替代了LacZ基因的功能39。蛋白质定向进化是一个用来描述产生
28、突变体和筛选期望特性的突变技术。在过去三十年里，蛋白质定向进化已经发展成为蛋白质工程中的一个强大有力的技术平台。该技术有效地利用分子生物学工具和高通量筛选技术已经取得了巨大的进步。这些方法简化了实验过程并促进了突变体的筛选鉴定，即使这些突变体在期望特性发生微小的提高。进一步发展的DNA重组技术可以用于单结构基因或基因的突变，从而为快速生长或高水平表达蛋白质找到一个合适的替代宿主。此外，如易错PCR可以通基因的插入或缺失控制突变率进行蛋白质修饰。定点突变、定点饱和突变和合成寡核苷酸也能被用于扩大氨基酸的多样性。虽然突变体的功能互补在筛选突变体仍然是一种极好的选择，但目前随着仪器设备灵敏度及许多化
29、学和生物学分析的微型化的不断发展，可以依据目的特性大量的筛选样品。快速获得基因突变体DNA序列信息的能力不仅使我们更深刻的理解蛋白质序列和功能之间的关系，而且增强我们选择最好策略进行特定蛋白质进化的能力。一个最有效的蛋白质定向策略是逐渐的累积重组突变，同时运用高通量筛选，该策略主要难点在于：突变频率的控制和筛选方法的选择。如果突变率过高会增加形成无义或有害突变的机率，而突变率较低则不能起到突变的效果；经定向突变后所形成的突变体文库一般的容量都比较大，给筛选工作带来不便；所以对于定向进化来说，突变率的控制和高通量筛选方法选择决定着该策略能否成功。蛋白质定向进化不需要事先了解基因表达产物的三维结构
30、，就可对目标蛋白达到改造的目的，所以其应用也越来越广泛。体外分子进化技术主要有易错PCR、DNA shuffling、外显子改组、随机引物体外重组法、定点饱和突变法、交错延伸重组、瞬时模板随机嵌合生长等策略40。随着分子生物学技术的发展，通过体外分子进化，可以更快速、灵活和简便的改造目的基因。从功能出发，获得某些优化的突变体，一方面可快速将其推向实际应用，另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的促进作用41。2.1 易错PCR易错PCR是使用最广泛的体外突变方法之一，常用于诱导形成突变体的一种随机突变方法，已经成为蛋白质工程中有效工具。经典的易错PCR是通过改变反应体系中各组成成分的浓度、外加一
31、定浓度的Mn2+及改变反应体系中所使用的聚合酶（没有3到点5的外切酶活性），从而导致扩增出的PCR产物发生碱基错配。但经典的易错PCR方法中由于所用的Taq/pfu聚合酶没有校对功能，所以产生的突变存在ATGC转换和ATTA颠换的倾向，为了弥补这个主要缺陷日本学者Toshifumi Minamoto 42等探索出了一种新的易错PCR方法：使用重水代替普通的双蒸水作为反应体系中的溶剂。他们通过选择（A) 100% H2O, (B) 100% H2O/0.6 mM Mn2+, (C) 99% D2O, (D) 99% D2O/0.6 mM Mn2+ 和(E) 99% H218O五种不同的条件进行P
32、CR扩增研究发现：使用重水作为溶剂时易错PCR产生的突变没有位置偏好性，模反依赖性或发生产物减少的现象。一般适合较小的基因片段(1000bp)，但也有报道可以用来扩增几千bp基因片段。随着研究不断的深入相继出了以易错PCR技术为基础的体外突变技术，如重叠延伸蛋白域文库法，该方法是Jose等43于2008年首次提出的，其利用易错PCR技术引入一个随机片段，并且在相应的氨基酸序列上做标记，用高保真PCR扩增上游不被改变的具有一定功能的脱氧核糖核苷酸序列，该序列中的部分序列与被引入的随机片段重叠后进行杂交延伸反应，产生新的核苷酸序列可以用于构建突变克隆文库。这种方法提高了易错PCR的突变效率，能够在
33、一个特定的区域发生随机突变，也就是说可以在预期的区域进行随机突变。所以，当涉及到多域蛋白质的突变时，重叠延伸蛋白域文库法是首选的方法。重叠延伸蛋白域文库法与易错PCR和DNA改组44相比，有重大的提高。该方法的不足是步骤较繁锁，突变效率有限。2.2 DNA改组DNA改组是Stemmer等45 于1994提出来的，该技术是通过对一组序列相关的DNA序列经超声波处理或在DNaseI的作用下随机酶切成小片段，然后在不加引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前目的基因的长度；最后，用基因两侧的引物合成全长的基因。图2.1 DNA改组流程研究表明，DAN改
34、组比随机突变具有较大的优势，随机突变的方法一般产生1%的良性突变，但DNA改组可产生13%的良性突变。而且，DNA改组还可引入可控制水平的点突变(0.05%-0.7%) ，其所产生的突变基因库容量远远高于随机突变所产生的点突变库容量46。在DNA改组出现以前，寡核苷酸定向诱变和易错PCR被广泛用于对蛋白的体外突变，一段时期以来在工业，医药等领域却也有着广泛的应用，尽管这两种方法只发生了较低的点突变。通过突变或重组获得基因文库的多样性，一般出发基因突变文库利用点突变（如易错PCR）或定点突变产生；因为有益突变一般相对于不利突变产生的频率要低很多，只有单个有益突变在每轮突变循环中累积并不断被筛选出
35、。事实上，当产生多突变后，目标蛋白特性发生改善的机率则迅速降低；因此通过几轮点突变方法产生蛋白质特性提高是有限且较小的。DNA改组通过引入来自多基因的有益突变定向重组，从而克服了点突变的局限性，相继出现了Whole-Genome Shuffling、DNA family shuffling、随机链交换突变法，其中随机链交换突变法是Ryota47，48等于2006年首次提出的，该方法除了需要在小片段的3端用末端脱氧转移酶（TdT）随机的加入1-5bp碱基外，其余均与DNA shuffling步骤几乎一致，但与DNA shuffling相比，不需要一组含点突变的基因或基因家族，可直接以单个基因为父
36、本，而且它产生的突变强度大于DNA shuffling，包含点突变、区域交换外，还可以产生随机序列的插入或删除等，从而提高突变文库的多样性47。2.3 筛选方法在完成构建突变文库之后最重要的是根据所要得到的特性选择合适的筛选模型进行筛选。合理的高通量筛选方案对于定向进化的最终成功至关重要。筛选方法选用应按照以下标准：第一，对要筛选目的蛋白质具有针对性，所筛即所得，这也被称为定向进化第一定律。第二，必须是高通量的筛选方法。第三，检测方法必须具有可行性，检测过程具有一定的灵敏度。目前通常采用的筛选方法是基于生物学表型的筛选，例如对抗生素抗性的基因进行定向进化，只需在提高抗生素浓度的平板上即可进行高
37、效筛选；改造编码耐热酶基因的过程，通过提高培养温度就可以筛选耐热性提高的酶。生物学表型筛选方法一般简单有效，但也有其一定的局限性，例如对于不能通过生物学表型鉴定的性状就不能通过生物学表型方法筛选，因而出现了许多新的筛选方法以应对各种复杂的性状49。如：流式细胞分选技术、酵母表面展示技术、噬菌体展示技术、mRNA展示技术，其中酵母表面展示技术作为一种真核蛋白质系统，近年来已经越来越多的应用于酶、医药卫生、食品，生物燃料等方面。其基本原理是：利用外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合后导入酵母菌细胞内，通过该细胞内的蛋白质转运至膜表面的机制使目标蛋白质固定化表达在细胞表面50。2.4 定向进化的应
38、用2.4.1工业领域研究赵心清51等利用易错PCR对酿酒酵4126的SPT3进行体外突变，筛选到了对高浓度乙醇耐受性提高的突变株M25，该突变株利用125g/L 的葡萄糖进行乙醇发酵时，终点乙醇产量比对照菌株提高了11.7。 氢气是一种有很大应用前景的可替代能源,生物体内可以合成释放出氢气，其中荚膜红细菌就是这类生物体，但该菌产氢气的能力及对温度的耐受点低。 Abdulmecit 52等人利用体外定向进化手段获得了几株乙基甲烷磺酸(EMS)发生突变的荚膜红细菌突变体。对其氢气产量和耐热能力鉴定发现：突变后氢气产量较未突变前提高了24%，42时依然很稳定，这表明定向进化是一种非常有用的方法对于提
39、高工业微生物某些重要性质方面。2.4.2 药用蛋白领域研究定向进化可以用来优化药用蛋白，提高药用蛋白临床上的应用价值。目前体外定向进化技术也被广泛的应用于改造细胞因子和生长因子、提高抗体表达水平、改变抗体的亲和性，在新型疫苗和药物分子上也有很大突破性研究53-57。Chang等以多种人-INF基因为底物进行DNA改组，经两轮改组筛选后得到的大多数突变体的活性较野生型提高了285000倍，其中有三个突变体的活性是小鼠自身活性最高的3.5倍56。囊性纤维化病是一种与胰腺机能不全有关的疾病，管腔内酸性条件限制了胰腺酶替代治疗的作用，尤其是脂肪酶的影响。Damien 58等人运用定向进化与合理的设计来
40、提高人类胰腺酶在酸性条件下的催化能力。筛选出了在低pH值条件下仍有活性的突变体。经过一轮随机突变产生了一个在酸性培养基条件下活性提高50%的脂肪突变体，该突变体带有一个长链的三酸甘油脂。序列分析发现在特定区域发生了两个碱基替换，疏水沟定位在三酸甘油脂的sn-1上。其表面上的环可能是脂肪酶/辅脂肪酶与脂质相互作用的媒介。有趣的是前面的两个替换改变了脂肪酶朝向介质和长链三酸甘油脂的链长度。他们的研究结果为设计在酸性条件下催化活性提高的脂肪酶提供了支持，并首次证明了与特定链长有关的重要残基。2.4.3 农业领域研究甘蔗巨型螟是一种严重危害甘蔗的害虫，其内生的生活方式大大降低了化学和生物控制的效果。K
41、ilvia 59等人利用DNA shuffling对Bacillus thuringiensis Cry 蛋白质基因进行体外突变，并通过噬菌体展示，筛选到了对甘蔗巨型螟产生毒性的突变体，这一研究对于通过转基因方式来控制甘蔗巨型螟的入侵有重要意义。植物液泡Na+/H+反向转运子在维持细胞离子动态平衡和调节转运细胞质内的Na+到液泡内起重要的作用。虽然液泡反向转运子在耐盐方面起着重要作用，但Na+/H+反向转运子相对较低的交换Na+/H+的Vmax被证明限制了耐盐作物分子育种的实施。徐凯60在研究中运用DNA改组产生和重组了拟南芥液泡Na+/H+反向转运子AtNHX1基因的突变体。运用大型酵母互补
42、系统筛选，证明了AtNHXS1是一个新的Na+/H+反向转运子。AtNHXS1在酵母表达证明这个新的反向转运子定位在液泡的膜上，它的表达提高了酵母对NaCl，KCl，LiCl和潮霉素B的耐受能力。通过测定完好酵母液泡转运离子的能力证明AtNHXS1蛋白表现出了较高的Na+/H+交换能力，并且它交换K+/H+的能力也有轻微的改善。2.5 定向进化应用前景由于许多蛋白质的结构以及结构和功能之间的联系尚未弄清，因此定向进化技术在蛋白质工程领域拥有巨大的优越性，它能在很短的时间内完成自然界上百万年的进化历程，在改造蛋白质分子特性方面应用越来越广泛，新的、更好的蛋白质定向进化技术也在不断出现。如今，定向
43、进化技术已被广泛用于基因的体外进化，出现了一系列具有重要工业意义或商业价值的基因和蛋白，大大加速了基因的进化进程，在农业、石油化工、生物工程、人类基因治疗研究等重要领域具有广阔的应用开发前景。2.6 研究的目的和意义几丁质酶在植物病虫害防治方面所具有的利用价值，已经引起人们的普遍重视，农业害虫及某些真菌病原体内存在几丁质酶，它们通过几丁质酶调节自身的生理生长过程，保证正常生长及生活，但必需是在合适的时间产生适当水平的几丁质酶。例如成虫在非蜕皮期过量表达几丁质酶，害虫等几丁质成分会被水解，从而对其造成一定的损伤，致使昆虫无法进行正常的生命周期甚至死亡，人们利用这一原理实施农业治虫高效且环保。Pu
44、nja等61指出，虽然转几丁质酶基因可以增强植物的抗病虫的能力，但这与物种、基因来源、类型、导入目标植株后在染色体上的定位及病原菌的种类等均有关系,上述不确定性导致利用导入外源抗病基因来增强植物对真菌性病害的抵抗能力的策略更加复杂。Punja等 61将矮牵牛、烟草和赤小豆的几丁质酶基因分别转入黄瓜中，研究发现转基因黄瓜对丝核菌、链酶菌和葡萄孢菌的抗性并未提高；而在用胡萝卜为材料的转化试验中发现其对同样的病原菌表现出抗性，烟草几丁质酶基因的效果大大优于矮牵牛几丁质酶基因。定向进化可以快速地对蛋白质进行改造，优化蛋白质的某些性质，所以可以利用分子定向进化对水稻几丁质酶改造以提高其本身所具有的酶活力
45、，解决物种、基因来源、类型等对转几丁质酶基因植物发挥其对病虫防御作用的限制。通过几丁质酶的定向进化不仅可以产生有用的酶，而且对几丁质酶结构和功能的研究也具有极重要意义。非理性设计可以快速方便地产生同一种几丁质酶的多种不同突变体，这些突变体所表现出来的性能(酶的活力、特异性和稳定性等)与其对应的氨基酸序列可形成大量的生物信息库。分析这些数据，找出可能对几丁质酶性能影响较大的氨基酸序列，为几丁质酶的理性设计提供理论依据，使理性设计更能充分发挥其应有的作用，实现对其的改造。为转基因水稻提供研究材料。3 目的基因的体外突变及克隆3.1实验材料3.1.1菌株 菌种E.coli（TOP10F，BL21）本
46、实验室保存。3.1.2质粒 pBMP-P质粒及含有水稻几丁质酶基因的（pET28a-chAB，）质粒（本验室保存）。3.1.3试剂 PCR扩增试剂（宝生物公司）、BamHI/EcoRI限制性内切酶(Fermentas公司）、DNA Marker（宝生物公司）， DnaseI（宝生物公司）,T4 DNA连接酶及RNaseA ，（宝生物公司），胶回收试剂盒（BioFlux公司）。琼脂糖:BIOWEST REGULAR溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA溶液：5 mol/L NaOH，2% SDS按1：1体积现配现用溶液：5 mol/L乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 ml，水28.5 ml RNase溶液：10 mg/ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） TE Buffer：10 mmol/L TrisHCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0氨苄青霉素：（100 g/ml）IPTG：20 mg/mL，0.22 m滤膜过滤除菌后于-20贮存备用X-Gal：50 mg/ml，用二甲基甲酰胺配制，黑纸包裹后-20贮存3.1.4主要仪器 PCR仪（Bio-Rad（S
