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1、鼠胚体外发生试验及IVF实验室装修材料的影响 汕头大学 硕士学位论文 鼠胚体外发生试验及 IVF 实验室装修材料的影响 姓名：朱晓芳 申请学位级别：硕士 专业： 指导教师：闻安民;张仁礼 2010 硕士学位论文 鼠胚体外发生试验及 IVF 实验室 装修材料的影响 研究生:朱晓芳 摘 要 人类体外受精-胚胎移植 （ In-vitro fertilization and embryo transfer ，IVF-ET ） 的受精率、卵裂率、囊胚形成率及临床妊娠率低下一直困扰着该领域研究者。IVF 实验室的化学污染问题被认为是主要原因之一。化学污染主要来源于挥发性有机 化合物（Volatile Or
2、ganic Compounds ，VOCs ）的排放。VOCs 主要由 IVF 实验室 器材、墙壁涂料、胶剂、地板及层流设备材料等排放。在 IVF 实验室装修时，尽 量减少化工材料的使用，选择排放VOCs 低的设备及材料，可以最大程度优化IVF 实验室环境。配子或胚胎的冷冻/解冻方法及辅助孵出方法也会影响到受精率、 卵裂率、囊胚形成率及临床妊娠率。玻璃化冷冻/解冻及激光辅助孵出技术与其 它冻存方法和辅助孵出方法比较更有优越性。为验证 IVF 实验室装修后的环境质 量及玻璃化冷冻、激光辅助孵出技术对受精率、卵裂率、囊胚形成率的影响，分 别在 IVF 实验室建立 3 个月和建立 1 年后进行了一系
3、列的鼠胚试验，包括小鼠超 排、配子与胚胎体外发生试验、鼠胚玻璃化冷冻、解冻及辅助孵出等试验。试验 所获得的受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚率及囊胚孵出率与各文献报道结果 一致，甚至优于文献报道结果。装修 3 个月和 1 年后鼠胚试验结果相比较，未发 现明显差异，P 0.05 。此结果提示 VOCs 排放的减少，玻璃化冻融及激光辅助 孵出技术的应用，可以提高受精率、卵裂率、优质胚胎率、芭呗始芭咛醭雎剩 I 鼠胚体外发生试验及IVF 实验室装修材料的应用 对 IVF-ET 临床结局意义重大。 研究目的: 验证通过改善 IVF 实验室的装修材料可以有效减少 VOCs 的释放， 为配子及胚胎提供更加安
4、全无毒的培养环境，有利于配子及胚胎的体外发育；观 察玻璃化冷冻/解冻及激光辅助孵出技术对胚胎冻存和孵出效果。 研究方法: 本研究包括以下几部分: 1小鼠超排卵及配子与胚胎的体外发生：第一天下午 5:00 给雌鼠腹腔注射孕 马血清促性腺激素（PMSG ）10IU/只（0.1ml ）,第三天下午 5：00 注射促 性腺激素（HCG ）10IU/只（0.1ml ）。雌鼠注射HCG 1213h 后人性化处死 雄鼠，获得精子并使之获能。注射 HCG 1314h 后，人性化处死雌鼠，获 得卵子。将获能精子加入培养箱中放有卵子的培养皿中。加精 4-6 小时后观 察受精情况，后每 24h 观察卵裂率、囊胚形成
5、率。 2 8 细胞期鼠胚（d2.5 ）的获得：第一天 12：00 给雌鼠腹腔注射 PMSG 10IU/ 只（0.1ml ）。第三天中午 11：00 给雌鼠腹腔注射 HCG 10IU/ 只（0.1ml ）。 注射 HCG 当日下午 5：00 一对一与公鼠合笼。次晨检查阴道栓子情况，见 栓记为受精 d0.5 。第六天上午人性化处死雌鼠，获得d2.5 鼠胚。 3 玻璃化冷冻：将 d2.5 鼠胚移入玻璃化冷冻液 1 液约 57 分钟，后移入玻璃 化冷冻液 2 液，随后装载到冷冻载杆上，将载杆投入液氮。 4 玻璃化解冻：3001 皿中加入解冻液 1，五孔板中加入解冻液2 、3、4 ，将装 有胚胎的载杆迅
6、速放入解冻液 1，停留 1 分钟，随之放入解冻液 2 、3、4 液 中，分别停留时间为3、5、5 分钟，最后移入囊胚微滴中进行形态学观察。 5 激光辅助孵出： 解冻 d2.5 天胚胎，将胚胎放置在 HEPES 液中，在卵周间 隙较大的透明带部位 3 点钟位置行激光光束打孔。打孔后培养到 d5 天，观 察囊胚孵出情况。 结 果 ： 1IVF 实验室装修完成 3 个月，平均受精率 84.0%，平均卵裂率 96.2%，平均 优质胚胎率 97.3%，平均囊胚形成率 96.1%，平均囊胚孵出率 93.1% ；IVF II 硕士学位论文 实验室装修完成 1 年，平均受精率 87.4%，平均卵裂率 92.8
7、%,平均优质胚 胎率 98.7%，平均囊胚形成率 97.4%，平均囊胚孵出率 93.3% 。 2 玻璃化冷冻/解冻及辅助孵出：IVF 实验室装修完成 3 个月，优质胚胎率 94.1%，囊胚发育率 94.1%，孵出率为 100%；IVF 实验室装修完成 1 年， 优质胚胎率为 100%,囊胚发育率为 100%，孵出率为 100%。 结 论： 1VOCs 是 IVF 实验室环境污染的主要成分，主要来源于 IVF 实验室装修 材料。IVF 实验室装修 3 月与 1 年鼠胚体外发生试验结果比较，在受精率、 卵裂率、优质胚胎率、囊胚率及孵出率未发现明显差异，进一步说明使用 环保标准高的装修材料，减少化工
8、材料的使用，可有效降低 IVF 实验室 VOCs 的含量，为配子及胚胎的体外培养及发育提供一个安全、无毒的培 养环境，对 IVF 结局意义重大。 2 玻璃化冷冻/解冻及激光辅助孵出技术有利于提高胚胎冻存复苏后优质胚 胎率和激光打孔后胚胎孵出率。 关键词 ： VOCs， IVF 实验室装修材料， 玻璃化冷冻， 激光辅助孵出， 鼠胚试验 III 鼠胚体外发生试验及IVF 实验室装修材料的应用 Mouse Embryo Experiment in Vitro and the Influence of the Decoration Materials of IVF Laboratory Abstrac
9、t people are still puzlled by the low of the fertilization rate,cleavage rate,blastocyst rate and clinic pregnancy in the field of assiste reproduction technology. Chemical pollution of the IVF laboratory is considered as the important reason. Chemical pollution mainly comes from discharge of the vo
10、latile organic compounds VOCs .For the IVF laboratory,they come from equipments, painting, cement,floor and laminar flow. When we built the IVF laboratory,we use the chemical engineering materials at the least. In order to test the envriomental quality of the IVF laboratory,we carry out a series of
11、experiments about mouse embryo, including the experiments of ovarian stimulation,occurring of the gamete and embryo in vitro,vitri?cation for cryopreservation/thawing mouse embryo and assisted hatching . The fertilization, ratecleavage rate,blastocyst rate and clinic pregnancy of the experiment are
12、according with other experiments ，even are better than others.At the same time, we found that there are no significant difference between the two results of the 3 months and 1 year after IVF laboratory decoration, the P 0.05. The result point out through reducing the volume of the VOCs in IVF labora
13、tory, the fertilization rate, cleavage rate, blastocyst rate and clinic pregnancy are higher than befor. This is very important for clinical ending. Objective To test the environment of the new IVF laboratory is suitable for gamete and IV 硕士学位论文 embryo to culture and development in vitro. Methods 1）
14、Femal mouse is injected through intraperitoneal way by Pregnant Mare Serum Gonadotropin PMSG 10IU/1 mouse 0.1ml , on the first day at 5:00pm, Gonadotropin HCG 10IU/1 mouse 0.1ml is injected to femal mouse on the third day. After injection of HCG12-13h, the male mouses are sent to death,obtaining and
15、 making sperm capacitation.After injection of HCG13-14h,the femal mouses are sent to death,obainting ovums.Put ovums into the incubator,then put semen which have the capacitation to fertilization, into the cuiture-dish waiting for fertilization.Observing the situation of the fertilization after 4-6h
16、.，then observing cleavage rate,high-quality embryo rate , blastocyst rate for each 24h. 2 ）Obtaining 8-cell embryos: Pregnant Mare Serum Gonadotropin PMSG 10IU/1 mouse （0.1 ）is injected to female mouse through intraperitoneal way on the first day 12:00.Gonadotropin HCG 10IU/1 mouse （0.1 ）is injected
17、 to femal mouse on the third day.Putting femal and male mouses in the same cageon one and one on the same day of HCG .Inspecting bolt on the second morning,bolt picked is considered successful fetilization and mark d0.5. On the sixth day,femal mouses are sent to death ,then getting the embryos,marki
18、ng d2.5. 3 Vitrification: Moving the mouse embryos to vitrification solution1,keeping for about 5-7minutes ,later moving to vitrification solution2,and then loaded into the freezing containing rod,which would be throwed into liquid nitrogen. Adding thaw liquid 1 into 3001 dish,five-well plates is ad
19、ded by unfrozen liquid 2, 3, 4. Rod equipped with embryos is put into the unfrozen liquid 1, staying1 minute, quikly. Followed into the unfrozen liquid 2,3,4,respectively,for3,5,5 minutes.Finally moved into micro-droplets for blastocysts to be observed. Embryos thawed were placed iin HEPES solution.
20、 The part of 3 OAclock of zona is punched by laser beam at the larger gap around the zona.The embryos were V 鼠胚体外发生试验及IVF 实验室装修材料的应用 cultured for 5 days after punched,then observing the situation of the embryos. Result 1）The total cycles of fertilization in vitro is 10, the total number of the oocyt
21、es is 189. The result of the experiment of IVF laboratory decorationed 3 months later is 94 occytes, fertilization rate, cleavage rate, high-quality embryo rate, blastocyst formation rate and blastocyst hatching rate is 84.0%,96.2%,97.3%, 96.1%and 93.1%, respectively. The result of the experiment of
22、 IVF laboratory decorationed 1year later is 95 occytes, fertilization rate, cleavage rate, high-quality embryo rate, blastocyst formation rate and blastocyst hatching rate is 87.4%, 92.8%, 98.7%, 97.4%and 93.3%, respectively. 2 ）The result of the experiment of IVF laboratory decorationed 3 months la
23、ter is 17 embryos frozen, 17 embryos thawed, 16 high-quality embryos, 94.1% high-quality embryo rate, 94.1% blastocyst rate, 100%hatching rate. For the IVF laboratory decorationed 1 year later, the result is 21 embryos frozen, 21 embryos thawed, 21high-quality embryos, 100% high-quality embryo rate,
24、 100% blastocyst rate, 100% hatching rate. Conclusion 1）VOCs is the main component of the IVF laboratory s pollution, mainly coming from the decoration materials of the IVF laboratory. There are not obvious differences among fertilization rate, cleavage rate, high quality embryo rate, blastocryst ra
25、te and hatching rate, between 3 months and 1 year after IVF laboratory decorated. In further to manifest that the decoration materials with high environmental standards could effectively reduce the VOCs of IVF laboratory. Creating a safe and non-toxic culture environment for gemetes and embryos. It
26、is very important and significant for the outcomes of IVF. 2 ）Vitrification/ thawing and laser-assisted hatching technology is more effective compared with other methods. The methods can get better high quanlity embryo VI 硕士学位论文 rate after thawed and hatching rate after laser drilling. KEYWORDS : VO
27、Cs ; Materials of IVF laboratory ; Renovation ; Vitrification ; Assisted hatching by laser; Mouse embryo test VII 硕士学位论文 前 言 IVF 实验室环境质量的好坏主要取决于室内化工材料使用情况及化学污染 的程度，化学污染主要来源于挥发性有机化合物（volatile organic compounds ， VOCs ），有研究表明 VOCs 是室内空气污染的主要成分，而且严重超标1-2 。 WHO 定义VOCs 是一组沸点从50至260 、室温下饱和、蒸气压超过 133.322Pa
28、 的易挥发性化合物。主要包括：苯系物、有机氯化物、氟里昂系列、有机酮、 胺、醇、醚、酯、酸、甲醛和石油烃化物等，其中苯系物对人类健康的威胁最 为广泛，不容忽视3-4 。目前已确认的 900 多种室内化学物质和生物性物质中， VOCs 至少在 350 种以上，其中 20 多种具有致癌或致突变作用5 。VOCs 的来源 比较广泛，几乎所有的有机化工产品合成材料都会不同程度释放 VOCs 。VOCs 严重危害到人类的健康，经常暴露在 VOCs 环境下会引起头痛、恶心、呕吐、 乏力等症状，甚至引起鼻腔、口、咽、喉部癌、消化系统癌、肺癌、皮肤癌和 6-7 。VOCs 对人体的影响已有很多文献报道，但目前
29、对人类体外胚胎 白血病等 的影响研究报道较少。有研究报道孕期或怀孕前半年内进行过装修，且闻到异 味的时间在 3 个月以上，可显著增加自然流产率甚至可致基 因突变和染色体 8 异常 。 早期很多学者通过鼠胚、鸡胚或其它动物胚胎的器官、组织或细胞来观察 VOCs 对其的影响，但畸形胚胎的发生是致畸原与胚胎整体间发生的复杂过程， 单一胚胎器官、组织或细胞并不能代表胚胎整体的情况。近年通过体外全胚胎 培养的方式研究致畸原与畸形胚胎发生情况。体外全胚胎培养的方式摒弃了体 内胚胎研究的缺陷，可以观察致畸原对胚胎畸形的直接致畸情况，避免了体内 胚胎研究的干扰因素。全胚胎培养用于致畸研究有其独特的优越性： 1
30、 全胚胎 培养是将哺乳动物的整个胚胎从母体移至体外进行短期培养，由于这种方法在 体外培养过程中仍保持胎盘和胚胎各系统、器官、组织间的相互正常关系，所 9 以更能真实地反映致畸原对胚胎生长发育的影响 。 2 可以排除致畸物在母体内 代谢因素及母体对化学物敏感性差异的影响，可以精确控制实验条件。 3 使用 1 鼠胚体外发生试验及IVF 实验室装修材料的应用 的受试物剂量小。 4 由于胚胎培养处于器官形成的关键时期，对致畸物作用相 当敏感且由于培养期短，能较快得到实验结果。 5 全胚胎培养使得能够动态全 面地观察胚胎的体外发育情况10 。 6 可同时测定多个参数，包括生存率 无明显 损伤、有规律的心
31、跳、卵黄囊血液循环的建立等 、形态学指标 卵黄囊直径、 头长、颅臀长、体节数及其他器官发育等 及姐妹染色单体交换数及基因表达产 物的活性等。 7 培养期间，致畸原所致的损伤不能修复，更有利于发现化学物 质所引起的胚胎毒性的潜能。 8 可作为一种预筛检手段，在用体内方法评价化 学物致畸性之前，对较多的受试物进行初检，以发现可疑致畸物，然后再用体 11 内方法检测，这样可减轻传统动物实验的负担 。 全胚胎培养方法是辅助生殖技术的一项里程碑，促进了辅助生殖技术的快 速发展。动物实验研究这中，啮齿类动物全胚胎体外培养研究发展迅速。胚胎 体外培养需要特殊的培养环境，环境质量直接关系到胚胎的生存和发育12
32、-13 。 IVF 实验室是具备这种特殊环境的实验室，为人类配子及胚胎体外发育提供适合 其体外发育的大环境，IVF 实验室的空气质量受到很多因素的影响。随着辅助生 殖技术的发展，IVF 实验室空气污染问题日益受到重视。IVF 实验室室内的空气 污染成分包括挥发性气体、CO2 中的杂质气体，以及一次性用品与实验室清洗、 消毒用品所释放的气体，这些气体都可能对胚胎产生影响14-15 。在胚胎发育初 期 ，胚胎对室内环境的影响极为敏感 ，此时环境的各种有害因素都可导致胚 胎的损伤甚至丢失16 。其中 VOCs 对实验室空气的影响不容忽视，也是近年研 究的热点。有研究证明 VOCs 其中的多聚联苯 P
33、CB153 ，对鼠胚生长发育、组织 17 器官形态分化及胚胎毒性均有影响，且剂量与结果呈正相关性 。 有研究用模拟高浓度 VOCs 的室内环境，观察对鼠胚的影响，结果表明高 浓度的 VOCs 可导致胚胎平均头长及干重明显低于对照组，且有畸胎出现，提 示 VOCs 可引起胚胎发育迟缓及潜在的胚胎毒性和致畸性18 。啮齿类动物卵黄 囊有重要作用的一层胚胎外膜，具有吞噬、消化、分泌、合成及造血功能19-20， 在胚胎发育的早期，卵黄囊是胚胎获取蛋白、氨基酸等营养物质的主要场所， 2 硕士学位论文 是提供胚胎生长发育所需各种营养物的唯一功能性胎盘21 。可见在胚胎发育早 期任何对卵黄囊结构和功能的损害
34、均可导致胚胎的发育迟缓、畸形甚至死亡。 同时IVF 实验室 pH 及温度对胚胎体外发育的影响也是至关重要的，Susan 等22 报道卵细胞暴露于室温 10 m in 有一半卵细胞发生纺锤丝崩解，30 m in 后全部崩 解， 并且 60% 出现染色体的分散现象，即使复温 1 4 h 后也不逆转。可见对 胚胎进行操作及观察时使其保持在恒温状态，对胚胎的体外发育十分重要。有 研究报道12，在改善 IVF 实验室空气质量的基础上，体外操作及观察胚胎时， 始终保证胚胎在 37、 5% CO2 的局部环境中，临床妊娠率及种植率都有明显 提高。 IVF 实验室环境中VOCs 的主要来源为室内装修材料及可能
35、排放VOCs 的设 备和器材，如地板、涂料及粘合剂，这些建筑材料使用不当都在一定程度上挥 发 VOCs ，对IVF 实验室环境造成污染，影响配子及胚胎的体外发育，因此应该 从源头上减少 VOCs 的排放，不使用或减少使用化工材料，优化实验室环境。 人类辅助生殖技术不断发展，临床妊娠率却维持在一定的水平，没有明显 的提高，为得到更高的受精率、卵裂率及临床妊娠率，在提高临床技术水平的 同时，对配子及胚胎的体外发育环境提出了更高的要求。各生殖中心都竭力采 取各项措施改善实验室的空气质量，为配子及胚胎提供一个无毒、安全的培养 环境，以期得到较高的受精率、卵裂率及临床妊娠率。在提高实验室空气质量 方面也
36、做了很大工作，主要在装修材料及实验设备的选择上，尽量选用天然的、 环保标准高的装修材料及低释放 VOCs 的实验室设备。IVF 实验室的温度及湿度 也会对配子及胚胎产生影响，多项研究结果表明高温对哺乳类胚胎存在致畸作 23-25 用 。 超数排卵是指应用外源促性腺激素促进动物的卵泡发育，使其排出更多卵的 方法。随着胚胎工程、基因工程的兴起和发展，超数排卵愈来愈受到人们的重 视。超数排卵可以利用最少的动物资源获得较多的卵子或胚胎。哺乳动物的卵 巢在动物出生时已含有成千上万的原始卵母细胞，但在动物整个生命期间，自 3 鼠胚体外发生试验及IVF 实验室装修材料的应用 然排卵所排出的卵是相当少的，绝大
37、多数的原始卵母细胞都发生了退化。为了 获得更多的可供试验用的配子和胚胎，超数排卵显得十分重要。 体外受精 - 胚胎移植及其衍生技术的不断发展 ,配子及胚胎冷冻技术已常 规应用于人类辅助生殖领域。所谓冷冻保存就是将体外培养物悬浮在已加或不 加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速度降至零度一下某一温度（低于-70 的超低温或-196的液氮溶液中）在此温度下长期保存的过程。慢速冷冻法采用 程控冷冻仪分阶段缓慢降温，在冷冻过程中需要人工诱导结晶，该方法耗时长， 费用昂贵。玻璃化冷冻是利用体积微小的冷冻承载工具，在极快速降温（ 2 000/min ）过程中，使高浓度的冷冻保护液由液态转变为黏度很高的类似玻璃 样的固态，避免
